一种硅胶色谱填料、制备方法及其应用与流程

本发明涉及高效液相色谱填充材料，具体涉及一种硅胶色谱填料、制备方法及其应用。

背景技术：

乳糖(lactose)是一种双糖，由一分子β-D-半乳糖和一分子α-D-葡萄糖在β-1,4-位形成糖苷键相连，分子式为C12H22O11，相对分子质量为342.3。乳糖有两种端基异构体：α-乳糖和β-乳糖，在水溶液中可互相转化。α-乳糖很容易结合一分子结晶水。乳糖作为一种药用辅料，以填充剂或稀释剂的形式广泛应用于片剂、胶囊、颗粒剂和冻干产品中。目前，市场上有方法采用氢型糖柱或钙型糖柱进行乳糖等糖类目标物的分离，虽然氢型糖柱或钙型糖柱稳定性优于氨基色谱柱，但是该类型色谱柱的选择性有限，其对糖类目标物的分离选择性不如氨基色谱柱，因而现行的国家标准，如2015版《中华人民共和国药典》仍然推荐氨基色谱柱测定方法作为标准测定方法。然而在实际检测过程中发现，采用市面上普通氨基键合硅胶色谱填料进行该项目的测定时，经常会遇到以下问题：(1)柱效达不到所规定的16500块/m理论塔板数；(2)蔗糖和乳糖不能达到基线分离；(3)乳糖峰面积的RSD值不能满足2.0％以下，无法对其进行准确定量。

为了解决上述问题，近年来研制出了一些新型的氨基色谱填料。中国专利CN 201310090809.3和中国专利CN 200610015584.5分别采用多氨基基团硅烷化试剂、酰胺基硅烷化试剂和硅胶反应制备了新型氨基键合硅胶色谱填料。这些新型氨基色谱填料可通过次级胺和酰胺等基团的“静电屏蔽”作用减弱硅胶表面残余硅羟基与乳糖目标物之间的相互作用，并增强填料在高比例水相流动相中的稳定性。但是，这类具有“静电屏蔽”作用的新型氨基色谱填料也存在一定的缺点，主要表现在分离乳糖过程中柱效低、峰面积的重复性不够理想、并且对乳糖色谱峰的基线噪音大，从而影响对乳糖定量的准确性。

综上所述，亟需研制一种新的硅胶色谱填料，以解决现有技术中乳糖分离和含量测定存在的诸多问题。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种用于乳糖分离与含量测定的硅胶色谱填料及其制备方法，采用该硅胶色谱填料能够解决传统氨基色谱柱对乳糖进行含量测定时存在的柱效低、峰面积不稳定及基线噪音大等问题，具有良好的重现性和稳定性。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种硅胶色谱填料，包括：硅胶及键合于所述硅胶表面的有机硅烷，所述有机硅烷包括氨丙基硅烷和其它硅烷，其中：

所述氨丙基硅烷的化学结构通式为：

其中，R¹为C2～4的烷基，R²为C2～4的烷基或C1～2的烷氧基，X¹为反应活性基团，优选为氯、甲氧基或乙氧基。

根据本发明的一个实施方式，所述其它硅烷的化学结构通式为：

其中，R³、R⁴选自C1～4的烷基，X²为反应活性基团，优选为氯、甲氧基或乙氧基；n为2～8的整数。

根据本发明的一个实施方式，所述其它硅烷选自1,2-二(甲氧基硅基)己烷、1,2-二(乙氧基硅基)己烷、1,2-二(乙氧基硅基)戊烷、1,2-二(乙氧基硅基)戊烷、1,2-二(甲氧基硅基)丁烷、1,2-二(乙氧基硅基)丁烷、1,2-二(甲氧基硅基)丙烷、1,2-二(乙氧基硅基)丙烷、1,2-二(乙氧基硅基)乙烷、1,2-二(乙氧基硅基)乙烷、1,2-二(三甲氧基硅基)丙烷、1,2-二(甲氧基硅基)甲烷和1,2-二(三甲氧基硅基)甲烷中的一种或多种。

根据本发明的一个实施方式，所述氨丙基硅烷选自3-氨丙基二异丙基乙氧基硅烷、3-氨丙基异丙基二乙氧基硅烷、3-氨丙基二乙基乙氧基硅烷、3-氨丙基乙基二乙氧基硅烷、3-氨丙基异丙基甲基乙氧基硅烷、3-氨丙基异丙基乙基乙氧基硅烷、3-氨丙基二异丙基甲氧基硅烷、3-氨丙基异丙基二甲氧基硅烷、3-氨丙基二异丙基氯硅烷和3-氨丙基异丙基二氯硅烷中的一种或多种。

本发明还提供一种制备上述硅胶色谱填料的方法，包括如下步骤：

将硅胶活化预处理，得到表面具有硅羟基的活化硅胶；

所述活化硅胶与所述其它硅烷在有机溶剂中进行搅拌回流反应，将所述其它硅烷键合在所述活化硅胶的表面，得到含有机-无机杂化硅胶的溶液；及

向所述溶液加入所述氨丙基硅烷进行搅拌回流反应，将所述氨丙基硅烷键合在所述有机-无机杂化硅胶的表面，得到所述硅胶色谱填料。

根据本发明的一个实施方式，所述活化硅胶的表面的硅羟基与所述其它硅烷的摩尔比为1:(0.3～1.2)。

根据本发明的一个实施方式，所述活化硅胶的表面的硅羟基与所述氨丙基硅烷的摩尔比为1:(0.3～1.2)。

根据本发明的一个实施方式，所述硅胶的质量与有机溶剂的体积比为1:(4～10)g/ml。

根据本发明的一个实施方式，所述硅胶的粒径为3～10μm，孔径为比表面积为180～400m²/g。

本发明还提供上述硅胶色谱填料在乳糖分离中的应用。

根据上述技术方案的描述可知，本发明的有益效果在于：

1.本发明所述的“其它硅烷”是指除氨丙基硅烷以外的其它种类的有机硅烷。通过在硅胶表面先键合这类有机硅烷，硅胶基质能够很容易修饰为有机-无机杂化结构的硅胶，从而减弱氨基基团的水解，使得氨基键合的该硅胶色谱填料具有较好的稳定性；

2.通过向硅胶表面键合的氨丙基硅烷引入具有空间位阻效应的烷基官能团，可确保硅胶表面的残余硅羟基被极大程度的屏蔽，克服了硅羟基和乳糖之间的“非特异性保留”作用，从而在用于乳糖分离时，可使得乳糖具有极为优异的峰型、较高的柱效以及稳定的峰面积；

3.本发明提供的硅胶色谱填料所装填的色谱柱，按照《2015版中华人民共和国药典》的要求对乳糖进行测定，能够完全解决传统的氨基色谱柱存在的柱效不高、峰面积不稳定以及基线噪音大等问题。且该硅胶色谱填料的制备方法具有制备方法简单、稳定性好、重现性好以及易于规模化生产等优点。

附图说明

图1为实施例1制备硅胶色谱填料的方法示意图；

图2为实施例1制备的硅胶色谱填料和1号氨基色谱填料分离分析乳糖色谱图；

图3为实施例1制备的硅胶色谱填料和2号氨基色谱填料分离分析乳糖色谱图；

图4为实施例1所制备的硅胶色谱填料分离和分析乳糖重复性色谱图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实施例说明本发明的实施方式，本领域普通技术人员可由本说明书所公开的内容轻易地了解本发明的优点及功效。本发明也可通过其它不同的实施方式加以施行或应用，本说明书中的各项细节也可基于不同观点与应用，在不悖离本发明所公开的构思下赋予不同的修饰与变更。此外，本发明所有范围和值都包含及可合并的。落在本发明中所述的范围内的任何数值或点，例如任何整数都可以作为最小值或最大值以导出下位范围等。

本发明提供一种硅胶色谱填料，包括：硅胶及键合于所述硅胶表面的有机硅烷，所述有机硅烷包括氨丙基硅烷和其它硅烷，其中：所述氨丙基硅烷的化学结构通式为：

其中，R¹为C2～4的烷基，R²为C2～4的烷基或C1～2的烷氧基，X¹为反应活性基团(即离去基团)，优选为氯、甲氧基或乙氧基。

本发明所述的“其它硅烷”是指除氨丙基硅烷以外的其它种类的有机硅烷。通过在硅胶表面先键合这类有机硅烷，硅胶基质能够很容易修饰为有机-无机杂化结构的硅胶，从而减弱氨基基团的水解，使得氨基键合的该硅胶色谱填料具有较好的稳定性；同时，通过对氨丙基硅烷引入具有空间位阻效应的烷基官能团，能够屏蔽硅胶基质表面大量未反应的硅羟基，极大程度克服了硅羟基和乳糖之间的“非特异性保留”作用，从而使得乳糖具有极为优异的峰型、较高的柱效以及稳定的峰面积；通过位阻效应也可减弱氨基基团的水解，使得氨基键合硅胶色谱填料进一步具有较好的稳定性。该硅胶基质表面的化学修饰除了进行有机-无机杂化修饰和氨丙基硅烷键合修饰以外，并不需要像传统的氨基键合的硅胶色谱填料一样需要对其进行端基封端处理。

在本发明的一个实施方式中，所述其它硅烷的化学结构通式为：

其中，R³、R⁴选自C1～4的烷基，X²为反应活性基团(即离去基团)，优选为氯、甲氧基或乙氧基；n为2～8的整数。进一步地，该有机硅烷包括但不限于1,2-二(甲氧基硅基)己烷、1,2-二(乙氧基硅基)己烷、1,2-二(乙氧基硅基)戊烷、1,2-二(乙氧基硅基)戊烷、1,2-二(甲氧基硅基)丁烷、1,2-二(乙氧基硅基)丁烷、1,2-二(甲氧基硅基)丙烷、1,2-二(乙氧基硅基)丙烷、1,2-二(乙氧基硅基)乙烷、1,2-二(乙氧基硅基)乙烷、1,2-二(三甲氧基硅基)丙烷、1,2-二(甲氧基硅基)甲烷和1,2-二(三甲氧基硅基)甲烷中的一种或多种。

在本发明的一个实施方式中，所述氨丙基硅烷包括但不限于3-氨丙基二异丙基乙氧基硅烷、3-氨丙基异丙基二乙氧基硅烷、3-氨丙基二乙基乙氧基硅烷、3-氨丙基乙基二乙氧基硅烷、3-氨丙基异丙基甲基乙氧基硅烷、或3-氨丙基异丙基乙基乙氧基硅烷、3-氨丙基二异丙基甲氧基硅烷、3-氨丙基异丙基二甲氧基硅烷、3-氨丙基二异丙基氯硅烷和3-氨丙基异丙基二氯硅烷中的一种或多种。

本发明还提供上述硅胶色谱填料的制备方法，包括如下步骤：

将硅胶活化预处理，得到表面具有硅羟基的活化硅胶；

所述活化硅胶与所述其它硅烷在有机溶剂中进行搅拌回流反应，将所述其它硅烷键合于所述活化硅胶的表面，得到含有机-无机杂化硅胶的溶液；及

向所述溶液中加入氨丙基硅烷进行搅拌回流反应，将所述氨丙基硅烷键合于所述有机-无机杂化硅胶的表面，得到所述硅胶色谱填料。

具体地，所述硅胶优选为全多孔球形硅胶，进一步优选为超高纯度全多孔球形色谱用硅胶。供活化用的原料硅胶的粒径优选为3～10μm，孔径优选为比表面积优选为180～400m²/g。

在本发明的一个实施方式中，所述硅胶活化预处理的过程包括：向所述的硅胶中加入质量浓度为0.04～0.08％的氢氟酸水溶液，回流反应制得所述的活化硅胶；所述硅胶的质量与氢氟酸水溶液的体积之比优选为1：(8～10)。进一步优选地，硅胶与氢氟酸水溶液在搅拌加热回流的方式下反应22～24小时，之后在减压抽滤的方式下进行过滤，将硅胶与氢氟酸水溶液分离，并用超纯水(二次蒸馏水)清洗硅胶，以去除其表面残留的氢氟酸，直至用于清洗的水溶液呈中性，于90～110℃真空干燥至恒重，制得活化硅胶。

在本发明的一个实施方式中，所述硅胶色谱填料的制备方法中，向含有机-无机杂化硅胶的溶液中加入氨丙基硅烷进行搅拌回流反应后，还包括将回流反应完成后的产物过滤，并依次用甲苯、四氢呋喃/水、甲醇以及乙腈洗涤，制得所述硅胶色谱填料。具体地，将回流反应完成后容器的溶液冷却至有机溶剂的回流温度以下，减压条件下过滤，依次用甲苯、四氢呋喃/水、甲醇以及乙腈洗涤。优选地，所得的固体产品在90～200℃温度下真空干燥12小时以上，即制得填料。进一步地优选，上述的四氢呋喃/水的体积比可以为8：2。所使用甲苯、四氢呋喃/水、甲醇以及乙腈的温度为40～80℃。

在本发明的一个实施方式中，活化硅胶表面的硅羟基与有机硅烷的摩尔比为1:(0.3～1.2)。

在本发明的一个实施方式中，活化硅胶表面的硅羟基与氨丙基硅烷的摩尔比为1:(0.3～1.2)。

在本发明的一个实施方式中，所述的原料硅胶的质量与有机溶剂的体积之比优选为1:(4～10)g/ml。

在本发明的一个实施方式中，所述的有机溶剂优选为非极性溶剂，例如甲苯、二甲苯、正己烷或正庚烷。

在本发明的一个实施方式中，所述回流反应优选为在80～150℃下搅拌回流反应22～48小时。

在本发明的一个实施方式中，通过上述方法制备的硅胶色谱填料，可以作为新型氨基键合的硅胶色谱填料用于分离乳糖。

下面通过具体实施例说明：

实施例1硅胶色谱填料的制备

图1为实施例1制备硅胶色谱填料的方法示意图。具体制备方法包括如下步骤：

(1)往2L玻璃材质反应容器中加入100g硅胶(5μm,购于日本DAISO公司)，并加入1000mL蒸馏水搅拌30分钟、过滤，重复该步骤两次。然后加入1000mL质量比为0.08％氢氟酸水溶液，搅拌24小时后用蒸馏水清洗至中性，最后加入1000mL丙酮洗涤、过滤，110℃干燥12小时，得到活化硅胶A；

(2)向玻璃材质反应容器中加入“步骤(1)”中制备的活化硅胶A，并加入800mL干燥的无水甲苯溶剂，于170转/分钟搅拌均匀后加入50.0g1,2-二(三甲氧基硅基)丙烷B，使用电加热套加热至110℃，搅拌回流反应24小时，得到含有机-无机杂化硅胶C的溶液，其中该有机-无机杂化硅胶C仍含有部分未反应的活性羟基；

(3)向步骤(2)反应结束后的溶液中加入50.0g3-氨丙基二异丙基乙氧基硅烷D，使用电加热套加热至110℃，搅拌回流反应24小时，得到含有键合上3-氨丙基二异丙基乙氧基硅烷D的有机-无机杂化硅胶E的溶液：

(4)反应结束后，关掉电热套，待玻璃材质反应容器溶剂温度冷却至60℃左右，使用减压滤斗进行过滤，然后依次用甲苯、四氢呋喃/水溶液(v/v＝8/2)、甲醇、乙腈进行洗涤，产物在110℃真空干燥12小时即得硅胶色谱填料。

其中，双层微球结构代表与1,2-二(三甲氧基硅基)丙烷反应后获得的有机-无机杂化硅胶。需注意的是，结构C的双层结构仅示意用于区分结构关系，不代表外层有机层完全包覆硅胶；结构E仅示意为氨丙基硅烷键合于该有机-无机杂化硅胶上，而不用于限制键合接枝的数量和位置关系。

实施例2硅胶色谱填料的制备

(1)往2L玻璃材质反应容器中加入100g硅胶(5μm,购于日本DAISO公司)，并加入1000mL蒸馏水搅拌30分钟、过滤，重复该步骤两次。然后加入1000mL质量比为0.08％氢氟酸水溶液，搅拌24小时后用蒸馏水清洗至中性，最后加入1000mL丙酮洗涤、过滤，110℃干燥12小时，得到经活化硅胶；

(2)向玻璃材质反应容器中加入“步骤(1)”中制备的活化硅胶，并加入800mL干燥的无水甲苯溶剂，于170转/分钟搅拌均匀后加入50.0g 1,2-二(甲氧基硅基)丁烷，使用电加热套加热至110℃，搅拌回流反应24小时，得到含有机-无机杂化硅胶的溶液，其中该有机-无机杂化硅胶仍含有部分未反应的活性羟基；

(3)向步骤(2)反应结束后的溶液中加入50.0g3-氨丙基异丙基二乙氧基硅烷，使用电加热套加热至110℃，搅拌回流反应24小时，得到含有键合上3-氨丙基异丙基二乙氧基硅烷的有机-无机杂化硅胶的溶液；

(4)反应结束后，关掉电热套，待玻璃材质反应容器溶剂温度冷却至60℃左右，使用减压滤斗进行过滤，然后依次用甲苯、四氢呋喃/水溶液(v/v＝8/2)、甲醇、乙腈进行洗涤，产物在110℃真空干燥12小时即得硅胶色谱填料。

实施例3硅胶色谱填料的制备

(1)往2L玻璃材质反应容器中加入100g硅胶(5μm,购于日本DAISO公司)，并加入1000mL蒸馏水搅拌30分钟、过滤，重复该步骤两次。然后加入1000mL质量比为0.08％氢氟酸水溶液，搅拌24小时后用蒸馏水清洗至中性，最后加入1000mL丙酮洗涤、过滤，110℃干燥12小时，得到活化硅胶；

(2)向玻璃材质反应容器中加入“步骤(1)”中制备的活化硅胶，并加入800mL干燥的无水甲苯溶剂，于170转/分钟搅拌均匀后加入50.0g1,2-二(甲氧基硅基)乙烷，使用电加热套加热至110℃，搅拌回流反应24小时，得到含有机-无机杂化硅胶的溶液，其中该有机-无机杂化硅胶仍含有部分未反应的活性羟基；

(3)向步骤(2)反应结束后的溶液中加入50.0g3-氨丙基乙基二乙氧基硅烷，使用电加热套加热至110℃，搅拌回流反应24小时，得到含有键合上3-氨丙基乙基二乙氧基硅烷的有机-无机杂化硅胶的溶液；

(4)反应结束后，关掉电热套，待玻璃材质反应容器溶剂温度冷却至60℃左右，使用减压滤斗进行过滤，然后依次用甲苯、四氢呋喃/水溶液(v/v＝8/2)、甲醇、乙腈进行洗涤，产物在110℃真空干燥12小时即得硅胶色谱填料。

实施例4乳糖的分离与分析

将实施例1制备的硅胶色谱填料进行装柱，柱长300mm，柱内径4.6mm。装柱条件如下：装柱压力3000-7000psi，匀浆剂：乙腈和异丙醇，料液比为1:10，最后用甲醇顶替30min。以乙腈：水(70:30,v/v)溶液作为分离的流动相，流动相的流速为1.0mL/min，色谱柱温度为45℃，示差折光检测器温度为40℃，分离的对象为常用的药用辅料乳糖。分离效果如图2所示。

图2是实施例1制备的硅胶色谱填料分离分析乳糖和1号氨基色谱填料分离分析乳糖的色谱图。其中所述的“1号氨基色谱柱”填装的填料采用的是不具有位阻效应的3-氨丙基三乙氧基硅烷硅烷化试剂和不具有有机-无机杂化硅结构的普通硅胶反应的得到传统的氨基色谱填料。横坐标是保留时间，单位为min，纵坐标是检测信号的响应值，单位为nRIU(示差折光单位的十亿分之一)。

如图2所示，1a～1c代表1号氨基色谱柱重复进样3针色谱效果。1d～1f分别为实施例1所制备的硅胶色谱填料重复进样3针色谱效果。由图1的测定结果可知，使用1号氨基色谱柱进行样品中乳糖和蔗糖的测定时，对乳糖和蔗糖混合对照品溶液进行连续3次进样，发现乳糖峰面积的相对标准偏差(RSD)为2.72％，大于2015版《中华人民共和国药典》规定的2.0％；而使用实施例1分离乳糖用硅胶填料测定时，连续进样3针发现乳糖峰面积的RSD为0.86％，小于2015版《中华人民共和国药典》规定的2.0％，满足2015版《中华人民共和国药典》要求。

图3是实施例1制备的硅胶色谱填料分离分析乳糖和2号氨基色谱填料分离分析乳糖的色谱图。其中所述的“2号氨基色谱柱”填装的填料采用的是具有位阻效应的3-氨丙基二异丙基乙氧基硅烷和不具有有机-无机杂化结构的硅胶反应的得到的氨基色谱填料。横坐标是保留时间，单位为min，纵坐标是检测信号的响应值，单位为nRIU(示差折光单位的十亿分之一)。

如图3所示，1a～1c代表2号氨基色谱柱重复进样3针色谱效果。1d～1f分别为实施例1所制备的硅胶色谱填料重复进样3针色谱效果。由图3的测定结果可知，使用2号氨基色谱柱进行样品中乳糖和蔗糖的测定时，对乳糖和蔗糖混合对照品溶液进行连续3次进样，发现乳糖峰面积的相对标准偏差(RSD)为1.14％，不如实施例1中制备的氨基色谱填料的测定效果。

图4为实施例1制备的硅胶色谱填料进样200针以后的乳糖效果图，由图4可知，该色谱填料经过200针测定后，其峰型良好，柱效未有明显的下降。

将上述各实施例制备的硅胶色谱填料装填色谱柱，按照《2015版中华人民共和国药典》的要求对乳糖分别进行测定，均能够解决传统的氨基色谱柱存在的柱效不高、峰面积不稳定、基线噪音大等问题。本发明提供的制备方法具有制备方法简单、稳定性好、重现性好以及易于规模化生产等优点。

上述实施例仅为例示性说明，而非用于限制本发明。任何本领域普通技术人员均可在不违背本发明的构思及范畴下，对上述实施例进行修饰与改变。因此，本发明的权利保护范围是由本发明所附的权利要求书所定义，只要不影响本发明的效果及实施目的，应涵盖于此公开技术内容中。