两性离子修饰的亲水碳球及其制备和在糖肽富集中的应用的制作方法

本发明具体涉及一种两性离子修饰的亲水碳球的制备，该亲水碳球可用于生命健康领域中的糖肽富集。

背景技术：

蛋白质糖基化是最重要的翻译后修饰之一，根据swiss-prot数据库的记录和预测，这种修饰发生在超过一半的人类蛋白质上(文献1.a.bairochet.al“theswiss-protproteinsequencedatabankanditssupplementtrembl”,1999)。糖蛋白已被证明参与到许多重要的细胞活动和疾病过程，例如细胞通讯，信号传导和细胞粘附。更重要的是，许多糖蛋白已被认为是临床研究中的生物标志物和治疗靶点(文献2.y.tianet.al“solid-phaseextractionofn-linkedglycopeptides”,《natureprotocols》,2007，2，334)。因此，蛋白质糖基化的研究在生命科学领域中具有一定的地位，对疾病的诊断和治疗有重要的指导意义。目前蛋白质组学研究策略主要有两种，即自上而下的以完整蛋白质为分析对象的top-down策略和从下至上的以分析肽段为对象的bottom-up策略。相对于完整蛋白质，肽段更容易实现色谱分离、离子化和多级质谱碎裂，因而目前bottom-up策略应用较为普遍，技术也相对更加成熟，基于此，肽段信息成为了蛋白质组学的重要突破口。糖蛋白质组学研究主要集中在糖蛋白，糖基化位点，糖链结构，糖链组成以及糖基化对蛋白质功能的影响这几个方面。然而，由于：(1)生物样品复杂度高，有许多高丰度蛋白存在，糖肽的百分比仅占2％～5％(文献3.g.alvarez-manillaet.al“toolsforglycoproteomicanalysis:sizeexclusionchromatographyfacilitatesidentificationoftrypticglycopeptideswithn-linkedglycosylationsites”,《journalofproteomeresearch》,2006，5：701-708)。(2)与非糖肽相比，糖链的存在大大降低了糖肽的电离效率，这两种原因造成了极低的糖肽信号，使得蛋白质酶解液中糖肽的直接分析成为一个巨大的挑战。因此，质谱分析前糖肽的富集对于糖蛋白质组学研究具有重要意义。目前，凝集素法、酰肼化学法、硼酸法和亲水相互作用色谱法等多种方法已被广泛应用于生物样品中糖肽的富集。其中，亲水相互作用色谱法由于具有通量高、对不同糖肽的歧视效应小和重现性好等优点吸引了越来越多的研究人员的关注(文献4.j.yaoet.al“recentadvancesinmesoporousmaterialsforsamplepreparationinproteomicsresearch”，《tractrendsinanalyticalchemistry》，2018，99，88-100)。他们通过引入更多亲水基团如羧基，氨基，羟基和两性离子基团等，开发出许多亲水性材料，通过亲水-亲水相互作用捕获亲水性糖肽。其中,大部分两性离子亲水材料以二氧化硅为基质，制备过程复杂，耗时长并且涉及有毒的有机试剂。例如，应用最广泛的zic-hilic-spe的合成步骤非常复杂，共需要50多个小时。因此，开发出一种制备过程简单的糖肽富集材料是必要的。与碳材料和有机化合物的传统改性方法相比(通常需要800℃以上的苛刻条件)，水热碳化工艺是一种反应条件温和，通用，简便的功能化方法，功能化碳材料只需一步即可制得，且反应温度在180℃左右即可。本发明以廉价易得且绿色环保的葡萄糖为碳源，以2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱(mpc)为功能化试剂提供两性离子，采用水热法合成亲水性的碳球(命名为htc-glc-mpc)，并将其应用于标准糖蛋白igg酶解液和复杂生物样品血清酶解液的糖蛋白质组学分析。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种两性离子亲水碳球的制备方法，可采用亲水作用色谱法将该碳球应用于糖肽富集。该两性离子亲水碳球结构示意如下，

为实现上述目的，本发明采用的技术方案具体包括如下内容：

配制含有葡萄糖和2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱的水溶液，将混合溶液加入到内含聚四氟乙烯衬管的反应釜中，加热得到两性离子亲水性碳球。

上述反应中葡萄糖的质量百分数为5～10g/ml，2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱的质量百分数为1～10g/ml。

所述加热温度为160～200℃，反应时间为5～10小时。

本发明的有益效果

1.本发明制备了一种表面带有两性离子基团的碳球，亲水性好，制备得到的亲水碳球可以应用于蛋白质组学中糖肽的富集。

2.本发明所制备得到的亲水碳球通过水热反应制得，反应过程只需要一步，相对于已经开发出的亲水性糖肽富集材料而言，不需要高温，大量的有机试剂和繁琐的操作步骤，制备过程简单可控且以水作溶剂，绿色环保。

3.本发明以生物质葡萄糖作为碳基质的原料，来源广泛且成本低廉。

4.本发明制备得到的亲水碳球的功能基团是磷酸胆碱型两性离子官能团，与肽段间的离子相互作用小，特异性好。

附图说明

图1htc-glc-mpc的制备示意图。

图2htc-glc-mpc的(a)氦离子显微镜形貌图，(b)静态水接触角。图2(a)显示本发明所得材料为粒径在200nm左右的碳球，图2(b)显示本发明所得碳球的静态水接触角为26.6°，表明该材料的亲水性极好。

图3(a)mpc，(b)htc-glc，(c)htc-glc-mpc的红外谱图。在htc-glc和htc-glc-mpc中位于1700cm^-1和1620cm^-1的两个峰分别属于c＝o和c＝c的伸缩振动，表明水热反应中葡萄糖发生了芳构化。与htc-glc相比，我们可以看到mpc和htc-glc-mpc中位于1240cm^-1和1080cm^-1的两个峰，分别属于p＝o和-poch2-的伸缩振动，此外，位于1170cm^-1和970cm^-1的两个峰分别属于c-n和n⁺(ch3)3的伸缩振动，这些峰均未在htc-glc中出现，表明了两性离子官能团成功接枝到碳球上。

图4htc-glc-mpc在不同ph值下的zeta电势图。不同ph值的溶液通过在水中加0.1mol/l的hcl或0.1mol/l的naoh制得。材料的浓度为0.1g/l。由于两性离子的存在，碳球的zeta电势随着ph的不同而变化。

图5150fmoligg酶解液(a)直接分析,(b)经过htc-glc-mpc富集后和(c)经过亲水碳球富集并切糖后的maldi-tofms谱图。

图6血清酶解液经htc-glc-mpc富集后鉴定到的(a)蛋白数目和(b)糖肽数目。

具体实施方案

实施例1

(1)两性离子亲水碳球的制备

将0.25g葡萄糖和0.25g两性离子单体2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱溶于2.5ml水中，将混合溶液加入到10ml装有聚四氟乙烯内衬管的反应釜中，180℃加热6小时，得到的产物(htc-glc-mpc)依次用水和乙醇洗涤至上清液无色，于60℃下真空干燥12小时后备用。

对照组不加两性离子单体2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱，直接将相同浓度的葡萄糖溶液采用相同的方法进行水热反应，产物(htc-glc)采用上述相同的洗涤与干燥方法。反应机理大致如下：水热过程中葡萄糖脱水碳化并聚合，产生以呋喃环为基本结构单元的碳球，之后与两性离子单体发生环加成反应得到表面修饰两性离子官能团的亲水碳球。

表1htc-glc-mpc的元素分析结果。htc-glc-mpc中氮元素和磷元素的存在表明两性离子官能团成功接枝到碳球上。

表1

(2)将亲水碳球用于igg酶解液中糖肽的富集

具体过程如下：称取5mghtc-glc-mpc，用400μl现配的acn/h2o/tfa(85/14/1,v/v/v)上样液平衡3次，每次20分钟。将9μgigg酶解液用400μl上样液稀释并加入到该材料中，室温震荡1h。离心，除去上清液。然后用400μl上样液洗涤材料3次，每次10分钟，以除去非糖肽。接着加入200μl洗脱液震荡40分钟后离心，取0.5μl上清液用maldi-tof/ms分析或冻干后复溶在60μl含0.5μlpngasef酶的10mmnh4hco3溶液中，37℃酶切18h后冻干，复溶后取0.5μl用maldi-tof/ms分析。

表2igg酶解液经htc-glc-mpc富集检测到的糖肽的分子量，肽段和糖链信息。

表2

其中，150fmoligg酶解液在直接检测时(图5a)糖肽信号很低且非糖肽干扰很大，经亲水碳球富集后(图5b，表2)可以检测到26条糖肽且非糖肽的背景干扰几乎全部消除。酶切后(图5c)，只剩下m/z＝1158和1190的两条峰，进一步验证了富集得到的肽段均为糖肽。

(3)将亲水碳球用于血清酶解液中糖肽的富集

具体过程如下：称取10mghtc-glc-mpc，用400μl现配制的acn/h2o/tfa(85/14/1,v/v/v)上样液平衡3次，每次20分钟。然后将2μl血清酶解液用400μl上样液稀释并加入到该材料中，室温震荡1h。离心，除去上清液。然后用400μl上样液洗涤材料3次，每次10分钟，以除去非糖肽。接着加入200μl洗脱液震荡40分钟，两次洗脱后离心，冻干，加入400μl含0.5μlpngasef酶的10mmnh4hco3溶液，37℃酶切18h，以除去糖基片段。最后去糖基化肽段采用lc-ms/ms进行分析。

表3血清酶解液经htc-glc-mpc富集检测到的糖肽的分子量，肽段和糖链信息。

表3

其中，三次重复实验共检测到属于92种糖蛋白的172种糖基化位点和285种糖肽且重复性非常好(图6，表3)。