一种联合诊断纸基微流控芯片及制备方法与流程

本发明属于生物医学检测技术领域，涉及一种检测人全血样品的微流控芯片及制备方法。

背景技术：

免疫层析法(immuno-chromatography)是近几年来国外兴起的一种快速诊断技术。其原理是建立在层析技术和抗原-抗体特异性免疫反应基础上的一种免疫检测技术，其以固定有检测线(t线)和质控线(c线)的条状纤维层材料为固定相，待测物为流动相，通过毛细作用使待测物在层析条上移动，待测物在t线出发生特异性免疫反应，游离物在c线处发生反应。近年来，荧光技术的快速发展推动着荧光免疫层析技术不断向前突破，针对常见方法的不足，推动新型检测方法快速发展。

目前在实际诊断应用中，一般是采用单独一种指标进行诊断，诊断结果往往不够准确。例如，在自身免疫疾病的炎症性疾病(如红斑狼疮、反应性关节炎和炎症性肠病)活动期间，c反应蛋白(crp)与降钙素原(pct)是临床诊断炎症反应的一个常用指标。如果仅测定pct含量，会发现其与正常人的含量没有明显差异；但是如果测定crp时，crp含量明显高于正常人。因此需要结合这两种指标的结果，才能最终确定病人是否有炎症反应。但是，目前还缺少一种能够同时检测crp、pct等多个指标的临床手段。

crp与pct检测常见方法有比浊法、乳胶凝集法、酶联免疫(elisa)及胶体金等检测方法。比浊及elisa法虽准确度高，但操作繁琐，检测所需时间较长。胶体金法虽检测时间短，操作简单，但灵敏度低，不能实现定量检测。

鉴于现有检测技术的不足，本发明提供了一种量子点微流控芯片及制备犯法。量子点(qds)是一种半导体纳米颗粒，与其它免疫荧光分析方法中通常采用的有机荧光染料相比，光化学特性具有非常明显的优势。当qds纳米颗粒受到外来光源激发，发射荧光光谱窄、散射少、光漂白作用小、光化学性质稳定、不易被生物代谢和化学因素降解。此外，量子点还能够通过偶联剂与蛋白分子进行共价偶联。本发明的芯片可实现人体全血样本中crp与pct定性与定量检测，对于炎症感染的预测和鉴别诊断起着重要的作用，可广泛用于icu病房、血液科、肿瘤科、儿科、早产儿及新生儿监护室、外科、内科、器官移植科、急诊科和治疗实验室等。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明目的之一，在于提供一种联合诊断纸基微流控芯片。

一种联合诊断纸基微流控芯片，主要由纸基(7)的各种功能区，和进样部件(2)与分样部件(6)组成，所述芯片(1)呈圆盘状，上面设置有纸基(7)和放置纸基(7)的芯片基片(9)，以及纸基(7)上面的密封膜(8)一共三层；在芯片(1)的圆心处设置一个圆洞，圆洞中放置进样部件(2)，在进样部件(2)周围沿直径延长线均匀、对称地排布2个以上的样品处理区(3)；每个样品处理区(3)沿直径延长线在出口处连接1个分样部件(6)；每个分样部件连接一个检测区(5)；芯片(1)上还沿直径延长线方向设置2个以上螺孔(4)作固定。

所述进样部件(2)是一个有底面的空心圆柱，在圆柱内部从底部到顶部，由大到小设置有2层以上的圆形台阶状平台，每个平台加工有凹形的沉淀均流池(2-4)，空心圆柱的底部一圈是余液池(2-5)；沉淀均流池(2-4)根据与芯片(1)样品处理区(3)的数量相同，被经过进样部件(2)圆心的隔墙(2-3)均匀分成2个以上；每个沉淀均流池(2-4)都交错布置着在同一平台开口高度一致的均样口(2-2)；进样部件(2)最顶部隔墙(2-3)的圆心处安装着1个进样管(2-1)，进样管(2-1)的底部开口被沉淀均流池(2-4)的隔墙(2-3)均匀分割；最下面一层的每个沉淀均流池(2-4)的底部中间位置还设置有与控制针(2-6)密封配合的纸基通道进样口(2-8)；进样部件(2)在每个纸基通道进样口(2-8)的下底面，都设置有安装纸基样品处理区(3)进样通道(3-1)的浅槽；所述控制针(2-6)全部安装在一个控制针架(2-7)下，能够一同插入或拔出纸基通道进样口(2-8)；所述控制针架(2-7)能够安装在配套的检测仪器上控制向下和向上运行。

所述样品处理区(3)是围绕进样部件(2)的圆周沿直径延长线方向均匀分布的，包含并排排列的三种功能通道的功能区；首先是进样通道(3-1)的一端和与进样部件(2)的每个最底一层的纸基通道进样口(2-8)相通；进样通道(3-1)的另一端头倾斜插在并排的离心通道(3-2)的圆周外侧一端的侧壁开口上，与离心通道(3-2)相连通；离心通道(3-2)的圆周内侧另一端又与并排的量子点反应通道(3-3)的一端通过u型管道头和头相连；量子点反应通道(3-3)的另一端通过弯管头和头相连于检测样主通道(10)；检测样主通道(10)与样品处理区(3)外侧进样部件(2)圆周沿直径延长线上的分样部件(6)相连通。

所述进样通道(3-1)与离心通道(3-2)相连接的侧壁处安装有反向截止膜(3-6)，反向截止膜(3-6)在离心通道(3-2)一侧具有众多单向瓣膜，能够常压下让液体混合物流过，但是在加压下单向瓣膜闭合可阻止液体混合物倒流；所述离心通道(3-2)与进样通道(3-1)相连接的一端是靠芯片圆心外侧，在离心通道(3-2)的侧壁开口处靠芯片圆心外侧同样安装有反向截止膜(3-6)，此处的反向截止膜(3-6)双侧各自加工有不相通的、开合力不同的单向瓣膜，常压下朝向芯片圆心外侧端头的单向瓣膜闭合样液无法通过，但在外力离心加压下样液能够打开单向瓣膜流过，离心过后的样液在常压下能够通过反向截止膜(3-6)的另一侧，常压下不能倒流；反向截止膜(3-6)朝向芯片圆心外侧有离心通道(3-2)总长的1/4-1/3长是离心抓捕通道(3-7)，离心抓捕通道(3-7)的端头在密封膜(8)上加工有排气孔(3-8)。

所述离心通道(3-2)的中部安装有粗滤膜(3-5)，能够在纸基表面截留颗粒物质；在离心通道(3-2)靠芯片圆周内侧一端安装有变色感应阀(3-4)；所述变色感应阀(3-4)通过安装在离心通道(3-2)端头内部的遇到液体变色的变色纸使感光阀触动薄片隔断离心通道(3-2)；3-5min后变色纸自动退色，感光阀触动断开隔断离心通道(3-2)的薄片。

所述量子点反应通道(3-3)内部加工有众多的纳米纤维孔(3-9)。

所述分样部件(6)是一个有底面的空心圆柱，空心圆柱底面朝芯片(1)圆心一侧的侧壁处设置有开口与检测样主通道(10)连接，分样部件(6)空心圆柱的底面不超过检测样主通道(10)的高度；在朝向检测样主通道(10)的空心圆柱内部，由挡墙(6-2)形成一个弧形的储液池(6-1)；储液池(6-1)的挡墙(6-2)弧形凸面朝向芯片(1)圆心外侧，挡墙(6-2)弧形凸面与分样部件(6)空心圆柱余下的部分组成分液池(6-3)；分液池(6-3)的空心圆柱底部外壁加工有开口，连接2条以上的分样用的纸基(7)检测通道(11)；所述2条以上的检测通道(11)在分样部件(6)分液池(6-3)的空心圆柱侧面均匀分布，每条检测通道(11)在分样部件(6)空心圆柱的开口到弧形挡墙(6-2)的距离一致，保证分液均匀一致。

所述每条检测通道(11)上从分样部件(6)一端向外依次加工有1-2个检测反应室(5-1)和1个质检反应室(5-2)，每条检测通道(11)的向外的另一端都连接到1个废液室(5-3)，组成一个独立的检测区(5)；所述每个废液室(5-3)都安装有真空管(5-4)；离心完成后，真空管(5-4)接真空泵加速离心样液的流动，加速检测缩短检测时间；所述检测通道(11)都有不同的检测通道标记(12)。

进一步，所述进样部件(2)和分样部件(6)是事先加工好后放入芯片(1)的预留的纸基(7)圆洞中的，进样部件(2)的上表面没有密封膜(8)，分样部件(6)的上表面有密封膜(8)；所述芯片(1)通过螺孔(4)固定在配套的荧光检测仪上；所述检测通道(11)上都设置有检测通道标记(12)，所述芯片(1)检测反应室(5-1)和质检反应室(5-2)的材质是硝酸纤维素膜，量子点反应通道(3-3)的材质是玻璃纤维膜；离心抓捕通道(3-7)的纸基是凹坑的粗糙表面，并且表面进行了疏水处理，以防止离心的上清液被吸附。

进一步，所述进样通道(3-1)和离心通道(3-2)的纸基(1)只起到引流的作用，在进样通道(3-1)和离心通道(3-2)的纸基(7)上方均留有液体通道。

本发明的目的还在于提供一种上述芯片的制备方法。

上述联合诊断纸基微流控芯片的制备方法，采用一定厚度且与芯片相同直径的纸基(7)，纸基(7)功能区的量子点反应通道(3-3)、检测反应室(5-1)和质检反应室(5-2)采用材质挖除替换，进样通道(3-1)和离心通道(3-2)厚度减薄，粘贴在芯片基片(9)上；再在相应位置安装密闭配合的进样部件(2)与分样部件(6)；纸基(7)的上面除了进样部件(2)外均用密封膜(8)密封覆盖。

进一步，所述密封膜(8)是无色透明，透光率大于90％，厚度不大于1mm(≤1mm)。

进一步，上述制备方法还包括如下步骤：

1)制作芯片纸基：利用紫外光刻法在硅烷化单分子层纸基底板上制作出微流控芯片通道，得到纸基(7)；

2)制作检测反应室(5-1)和质控反应室(5-2)：将抗体用沉积到纸基芯片上分别得到检测反应室(5-1)和质控反应室(5-2)；

3)制作量子点反应通道(3-3)：利用激光刻蚀法在纸基(7)上刻蚀出的纳米纤维孔(3-9)，再利用喷涂机将量子点标记的抗体沉积在纳米纤维孔(3-9)内得到量子点反应通道(3-3)；

4)封装芯片：透明薄膜粘贴在纸基芯片表面，使厚度达到要求，然后真空静置再烘烤固化，实现气泵密封。

作为一种优选，步骤4)中将未固化的pdms涂在纸基芯片表面，用匀胶机离心平铺在纸基上，厚度达到要求，真空静置去气泡处理，烘烤固化，实现气泵密封。

进一步，步骤3)中所述的量子点为cdse/zns量子点，或金属纳米簇量子点，或cdse/zns量子点与金属纳米簇结合的量子点。

进一步，所述检测反应室(5-1)和质检反应室(5-2)的材质是硝酸纤维素膜，量子点反应通道(3-3)的材质是玻璃纤维膜。

本发明的有益效果在于：

1)本发明提供了一种联合诊断纸基微流控芯片，该芯片在设计时增加了全血离心单元，可以快速自动的对全血进行分离，极大的节约了检测时间和简化了检测步骤。

2)本发明提供的纸基微流控芯片能实现样品自动进样，全血分离，多通道检测，能够满足检测精度。

3)本发明采用纸基微流控芯片，成本低，制作简易，使用便捷，在贫困地区和条件有限的场合有很大的实用性。

附图说明

图1为本发明的一种芯片的俯视结构示意图。

图2为本发明的一种进样部件的俯视结构示意图。

图3为本发明的一种进样部件的主视剖面结构示意图。

图4为本发明的一种进样部件带控制针架的俯视结构示意图。

图5为本发明的一种进样部件带控制针架的主视剖面结构示意图。

图6为本发明的一种控制针与的主视剖面放大示意图。

图7为本发明的一种样品处理区和检测区的俯视结构示意图。

图8为本发明的一种分样部件俯视结构示意图。

图9为本发明的一种分样部件主视剖面结构示意图。

图10为本发明的一种芯片的俯视结构示意图。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行详细描述。所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

1.采用量子点免疫层析技术检测c反应蛋白。将量子点标记于crp鼠单克隆抗体上并喷涂在量子点反应通道(3-3)。同时，将crp鼠单克隆抗体作为检测线、羊抗鼠igg二抗作为质控线包被于硝酸纤维素膜上，与吸水垫及优化的样品垫组装成试纸条。

2.合成量子点标记crp抗体

活化：将表面包覆羧基的水溶性量子点加入到bs溶液中，加入nhs和bs的混合溶液与edc和mes的溶液，涡旋混匀，超声活化。增容体积，使用低温超速离心机离心分离，弃上清液。

偶联：将bs溶液加入到活化后的量子点中，在涡旋、超声条件下，复溶，加入crp抗体。涡旋混匀后，置于旋转培养器反应。分别加入终止剂和封闭剂，混匀，室温下，置于旋转培养器上反应扩容，低温离心分离，弃上清液，重复操作两次。加入保存液，重悬。样品放入冰箱保存备用。

实施例2

合成量子点标记pct抗体

将油溶性cdse/zns量子点，或金属纳米簇量子点，或cdse/zns量子点与金属纳米簇结合的量子点水溶性化方法:用丙酮沉淀并重新分散于三氯甲烷中，加入适量巯基乙酸，充分混合后静置反应2h。离心，弃上清液，加缓冲溶液使其完全溶解，再加入丙酮提纯，如此反复2～3次，最后将沉淀分散于磷酸盐缓冲溶液中，储存备用。

运用分别结合到pct两个不同位点的抗抗钙素单抗和抗降钙素多抗，可基本排除交叉反应。将单抗用共价交联法连接到量子点表面，得到量子点标记单抗，具体过程是：向磷酸盐缓冲液中加入量子点、edc、15μgnhs溶液和抗抗钙素单抗溶液，混合均匀并于室温下反应，加入甘氨酸封闭。用色谱柱或层析柱分离纯化，得到量子点标记抗抗钙素单抗。

实施例3

一种联合诊断纸基微流控芯片：在其中一个实施例中，芯片主要由纸基(7)的各种功能区，和进样部件(2)与分样部件(6)组成，其特征在于，所述芯片(1)呈圆盘状，上面设置有纸基(7)和放置纸基(7)的芯片基片(9)，以及纸基(7)上面的密封膜(8)一共三层；在芯片(1)的圆心处设置一个圆洞，圆洞中放置进样部件(2)，在进样部件(2)周围沿直径延长线均匀、对称地排布2个以上的样品处理区(3)；每个样品处理区(3)沿直径延长线在出口处连接1个分样部件(6)；每个分样部件连接一个检测区(5)；芯片(1)上还沿直径延长线方向设置2个以上螺孔(4)作固定。

在其中一个实施例中，进样部件(2)是一个有底面的空心圆柱，在圆柱内部从底部到顶部，由大到小设置有2层以上的圆形台阶状平台，每个平台加工有凹形的沉淀均流池(2-4)，空心圆柱的底部一圈是余液池(2-5)；沉淀均流池(2-4)根据与芯片(1)样品处理区(3)的数量相同，被经过进样部件(2)圆心的隔墙(2-3)均匀分成2个以上；每个沉淀均流池(2-4)都交错布置着在同一平台开口高度一致的均样口(2-2)；进样部件(2)最顶部隔墙(2-3)的圆心处安装着1个进样管(2-1)，进样管(2-1)的底部开口被沉淀均流池(2-4)的隔墙(2-3)均匀分割；最下面一层的每个沉淀均流池(2-4)的底部中间位置还设置有与控制针(2-6)密封配合的纸基通道进样口(2-8)；进样部件(2)在每个纸基通道进样口(2-8)的下底面，都设置有安装纸基样品处理区(3)进样通道(3-1)的浅槽；所述控制针(2-6)全部安装在一个控制针架(2-7)下，能够一同插入或拔出纸基通道进样口(2-8)；所述控制针架(2-7)能够安装在配套的检测仪器上控制向下和向上运行。

在其中一个实施例中，样品处理区(3)是围绕进样部件(2)的圆周沿直径延长线方向均匀分布的，包含并排排列的三种功能通道的功能区；首先是进样通道(3-1)的一端和与进样部件(2)的每个最底一层的纸基通道进样口(2-8)相通；进样通道(3-1)的另一端头倾斜插在并排的离心通道(3-2)的圆周外侧一端的侧壁开口上，与离心通道(3-2)相连通；离心通道(3-2)的圆周内侧另一端又与并排的量子点反应通道(3-3)的一端通过u型管道头和头相连；量子点反应通道(3-3)的另一端通过弯管头和头相连于检测样主通道(10)；检测样主通道(10)与样品处理区(3)外侧进样部件(2)圆周沿直径延长线上的分样部件(6)相连通。

在其中一个实施例中，进样通道(3-1)与离心通道(3-2)相连接的侧壁处安装有反向截止膜(3-6)，反向截止膜(3-6)在离心通道(3-2)一侧具有众多单向瓣膜，能够常压下让液体混合物流过，但是在加压下单向瓣膜闭合可阻止液体混合物倒流；所述离心通道(3-2)与进样通道(3-1)相连接的一端是靠芯片圆心外侧，在离心通道(3-2)的侧壁开口处靠芯片圆心外侧同样安装有反向截止膜(3-6)，此处的反向截止膜(3-6)双侧各自加工有不相通的、开合力不同的单向瓣膜，常压下朝向芯片圆心外侧端头的单向瓣膜闭合样液无法通过，但在外力离心加压下样液能够打开单向瓣膜流过，离心过后的样液在常压下能够通过反向截止膜(3-6)的另一侧，常压下不能倒流；反向截止膜(3-6)朝向芯片圆心外侧有离心通道(3-2)总长的1/4-1/3长是离心抓捕通道(3-7)，离心抓捕通道(3-7)的端头在密封膜(8)上加工有排气孔(3-8)。

在其中一个实施例中，离心通道(3-2)的中部安装有粗滤膜(3-5)，能够在纸基表面截留颗粒物质；在离心通道(3-2)靠芯片圆周内侧一端安装有变色感应阀(3-4)；所述变色感应阀(3-4)通过安装在离心通道(3-2)端头内部的遇到液体变色的变色纸使感光阀触动薄片隔断离心通道(3-2)；3-5min后变色纸自动退色，感光阀触动断开隔断离心通道(3-2)的薄片。

在其中一个实施例中，量子点反应通道(3-3)内部加工有众多的纳米纤维孔(3-9)。

在其中一个实施例中，分样部件(6)是一个有底面的空心圆柱，空心圆柱底面朝芯片(1)圆心一侧的侧壁处设置有开口与检测样主通道(10)连接，分样部件(6)空心圆柱的底面不超过检测样主通道(10)的高度；在朝向检测样主通道(10)的空心圆柱内部，由挡墙(6-2)形成一个弧形的储液池(6-1)；储液池(6-1)的挡墙(6-2)弧形凸面朝向芯片(1)圆心外侧，挡墙(6-2)弧形凸面与分样部件(6)空心圆柱余下的部分组成分液池(6-3)；分液池(6-3)的空心圆柱底部外壁加工有开口，连接2条以上的分样用的纸基(7)检测通道(11)；所述2条以上的检测通道(11)在分样部件(6)分液池(6-3)的空心圆柱侧面均匀分布，每条检测通道(11)在分样部件(6)空心圆柱的开口到弧形挡墙(6-2)的距离一致，保证分液均匀一致。

在其中一个实施例中，每条检测通道(11)上从分样部件(6)一端向外依次加工有1-2个检测反应室(5-1)和1个质检反应室(5-2)，每条检测通道(11)的向外的另一端都连接到1个废液室(5-3)，组成一个独立的检测区(5)；所述每个废液室(5-3)都安装有真空管(5-4)；离心完成后，真空管(5-4)接真空泵加速离心样液的流动，加速检测缩短检测时间；所述检测通道(11)都有不同的检测通道标记(12)。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。