制造由围绕中心核的交联水凝胶外壳制成的胶囊的方法与流程

本发明涉及一种用于制造胶囊的方法，所述胶囊由围绕中心核的交联水凝胶外壳形成，所述中心核可以是液体。更具体地说，本发明涉及一种用于囊封目标组合物以形成胶囊的制造方法，其中所述目标组合物的性质得以保留。

背景技术：

近年来，已经开发出囊封方法来制造由包含中心组合物的外壳组成的胶囊，所述中心组合物通常是液体。这样的胶囊特别用于药物和化妆品领域。所述中心组合物含有保护其免受外部损害的活性剂，并且其释放能够更好地被控制。

通常，胶囊是通过将用于在交联后形成外壳的水凝胶溶液与要囊封的目标组合物同心共挤出而获得的。在挤出机的出口处，获得混合液滴，其由围绕目标组合物液滴的水凝胶溶液层组成。所述混合液滴然后落入包含交联剂的浴中，在其中发生水凝胶层的交联。

然而，当混合液滴从挤出机落到交联浴中时和/或当混合液滴与交联浴碰撞时，常常观察到混合液滴的破裂。水凝胶外层在冲击力的作用下部分或完全破裂，导致目标组合物的液滴与交联前的水凝胶液体层部分混合，或者甚至在水凝胶交联期间目标组合物的液滴被向混合液滴的外部驱逐。此外，所回收的胶囊不具有规则的形状或大小和/或受控的拓扑结构。

结果，常常需要向水凝胶溶液中添加表面活性剂，以防止混合液滴在与交联浴碰撞时破裂。表面活性剂可能与胶囊的内容物接触并改变其性质。因此，当胶囊含有活性剂或细胞时，这可能具有显著的负面后果，例如降低活性剂的效力或导致细胞死亡。类似地，当胶囊含有农业食品组合物时，该组合物的感官特性可能通过与表面活性剂的相互作用而改变。

另外，交联剂的浓度必须高，以使液滴在碰撞时结构冻结。结果，交联剂在交联期间穿过水凝胶溶液层并渗透到胶囊内部。除与表面活性剂相互作用外，交联剂与胶囊内部的接触也可能改变其内容物的性质。

这些交联剂和表面活性剂也可能对人体有刺激性。因此，特别是取决于胶囊的预期用途，有时需要进行彻底的清洗步骤以从表面和/或胶囊内除去所有痕量的交联剂和/或表面活性剂。这些清洗步骤显著降低了这种胶囊的产量并增加了制造成本。

因此，需要一种用于制造含有目标组合物、特别是液体组合物的水凝胶胶囊的方法，所述方法使得能够以高产量获得具有受控形状和结构的胶囊，而没有过多的成本。

技术实现要素：

针对这些问题，本发明人发现，在胶囊碰撞接收其的回收浴之前，可以使围绕目标组合物液滴的水凝胶层至少部分地交联。围绕目标组合物液滴的水凝胶的这种预交联防止了胶囊破裂的风险。另外，还降低了胶囊内容物与交联剂和/或可能存在的表面活性剂接触的风险。为了使得能够实现这种早期交联，本发明人开发了一种方法，其中常规地通过水凝胶溶液和目标组合物的共挤出获得的混合液滴穿过由包含交联剂的微粒(液体或固体)形成的气溶胶。在所述混合液滴穿过所述气溶胶下落期间，所述微粒结合在混合液滴的表面上，并使得水凝胶至少部分交联。有利的是，水凝胶的最外层是交联的，在目标组合物的液滴周围形成刚性或半刚性的壳。相反，通过喷射进行的喷雾或成雾将有利于交联剂的微粒渗透到混合液滴的内部，从而导致水凝胶外层与形成混合液滴的核的目标组合物液滴混合，从而改变混合液滴的结构。与通过喷射进行的喷雾相反，使用薄雾或气溶胶(其中微粒悬浮在空气中)促进了交联剂薄层在整个混合液滴周围的沉积，从而导致水凝胶层的表面的至少一部分发生交联。这样的方法有利地使得可以免除使用表面活性剂，这对于制造含有细胞的胶囊可能特别有利。必要时，如果交联不充分，则可以在交联浴中继续进行。根据本发明，水凝胶的预交联层在胶囊落下后与接收胶囊的液体碰撞时保护胶囊。此外，当这些胶囊浸入交联浴中时，即使预交联层很薄，其存在也足以保护胶囊的结构并防止其变形。此外，能够减少在任何交联浴中的浸渍时间，并且还能够减少后续清洗步骤。

因此，本发明涉及一种用于制造多个胶囊的方法，每个胶囊包含围绕中心核的交联水凝胶外壳，其中将水凝胶溶液和被设计用于形成中心核的目标水性组合物同心共挤出以形成混合液滴，每个液滴包含围绕目标组合物液滴的水凝胶溶液层，其特征在于，共挤出步骤在交联气溶胶上方进行以使得混合液滴通过所述交联气溶胶，使得水凝胶溶液层在与所述气溶胶接触时围绕目标组合物液滴至少部分地交联。

本发明还涉及可通过这种方法获得的胶囊，其中水凝胶层的外表面带有与由碰撞引起的表面不规则形式的与交联气溶胶接触的痕迹。因此，这样的胶囊的特征在于围绕由目标组合物液滴组成的中心核的交联水凝胶外层，其中所述水凝胶层的外表面是蜂窝状的，即被蜂窝覆盖。

本发明还涉及如上所述的胶囊，其中中心核包含细胞，所述细胞由包囊引起的超额死亡率小于20％，优选小于10％。

发明详述

根据本发明的方法的特征在于，借助于交联的气溶胶使围绕中心核的水凝胶层至少部分地交联的步骤，所述交联气溶胶的微粒结合在水凝胶层的表面上。

具体地，在挤出机出口处形成的混合液滴通过挤出流向着接收表面投射并穿过布置在挤出机出口与接收表面之间的气溶胶。

接收表面是指胶囊在穿过交联气溶胶后落在其上或落入其中的元件。在一个实施方式中，接收表面由回收浴组成，该回收浴任选地包含交联溶液。

根据本发明，可以使用用于将水凝胶溶液和目标组合物同心共挤出的任何挤出方法。特别是，可以通过修改alessandri等人(pnas,2013年9月10日,第110卷,第37期,14843-14848；芯片实验室(labonachip),2016,第16卷,第9期,第1593-1604页)或onoe等人(自然材料(natmaterial)2013,12(6):584-90)中所述的方法和微流体装置来制备混合液滴，使得溶液在交联气溶胶上方共挤出。例如，根据本发明的方法通过如专利fr2986165中所述的具有双或三个同心壳的挤出装置进行。

根据本发明，“混合液滴”是指在挤出机出口处获得的液滴，借助于该挤出机将外围水凝胶溶液和目标中心组合物以同心方式共挤出。由此，混合液滴由围绕目标组合物液滴的一层非交联水凝胶溶液组成。“目标组合物液滴”被定义为小体积的目标组合物，其可以是液体、溶液、胶体或悬浮液，例如凝胶、乳膏等。通常，目标组合物有利地是水性的。由此，它可以是液体形式的水性组合物、凝胶、乳膏等。在凝胶形式的目标组合物的情况下，所述凝胶有利地不同于用于形成混合液滴外层的水凝胶。优选地，目标组合物不包含藻酸盐，更一般地不包含可交联的化合物。

相反，“胶囊”是指在水凝胶层至少部分地交联后由混合液滴得到的产物。因此，所述胶囊由水凝胶外壳组成，该水凝胶外壳通过围绕目标组合物液滴交联而至少部分地硬化。

混合液滴例如胶囊有利地是球形的。

在本发明的上下文中，“交联水凝胶外壳”是指由聚合物链的基质形成的三维结构，所述聚合物链被液体、优选被水溶胀。这种交联水凝胶外壳是通过使水凝胶溶液交联而获得的。有利地，水凝胶溶液中的一种或多种聚合物是当经受例如温度、ph、离子等的刺激时可交联的聚合物。有利地，所用的水凝胶溶液是生物相容性的，意味着它对细胞无毒。如果要囊封的目标组合物包含细胞，则水凝胶层有利地使得氧气和营养物以及二氧化碳和代谢废物能够扩散，以饲养细胞并使其存活。水凝胶溶液中的聚合物可以是天然或合成来源的。例如，水凝胶溶液含有以下中的一种或多种聚合物：磺酸盐类聚合物(例如聚苯乙烯磺酸钠)，丙烯酸盐类聚合物(例如聚丙烯酸钠、聚乙二醇二丙烯酸酯)，化合物明胶甲基丙烯酸酯，多糖(包括细菌来源的多糖例如结冷胶，或植物来源的多糖例如果胶或藻酸盐)。

在一个实施方式中，所述水凝胶溶液至少包含藻酸盐。优选地，水凝胶溶液仅包含藻酸盐。在本发明的上下文中，“藻酸盐”是指由β-d-甘露糖醛酸酯(m)和α-l-古洛糖醛酸酯(g)、其盐和衍生物形成的线性多糖。有利地，藻酸盐是藻酸钠，其由大于80％的g和小于20％的m组成，平均分子量为100至400kda(例如：slg100)并且以密度计总浓度为0.5％至5％(重量/体积)。

根据本发明，交联气溶胶包含至少一种交联剂，当与其接触时，该交联剂适于使包含至少一种亲水性聚合物例如藻酸盐的水凝胶交联。优选地，交联气溶胶不含表面活性剂。

在一个实施方式中，交联气溶胶由交联溶液的微滴形成。可以通过常规用于从液体溶液形成气溶胶的任何方式，特别是膜弥雾机获得这种气溶胶。在另一个实施方式中，交联气溶胶由交联剂的固体微粒组成，例如呈碳酸盐和/或氯化钙微粉的形式。

交联溶液有利地含有至少一种二价阳离子。交联溶液也可以是包含待交联的藻酸盐或亲水性聚合物的其它已知交联剂或适于通过辐射或通过本领域已知的任何其它技术进行交联的溶剂(例如水或醇)的溶液。有利地，交联溶液是包含至少一种二价阳离子的溶液。优选地，所述二价阳离子是能够使藻酸盐能够在溶液中交联的阳离子。它可以是例如选自ca²⁺、mg²⁺、ba²⁺和sr²⁺的二价阳离子，或这些二价阳离子中的至少两种的混合物。二价阳离子例如ca²⁺可以与平衡离子组合以形成例如cacl2或caco3类型的溶液，这是本领域技术人员众所周知的。交联溶液也可以是包含caco3和葡萄糖酸δ-内酯(gdl)的溶液，形成caco3-gdl溶液。交联溶液也可以是caco3-caso4-gdl的混合物。在根据本发明的方法的一个特定的实施方式中，交联气溶胶由包含钙，特别是ca²⁺形式的钙的交联溶液的微滴组成。本领域技术人员能够将二价阳离子和/或平衡离子的性质以及其浓度针对本发明方法的其它参数，特别是所用聚合物的性质以及所需的交联速度和/或程度进行调节。例如，交联溶液中二价阳离子的浓度在10至1000mm之间。所述交联溶液可以包含除上述那些之外的本领域技术人员众所周知的其它组分，以便改善水凝胶鞘在特定条件(特别是特定时间和/或温度)下的交联。

有利地，交联气溶胶由交联溶液的微滴形成，所述微滴的直径有利地在0.5至20μm之间，优选在1至10μm之间，更优选等于5μm±2μm。

在一个实施方式中，交联溶液的微滴或形成气溶胶的固体微粒的下落速度低于混合液滴通过挤出流投射穿过交联气溶胶的速度。优选地，交联溶液的微滴或形成气溶胶的固体微粒静态地悬浮在空气中。在一个实施方式中，混合液滴利用重力下落穿过交联气溶胶，并且混合液滴穿过交联气溶胶的下落速度高于交联微滴或固体微粒的下落速度。

在一个实施方式中，交联溶液的微滴的气溶胶具有每cm³3×10³个微滴的密度。

有利地，将交联溶液的微滴的气溶胶体积保持在外罩中，该外罩的尺寸适于保持所需的气溶胶密度和/或浓度。这种容纳进一步使所述气溶胶能够保持无菌。

交联溶液的微滴结合在混合液滴的表面上，优选均匀地结合，以便促进水凝胶层在所述混合液滴的整个表面上至少部分地交联。例如，直径为50至500μm的每个混合液滴被交联溶液的至少100个微滴包围，然后到达所述表面从而以胶囊形式接收至少部分交联的混合液滴。本领域技术人员能够调节液滴的高度、气溶胶中的微滴的密度和/或气溶胶的流速，以便根据其表面在每个混合液滴周围获得一层微滴。滴落高度定义为混合液滴在挤出机出口与呈胶囊形式的所述至少部分交联的混合液滴的接收表面之间穿过气溶胶行进的距离。

在一个特定的示例性实施方式中，使用交联溶液的微滴的气溶胶，其密度为每cm³3×10³个微滴，所述气溶胶以20l/h的流速在直径约20cm的外罩内喷雾，通过将其与周围空气隔离，可以保持气溶胶的足够密度，同时使气溶胶中混合液滴的下落高度保持为60cm。

在一个特定的实施方式中，交联溶液的微滴带电，使得它们彼此排斥，从而促进了微滴在气溶胶中的电分散。例如，这能够通过在以气溶胶形式喷雾或成雾之前向交联溶液施加直流电来实现。

替代地或另外地，使混合液滴，更特别是水凝胶溶液层带电。以这种方式，当混合液滴穿过交联气溶胶时，它们分散在更大的横截面半径中。这通过增加可用于交联的气溶胶的体积，降低了所需的下落高度。实际上，通过与前一个混合液滴相同的轨迹的混合液滴遇到更少的交联微滴。此外，这还降低了混合液滴在飞行中和在碰撞时发生团聚/熔化的风险。

在交联溶液的微滴和混合液滴带电的情况下，电荷有利地相反，从而有利于微滴在混合液滴的表面周围的沉积。

在一个实施方式中，交联气溶胶的同渗浓度或渗透浓度是形成胶囊中心核的目标组合物的渗透浓度的0.1至10倍。优选地，交联气溶胶的同渗浓度或渗透浓度是形成胶囊中心核的目标组合物的渗透浓度的0.3至3倍。在另一个实施方式中，交联气溶胶和形成胶囊中心核的目标组合物是等渗的，即具有基本上相等的渗透浓度。例如，在目标组合物是细胞组合物的情况下，交联气溶胶由100mm钙溶液形成。通常，交联气溶胶不应该是高渗的，以避免由渗透压导致的混合液滴变形并保持胶囊的结构。

根据本发明，可以在回收浴中接收穿过交联气溶胶之后的预硬化的胶囊。在这种情况下，所述回收浴优选与形成胶囊的中心核的目标组合物是等渗的。

在一个实施方式中，根据需要，回收浴可包含交联溶液以进一步使水凝胶交联。根据需要，这种交联溶液可以包含表面活性剂。否则，特别是在穿过交联气溶胶下落时水凝胶的交联足够的情况下，交联浴可以包含简单的盐溶液。

有利地，所述混合液滴不含表面活性剂。特别地，所述水凝胶组合物有利地不含表面活性剂。类似地，根据本发明的胶囊有利地在交联水凝胶层和中心核中均不含表面活性剂。

有利地，将水凝胶溶液和目标组合物共挤出以形成混合液滴，然后形成直径为50至500μm的球形胶囊。在一个特定的实施方式中，水凝胶外壳的厚度占胶囊半径的5％至40％。在本发明的上下文中，“厚度”是从胶囊的中心径向延伸的尺寸。本领域技术人员知道如何调节共挤出参数以获得这样的尺寸。

根据本发明，所述目标组合物是指能够与水凝胶溶液共挤出以形成含有一滴所述目标组合物的胶囊的任何组合物。有利地，所述目标组合物是液态、水性或胶凝化的组合物。在一个实施方式中，所述水性组合物是胶凝化的水性组合物。特别地，可以使用包含细胞的组合物、食品组合物、化妆品组合物或药物组合物。例如，目标组合物是蛋白质凝胶和/或细胞凝胶。

根据本发明，可以使用任何类型的细胞组合物。特别地，可以制造围绕人类多能干细胞的水凝胶胶囊。多能干细胞或多能细胞定义为能够形成整个起源生物体中存在的所有组织而本身又不能形成整个生物体的细胞。特别地，根据本发明的胶囊可以含有例如源自体细胞的诱导性多能干(ips)细胞。更一般来说，在本发明的上下文中，细胞组合物不包含源自人类胚胎的细胞。

在一个特定的实施方式中，水凝胶溶液是藻酸盐溶液(例如slg100)，用于形成中心核的目标组合物包含细胞(例如重悬在中的ips细胞)，并且交联气溶胶包含氯化钙水溶液的微滴。

具体实施方式

实施例1：制造含有人类多能细胞组合物的水凝胶胶囊的方案。

所用的溶液：

溶液1，添加了2μmthiazovivin的dmemf12基础培养基

溶液2，添加了1μmthiazovivin的不含镁和钙的pbs

溶液3，非酶促细胞脱离缓冲液：添加了2μmthiazovivin的relesr^tm。

溶液4，多能干细胞培养基：mtesr1^tmhes/hips细胞培养基stemcell^tm)。

溶液4+，添加了2μmthiazovivin的溶液4。

溶液5，matrigel^tm。

溶液6，含有2μmthiazovivin的300mm山梨糖醇。

细胞溶液：

然后使用90％汇合的人类ips细胞的25cm²培养皿来匹配所推荐的体积。所有后续步骤均在4℃下进行至挤出机出口。

步骤1：用溶液1清洗细胞。等待10分钟至1小时。

步骤2：用4ml溶液2清洗两次。

步骤3：轻柔地吸出溶液。

步骤4：将细胞与4ml溶液3温育5-10分钟。

步骤5：用宽尖端移液管来减少剪切应力，用2ml溶液4+使细胞脱离。

步骤6：将细胞悬浮液以360g离心5分钟。

步骤7：吸出上清液。

步骤8：用0.5ml溶液4+重悬。

步骤9：再次以360rcf离心并吸出上清液。

步骤10：将细胞沉淀团重悬于70μl溶液5和100μl溶液6中(沉淀团体积应为30μl)。细胞溶液已准备就绪。

囊封：

如alessandri等人,2016(“用于产生用于培养和分化人类神经元干细胞(hnsc)的功能化水凝胶微胶囊的3d打印微流体装置(a3dprintedmicrofluidicdeviceforproductionoffunctionalizedhydrogelmicrocapsulesforcultureanddifferentiationofhumanneuronalstemcells(hnsc)”,芯片实验室,2016,第16卷,第9期,第1593-1604页)中所述，准备囊封装置(挤出机)，其中进行两个修改：藻酸盐溶液中不存在表面活性剂，并且形成浴周围存在50cm高的外罩以容纳源自与交联浴(300mosmolcacl2)相同的溶液的雾化的气溶胶。

总之，对所述装置的不同部件进行灭菌(利用高压灭菌器)；将三种必需的溶液装载在三个注射器筒上：i)藻酸盐溶液(2质量％的在蒸馏水中)，ii)中间溶液(300mm山梨糖醇)，iii)细胞溶液(在先前步骤中制备)；使用微流体注射器以同心方式共注射所述三种溶液，所述微流体注射器使得能够形成射流，所述射流分解成外层是藻酸盐溶液并且核是细胞溶液的液滴；

为了使液滴电分散，用+2kv的直流电使藻酸盐带电。在与射流离开微流体注射器的轴线垂直的平面中，在距尖端2mm处放置直径2cm的接地环，以产生电场。

在射流分解以及液滴电分散后，它们穿过包含在外罩中的交联溶液的气溶胶(大约为每立方米气体约3×10⁹个液滴，每个液滴的直径为1至10μm并包含100mm的钙水溶液)。交联溶液的液滴结合在混合液滴表面上使它们的表面变硬，并使其在保持内部结构的同时渗入钙浴(回收/交联浴)中。将这些液滴收集在钙浴中(100mm)，该浴完成了藻酸盐溶液的交联以形成壳。

应注意，在这些囊封条件下，藻酸盐层的交联自发地发生。

囊封后的处理：

步骤1：将胶囊用40μm细胞筛收集，并且在用溶液1清洗后，将它们储存在含有20ml溶液4+的75cm²烧瓶中。

步骤2：将所述烧瓶在37℃和5％co2的培养箱中保持12小时。

步骤3：将培养基更换为溶液4以使得形成包囊。

步骤4：在24至72小时后，胶囊中形成几十个细胞的包囊。细胞微区室在5至10天后成熟。