一种茶渣可溶性膳食纤维重金属吸附剂的制备方法及其应用与流程

本发明涉及生物纤维吸附剂技术领域，具体涉及一种由茶渣发酵获得的纤维作为食品生产过程中使用的重金属吸附剂的制备方法，该茶渣发酵得到的纤维是经特别发酵改性，其中的膳食纤维中含有高含量的水溶性膳食纤维。

背景技术：

重金属原义是指比重大于5.0的金属元素，主要包括砷(as)、铜(cu)、汞(hg)、铅(pb)、镉(cd)等。重金属难以被微生物降解，却能在食物链的生物放大作用下富集，进入处于食物链末端的人类体内，而引起显著毒性效应。镉中毒会造成肾脏损伤，极少数严重的甚至还会造成骨骼病变；铅中毒会对神经、造血、消化、肾脏、心血管和内分泌等多个系统造成危害，引起儿童发育不良；铜是人体必须的微量元素，但是过多的摄入会对肝、肾造成危害，对儿童造成肝内胆汁酸淤积等症状。食品中重金属超标的情况屡禁不止，误食的情况时有发生，因此发明一种能缓解重金属在人体体内的富集的吸附剂很有必要的。

膳食纤维(dietaryfiber，df)，指不易被人体消化吸收的，以多糖类为主的大分子物质的统称，是国际上被高度认可的一种功能性食品基料，被称为继蛋白质、碳水化合物、维生素、油脂、无机盐和水之后的“第七大营养素”。根据其溶解特性，分为不溶性膳食纤维(insolubledietaryfiber，idf)和可溶性膳食纤维(solubledietaryfiber，sdf)，idf主要包括纤维素、部分半纤维素和木质素等，而sdf主要包括葡聚糖、果胶和海藻胶等。研究表明，idf和sdf表现出不同的功能，idf在食品中主要起填充作用，能够支持肠道菌群生长，增加粪便体积，促进肠道机械蠕动的功能；sdf能发挥代谢功能，具有胶凝、增稠和乳化作用，更重要的是具有高吸附能力。

茶渣，是茶饮料工厂茶叶深加工后的副产物，富含膳食纤维，尤其是idf含量能达到38％，但sdf含量较低。高压均质处理，能让原料茶渣变成更小的颗粒，打断其外部结构，从而释放sdf，提高其含量；微生物发酵处理，能够降解纤维素和半纤维素成为可溶性物质，从而提高sdf的含量和改善其生理功能。绿色木霉是高产纤维素酶的菌株之一，其具有菌体生长较快、产酶周期短等优点，因此应用很广泛。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种以茶渣为原料，经发酵制备得到一种具有高吸附重金属能力的可溶性膳食纤维的制备方法。

本发明的另一目的在于提供上述茶渣可溶性膳食纤维重金属吸附剂的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种茶渣可溶性膳食纤维重金属吸附剂的制备方法，包括如下具体步骤：

(1)取干燥后的茶渣进行机械粉碎，过100目标准筛，得到粗茶渣粉，备用；

(2)高压均质处理原料粗茶渣粉，获得改性茶渣原料，冷冻干燥，备用；

(3)在锥形瓶中，加入购买的pda39.0g、kh2po43.0g、mgso4·7h2o1.5g、硫胺素8mg，用超纯水定容至1000ml，在121℃下高压蒸汽灭菌30min，配制为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda培养基)；

(4)于超净工作台中，将绿色木霉菌种冻干管在酒精灯火焰上加热，滴加少许无菌水使之破裂，用镊子轻敲顶部，再滴加0.5ml的无菌水于管内，用移液枪吸取全部菌悬液接种到pda培养基中，28℃培养72～96h，经2～3次接代培养后，备用；

(5)在锥形瓶中，加入nano32.0g、k2hpo41.0g、kcl0.5g、mgso4·7h2o0.5g、feso40.01g、蔗糖30.0g、琼脂20.0g，用超纯水定容至1000ml，自然ph值，在121℃下高压蒸汽灭菌30min，配制为种子培养基，备用；

(6)于超净工作台中，利用无菌水冲洗步骤(4)得到的培养基，稀释至孢子浓度约为10⁷～10⁸cfu/ml，制备成为孢子液，接种孢子液5ml于装有50ml步骤(5)得到的种子培养基中，在转速150r/min，28℃的摇床中震荡培养72h，得到种子液；

(7)在锥形瓶中，加入k2hpo42.0g、mgso4·7h2o0.3g、cacl20.3g、cmc-na10g、蛋白胨0.5g、feso4·7h2o0.0015g、mnso4·h2o0.0016g、znso4·7h2o0.0015g、cocl2.6h2o0.002g，用超纯水定容至1000ml，加入改性茶渣(料液比为1：20)，调节ph值，在121℃下高压蒸汽灭菌30min，配制为发酵培养基，备用；

(8)于超净工作台中，按照一定的接种量加入步骤(6)的种子液到步骤(7)的发酵培养基中，在转速150r/min，28℃的摇床中震荡培养一定的时间；

(9)将步骤(8)中的发酵液取出，调节ph＝6.0，加入热稳定α-淀粉酶95℃下反应30min，调节ph到6.5后加入木瓜蛋白酶65℃下水解10min，沸水浴中10min灭酶活，离心取上清液，然后加入4倍体积95％乙醇醇沉，离心，冷冻干燥后保存，得到茶渣可溶性膳食纤维重金属吸附剂。

进一步，步骤(2)所述高压均质处理粗茶渣粉是指10质量份的茶渣、1000质量份的水充分混合，在压力40mpa，物料温度35℃下，高压均质机均质20min，重复两次。

进一步，步骤(4)所述的绿色木霉菌种购买自广东省微生物菌种保藏中心，编号是gim：3.597。

进一步，步骤(7)所述的发酵培养基的ph值为5.5。

进一步，步骤(8)所述种子液的接种量为10.5％，培养时间为43h。

进一步，步骤(9)所述的耐高温α-淀粉酶酶活为2.0×10⁵u/g，添加量为1％g/g(以加入的茶渣质量为基准)；木瓜蛋白酶酶活为5.0×10⁴u/g，添加量为1％g/g(以加入的茶渣质量为基准)。

本发明以茶渣为原料，优化发酵工艺，提高金属吸附能力强的茶渣水溶性膳食纤维的含量。

本发明还提供一种所述的茶渣可溶性膳食纤维吸附剂的应用，是在食品加工过程中将上述制得的茶渣可溶性膳食纤维吸附剂直接添加到食品中，用于吸附食品中包括镉、铅和铜在内超标的重金属。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

(1)采用本发明的膳食纤维提取方法，茶渣可溶性膳食纤维提取率显著提高到30.85％±0.47％，并且该方法操作简单，成本低廉。

(2)高压均质处理茶渣，能够导致半纤维素以及膳食纤维超分子集聚体的结构解离，再进行绿色木霉发酵处理改性后的茶渣，绿色木霉分散到结构已经被破坏的膳食纤维内部，产生协同作用使发酵过程更充分；并且得到的可溶性膳食纤维结构更加疏松，活性因子更多的暴露出来，更加有利于吸附重金属。

(3)本发明所得到的茶渣可溶性膳食纤维作为吸附剂直接添加到食品中，能够吸附食品中超标的重金属离子。

(4)本发明的原料是茶叶深加工的副产物，能够提高茶叶的附加值。

附图说明

图1为实施例1中发酵培养基的ph、发酵时间对可溶性膳食纤维提取含量的影响响应面图。

图2为实施例1中种子液的接种量、发酵初始ph对可溶性膳食纤维提取含量的影响响应面图。

图3为实施例1中种子液的接种量、发酵时间对可溶性膳食纤维提取含量的影响响应面图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例一

茶渣可溶性膳食纤维的发酵提取工艺，其具体步骤如下：

(1)原料粉碎：将干燥后的茶渣用粉碎机进行粉碎处理，过100目标准筛，得到粗茶渣粉。

(2)高压均质处理：在容器中，加入5l的超纯水，倒入500g粗茶渣粉，搅拌均匀，在压力40mpa，物料温度35℃下，均质20min，重复两次。高压均质后的原料进行冷冻干燥，收集为改性后的茶渣原料。

高压均质处理茶渣，能够导致半纤维素以及膳食纤维超分子集聚体的结构解离，从而提高茶渣可溶性膳食纤维(sdf)的含量并且使得其结构疏松。

(3)绿色木霉发酵工艺：

步骤一：在锥形瓶中，加入购买的pda39.0g、kh2po43.0g、mgso4@7h2o1.5g、硫胺素8mg，用超纯水定容至1000ml，在121℃下高压蒸汽灭菌30min，配制为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda培养基)。

步骤二：于超净工作台中，将购买的绿色木霉菌种冻干管(购买自广东省微生物菌种保藏中心，编号是gim：3.597)在酒精灯火焰上加热，滴加少许无菌水使之破裂，用镊子轻敲顶部，再滴加0.5ml的无菌水于管内，用移液枪吸取全部菌悬液接种到pda培养基中，28℃培养72～96h，经2～3次接代培养后，备用；

步骤三：在锥形瓶中，加入nano32.0g、k2hpo41.0g、kcl0.5g、mgso4·7h2o0.5g、feso40.01g、蔗糖30.0g、琼脂20.0g、用超纯水定容至1000ml，自然ph值，在121℃下高压蒸汽灭菌30min，配制为种子培养基，备用；

步骤四：于超净工作台中，利用无菌水冲洗步骤(4)得到的培养基，稀释至孢子浓度约为10⁷～10⁸cfu/ml，制备成为孢子液，接种孢子液5ml于装有50ml步骤(5)得到的种子培养基中，在转速150r/min，28℃的摇床中震荡培养72h，得到种子液；

步骤五：在锥形瓶中，加入k2hpo42.0g、mgso4·7h2o0.3g、cacl20.3g、cmc-na10g、蛋白胨0.5g、feso4·7h2o0.0015g、mnso4·h2o0.0016g、znso4·7h2o0.0015g、cocl2·6h2o0.002g，用超纯水定容至1000ml，加入改性茶渣(料液比为1∶20)，调节ph值，在121℃下高压蒸汽灭菌30min配制为发酵培养基，备用；

步骤六：于超净工作台中，按照一定的接种量加入步骤(6)的种子液到步骤(7)的发酵培养基中，在转速150r/min，28℃的摇床中震荡培养一定的时间。

(4)可溶性膳食纤维的提取：将步骤六中的发酵液取出，调节ph＝6.0，加入1％g/g(以加入的茶渣质量为基准)，热稳定α-淀粉酶95℃下反应30min，调节ph到6.5后加入0.05％g/g(以加入的茶渣质量为基准)，木瓜蛋白酶65℃下水解10min，沸水浴中10min灭酶活，离心取上清液，然后加入4倍体积95％乙醇醇沉，离心。

(5)干燥：离心后的可溶性膳食纤维冷冻干燥，得到茶渣可溶性膳食纤维吸附剂。

(6)茶渣可溶性膳食纤维的提取的优化处理：在单因素试验基础上，以可溶性膳食纤维含量作为指标，根据中心组合试验原理，采用design-expert.v8.0软件设计了三因素三水平响应面分析试验。通过软件计算，得到最佳条件为种子液接种量为10.5％(以发酵培养基的体积为基准)，发酵初始ph为5.5，发酵时间为43h。在此条件下，sdf的预测提取率为31.56％。为了验证模型的预测能力，使用所选择的最佳条件测试预测最佳响应值，测定结果是30.85％±0.47％，和预测值的偏差不大，表明实验结果可靠，具有一定的实际预测性。

实施例二

体外模拟肠道环境下的重金属吸附能力实验，其具体步骤如下：

(1)配制重金属溶液：分别配制镉(cd²⁺)、铅(pb²⁺)、铜(cu²⁺)的离子溶液，用naoh溶液调节ph＝7.0，且浓度都为500μmol/l。

(2)吸附实验：称取0.5g在最优发酵条件下制备的茶渣可溶性膳食，分别溶于20ml的上述镉、铅和铜的金属离子溶液中，于37℃，120r/min的摇床中振荡反应3h。取上清液1ml，加入4ml的无水乙醇，4000g离心10min后，取上清液，适当稀释，用aas方法测定重金属的浓度。

结果显示，高压均质处理原料后再进行发酵处理的茶渣可溶性膳食纤维对镉、铅和铜的吸附率分别是：98.60％，98.26％和97.46％，显示出很高的重金属吸附能力。