一种糖肽或糖蛋白富集材料及其制备和应用的制作方法

本发明涉及一种基于酰肼策略的糖链可释放糖基化肽段/糖蛋白富集材料及其制备方法，以及其在糖蛋白质组学中的应用。

背景技术：

蛋白质的糖基化是生物体内最重要、最常见的翻译后修饰之一，与细胞粘附、信号转导、细胞凋亡、免疫应答等生物学过程及生理机能密切相关(rudd,etal.science2001,291,2376-2378)。糖蛋白作为重要的生物标志物，目前已被广泛应用于疾病的诊断、预警和药效评价(overath,etal.mol.cell.proteomics2012,11,467-477)。鉴于糖基化修饰在生命活动中的重要意义，糖基化蛋白质组学作为蛋白质组学的一个重要分支，也受到越来越广泛的关注。但糖基化蛋白质组研究对象复杂：糖蛋白翻译后修饰种类繁多、丰度低，质谱响应信号差。当前解决这一问题的重要途径是发展新型功能材料以实现糖基化蛋白质高选择性富集。

酰肼化学法是利用高碘酸氧化糖蛋白或糖肽糖链上的顺式邻二羟基后产生的醛基与含有酰肼基团的固相颗粒结合，从而实现对糖基化蛋白质/肽段的特异性富集。主要包括(1)氧化，糖链上的顺式邻二羟基在高碘酸盐作用下被氧化生成醛基；(2)偶联，生成的醛基与基质材料上的酰肼基团反应形成共价腙键，从而实现糖蛋白/糖肽的特异性捕获；(3)洗脱，先洗脱掉体系中未发生共价结合的蛋白质或肽段，再经过糖苷酶处理释放出糖基化的蛋白质或肽段进而进行下一步的质谱分析。酰肼化学法对糖链不存在歧视效应，共价结合的方式富集效率高，在高通量的糖基化位点尤其是n-型糖基化位点鉴定中，得到了很好的应用。但由于缺乏合适的糖苷酶，酰肼方法不适用于o-型糖基化位点的鉴定。

针对上述问题，我们设计了一种糖链可释放糖基化肽段/蛋白富集材料。本发明提供的富集材料易于制备，富集选择性好，能广泛适用于n-糖基化和o-糖基化肽段/蛋白的富集，在糖蛋白质组学等领域有很强的实用价值。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明目的在于提供一种基于酰肼策略的糖链可释放糖基化肽段/蛋白富集材料及其制备方法。该富集材料不仅可以实现广泛的n-糖基化和o-糖基化肽段/蛋白的富集，而且制备方法简单普适，容易实现。为了实现该目的，本发明的技术方案是：

1、巯基微球颗粒的制备：对于硅胶颗粒，加硅球于反应容器，分散于甲苯溶剂中，超声分散均匀，加入硅烷化试剂，通氮气0-50分钟，机械搅拌，保持转速300rad/min，加热回流6-30小时，停止反应后，冷却至室温，使用高速离心机用2500～10000rad/min的速度离心3-5分钟，弃上清液，固体颗粒依次使用甲苯、丙酮、甲醇抽滤洗涤，重复抽滤洗涤3-5遍，50℃真空干燥箱内真空干燥6-30小时，得到带巯基的硅胶颗粒。

其中，硅烷化试剂为含有巯基的硅烷化试剂。硅胶颗粒占总质量的0.02～0.25wt％，单体的总摩尔数浓度为0.04～1mol/l，余量为反应溶剂。

对于表面带有醛基的聚合物颗粒，分散于5-100mm,ph5-9的磷酸盐缓冲液中，震荡分散均匀，加入1-10mg/ml的氰基硼氢化钠，加入带有巯基或者二硫键基团的氨基试剂，20-60℃震荡反应5-30h；使用高速离心机用2500～10000rad/min的速度离心3-5分钟，弃上清液，固体颗粒依次使用水，tris-hcl重复洗涤2～5遍，室温下在真空干燥箱中至恒重；对于表面带有环氧的聚合物颗粒，分散在100-2000mm的naoh溶液中，震荡分散均匀，加入带有巯基或者二硫键基团的氨基试剂，在30-60℃震荡反应5-30h；用高速离心机用2500～10000rad/min的速度离心3-5分钟，弃上清液，固体颗粒依次使用水，tris-hcl重复洗涤2～5遍，室温下在真空干燥箱中至恒重；如若加入的是带有二硫键基团的氨基试剂，干燥后重新分散在ph5.0-9.0的缓冲溶液中，加入还原试剂，在30-60℃震荡反应0.5-3h,断裂二硫键生成巯基微球，之后用使用水洗涤2～5遍，在真空干燥箱中至恒重。

其中，聚合物颗粒与氨基试剂的加入量质量比为1:0.01至1:0.2，所使用还原剂的摩尔浓度为加入的量为10-1000m。

2、酰肼微球的制备：将得到的巯基微球颗粒分散于ph5.0-9.0的缓冲溶液中，超声分散均匀，加入带有二硫键的酰肼化合物，在20-60℃震荡反应4-48小时；之后使用高速离心机用3000～10000rad/min的速度离心，去除上清液，依次使用反应溶剂、水、醋酸钠洗涤微球，重复洗涤2～5遍，在真空干燥箱中至恒重即得糖链可释放的糖基化肽段/蛋白富集材料。

其中，所用的酰肼化合物加入量与微球加入质量比为1:0.1-1:10。

3、糖肽/糖蛋白的捕获和释放：将得到的酰肼微球用于糖肽、糖蛋白的富集，捕获到糖肽、糖蛋白之后，3000～10000rad/min的速度离心去上清，之后依次用nacl,80％acn,ph6.0-9.0的缓冲溶液清洗微球，之后将微球重新分散在ph6.0-9.0的缓冲溶液中，加入还原试剂，在30-60℃震荡反应0.5-30h,释放糖链，3000～10000rad/min的速度离心弃微球，上清液中加入碘乙酰胺封闭巯基，即得到富集后的糖肽/糖蛋白。

本发明具有如下优点：

1、制备简单，反应效率高，反应条件温和；

2、颗粒分散性好；

3、所制备富集材料应用范围广，可广泛应用于n-糖基化和o-糖基化肽段/蛋白的富集。

附图说明

图1、为实施例1中巯基化聚合物球的制备流程图；

图2、为实施例3中酰肼微球的制备流程图；

图3、基于酰肼策略的糖链可释放糖基化肽段/蛋白富集材料的糖肽富集效果图,a图为未经过富集处理的igg蛋白酶解产物原溶液，b图为富集产物。

具体实施方式

实施例1

巯基化聚合物球的制备：在5ml的离心管中，加入2ml磷酸盐缓冲溶液pb(50mm,ph8)，加入30μg粒径为10μm的表面带有醛基的聚苯乙烯颗粒，超声分散均匀，加入200mgcd(2,2’-二硫代二乙胺),10mg氰基硼氢化钠，30℃恒温振荡器反应24h，停止反应。高速离心机3000rad/min的速度离心，去除上清液，依次使用水，ph8的tris-hcl缓冲液重复洗涤4遍，50℃真空干燥箱内真空干燥24小时，重新分散在磷酸盐缓冲溶液pb(50mm,ph8)中，加入0.1mg三(2-羧乙基)膦(tcep)，在40℃震荡反应1h，高速离心机3000rad/min的速度离心，去除上清液，之后用使用水洗涤3遍，在真空干燥箱中至恒重。得到修饰了巯基的聚合物颗粒。制备过程如图1所示。

实施例2

巯基化硅球的制备：在150ml的圆底烧瓶中，加入50ml甲苯，加入2.5g粒径为5μm的硅胶颗粒,1ml的3-巯丙基三乙氧基硅烷，超声2分钟分散均匀，在烧瓶上接冷凝管，机械搅拌，保持300rad/min速度。反应装置放在油浴锅中，110℃加热回流15h，停止反应，冷却至室温。高速离心机3000rad/min的速度离心，去除上清液，依次使用甲苯、丙酮、甲醇、丙酮抽滤洗涤，重复抽滤洗涤3遍洗三遍，50℃真空干燥箱内真空干燥16小时，得到修饰了巯基的硅胶颗粒。

实施例3

酰肼微球的制备：将实施例1中得到的巯基微球颗粒25mg分散于ph7.8的pb缓冲溶液中，超声分散均匀，加入10mgpdph(3-(2-pyridyldithio)propionylhydrazide)，超声分散，在30℃震荡反应16小时；之后用高速离心机用3500rad/min的速度离心5min，去除上清液，依次使用反应溶剂、水、50mm醋酸钠洗涤微球，重复洗涤3遍，在真空干燥箱中至恒重，即得到了糖链可释放的糖基化肽段/蛋白富集材料。制备过程如图2所示。

实施例4

将实施例3中所制备的酰肼材料用于n型糖肽富集：将糖蛋白(免疫球蛋白g，igg)经过trypsin酶解，高碘酸氧化，除盐冻干备用，将实施例3中得到的酰肼微球10mg分散于1ml,ph5.5,100mmnaac中，加入2μg上述igg,25℃震荡过夜，3000～10000rad/min的速度离心去上清，之后依次用1mnacl,80％acn,ph8的pb缓冲溶液清洗微球，之后将微球重新分散在ph8的pb缓冲溶液中，加入20μl,1mtcep，在40℃震荡反应1h，5000rad/min的速度离心弃微球，上清液中加入20μl,1m碘乙酰胺封闭巯基，即得到富集后的糖肽。再加入0.5μlpngasef酶，37℃，反应14h，除盐冻干得到去除糖链后的肽段，将酶解产物原液和富集产物进行maldi-tofms鉴定进行maldi-tofms鉴定。

将1μl待上述待分析物与1μldhb基质(20mg/ml2,5-二羟基苯甲酸溶于含1％三氟乙酸的60％乙腈溶液)依次点于maldi靶板上，待样品点干燥后进行质谱鉴定。

如图3所示，a图为未经过富集处理的igg蛋白酶解产物原溶液，b图为富集产物。如图3a所示，在igg蛋白酶解产物溶液中没有鉴定到igg的糖肽，经富集之后(图3b)鉴定到igg的两条去除糖链后的肽段；且无非糖肽的非特异吸附。表明材料具有较好的糖肽富集能力。