基于多种模板分子印迹聚合物固相微萃取的可选择阵列式分析平台的构建方法与流程

本发明涉及基于多种模板分子印迹聚合物固相微萃取的阵列式、可选择分析平台的构建方法，能用于不同种类环境污染物的筛查分析，属于环境分析和痕量样品前处理技术领域。

背景技术：

双酚类是应用最为广泛的一类环境雌激素之一，微量甚至痕量即可能对人类和动物的生殖系统造成不良影响。该类物质具有两种羟苯基官能团，由于自身结构的优越性而被用于高产量生活用品的生产，如聚酯类塑料制品（婴儿奶瓶、塑料水瓶和塑胶食品袋等）。对羟基苯甲酸酯（pbs）为常用防腐剂之一，其抑菌范围广、作用强、用量少、毒性低、易配置且防腐效果不易随ph值的变化而变化，在碱性环境下尚有效。对羟基苯甲酸酯可用作抗菌剂，广泛应用于制药、食品和化妆品工业中。但是大量或不当使用防腐剂会对人体造成一定损害，如有类雌激素作用，影响人的内分泌功能，对人体健康具有潜在的危害性。邻苯二甲酸酯类化合物(paes)是一类重要的内分泌干扰物，可作为增塑剂广泛应用于食品、玩具和化妆品等不同工业领域的塑料包装。以提高其可操作性、透明度、耐久性和寿命。然而，paes的不当使用会引起对人体健康的不利影响，如肝毒性、异常繁殖、潜在的致癌性和其他疾病^[9]。

双酚类、对羟基苯甲酸酯类以及邻苯二甲酸酯类均属环境雌激素，具有干扰体内正常内分泌物质的合成、释放、运输、结合、代谢等过程，激活或抑制内分泌系统的功能，从而破坏维持机体稳定性和调控作用的物质，对人体具有潜在的危害性。且它们应用十分广泛，想要彻底杜绝是不太可能的，因此对这三类物质的分离检测是极有必要的。而在实际样品当中，由于基质复杂，且分析物含量多以痕量级存在，所以样品前处理是极有必要的。分子印迹技术因具有形式可控、稳定性好、重复使用率高、可预测性等优点而备受关注。然而，目前单一分子印迹聚合物大都不能对印迹分子结构类似物有较好的选择性，几乎无法实现同时对多类别结构类似物的高通量吸附。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提出了基于多种模板分子印迹聚合物固相微萃取的可选择阵列式分析平台的搭建方法，该平台能对双酚类、对羟基苯甲酸酯类及邻苯二甲酸酯类中的八种环境雌激素污染物进行同时分离分析，实现了同时对多种结构类似物甚至跨类别多种分析物的高通量吸附萃取，极大的提高了分离检测效率、检测灵敏度以及吸附通量，减少了有机试剂的使用。

本发明的技术方案：

基于多种模板分子印迹聚合物固相微萃取的可选择阵列式分析平台的构建方法，具体步骤如下：

（1）将一端烧结的玻璃毛细管i进行硅烷化处理后作为内衬，烘干后待用，同时准备一端烧结的玻璃毛细管ⅱ作为外套；

（2）将8种模板分子分别与功能单体溶解于聚合溶剂中，预聚合8h后加入交联剂和引发剂，超声混合均匀后，吹氮气除去氧气，将混合溶液注入1.8-2.2mm的外套玻璃毛细管ii中，再在外套玻璃毛细管ii中插入经硅烷化试剂修饰的内衬玻璃毛细管i，玻璃毛细管i下端浸没在玻璃毛细管ii中的混合溶液中，然后用橡胶带封住两玻璃毛细管间的空隙以隔离氧气，在60-62℃的恒温水浴锅中聚合24h；8种模板分子为双酚类、对羟基苯甲酸酯类、邻苯二甲酸酯类，双酚类包括双酚a（bpa）、双酚b（bpb）、双酚f（bpf），对羟基苯甲酸酯类包括对羟基苯甲酸甲酯（mp）、对羟基苯甲酸乙酯（ep）、对羟基苯甲酸丙酯（pp），邻苯二甲酸酯类包括邻苯二甲酸二甲酯（dmp）和邻苯二甲酸二乙酯（dep）；

（3）聚合反应结束后，去掉玻璃毛细管ii，取出覆载了涂层的内衬玻璃毛细管i，然后将玻璃毛细管i附着涂层的长度截取为1.8cm，保留玻璃毛细管i上端，采用甲醇-乙酸作为模板去除过程中的洗脱溶剂，得到8种覆载分子印迹聚合物固相微萃取涂层的毛细管；

（4）重复步骤（1）-步骤（3），在步骤（2）不加入模版分子，制备得到非分子印迹聚合物固相微萃取涂层的毛细管；

（5）选择三根以上步骤（3）制备得到的覆载分子印迹聚合物固相微萃取涂层的毛细管并排置于泡沫板上，或两根以上步骤（3）制备得到的覆载分子印迹聚合物固相微萃取涂层的毛细管与一根步骤（4）制备得到的非分子印迹聚合物固相微萃取涂层的毛细管进行组合，并排置于泡沫板上，构建得到多种模板分子印迹聚合物固相微萃取的可选择阵列式分析平台。

步骤（2）功能单体为丙烯酰胺；聚合溶剂为甲醇；交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯，引发剂为偶氮二异丁腈。

步骤（2）模板分子:功能单体:交联剂的摩尔比为1:4:20；模板分子:聚合溶剂:引发剂的摩尔比为1:123.6:0.12。

本发明的有益效果是：

（1）本发明构建的分析平台能对双酚类、对羟基苯甲酸酯类及邻苯二甲酸酯类中八种环境雌激素污染物进行同时萃取和同步分析，其分析平台可实现同时对多种结构类似物甚至跨类别多种物质的高通量吸附。

（2）本发明构建的分析平台可由同种涂层、不同数量的分析平台搭建，也可由不同涂层、不同涂层数量分析平台的搭建，可根据不同的实验需求进行搭建，提供了阵列式、可选择的分析平台。

（3）本发明提出了对双酚类、对羟基苯甲酸酯和邻苯二甲酸酯类中八个分析物同时分析以及同时萃取的分析方法，极大提高了分离检测效率。

（4）本发明提供的分析平台，结合了分子印迹技术与固相微萃取技术，即将制得的多种模板分子印迹聚合物固相微萃取涂层用于搭建分析平台，提供了一种高效、高灵敏度、高通量的环境雌激素污染物分离监测方法。

附图说明

图1为本发明实施例1中同时检测5mg/l八个分析物质的混合标准溶液在三个检测波长下的色谱图；其中a)邻苯二甲酸二甲酯（dmp）；b)邻苯二甲酸二乙酯（dep）；c)双酚f（bpf）；d)双酚a（bpa）；e)双酚b（bpb）；f)对羟基苯甲酸甲酯（mp）；h)对羟基苯甲酸乙酯（ep）；i)对羟基苯甲酸丙酯（pp）；

图2为8阵列分析平台对八个分析物的吸附性能研究结果；

图3为3阵列分析平台对八个分析物的高通量吸附研究结果；

图4为4阵列分析平台对八个分析物的高通量吸附研究结果；

图5为同种mip的不同数量分析平台对八个分析物的高通量吸附研究结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说，但本发明的保护范围并不限于所述内容。

实施例1

模板分子印迹聚合物以及非分子印迹聚合物涂层的制备，具体步骤如下：

（1）将一端烧结的内衬毛细管i进行硅烷化处理，将内径为0.9-1.1mm规格的玻璃毛细管洗净、烘干，一端烧结，然后垂直插入浓度为1mol/l的氢氧化钠溶液中浸泡8h后，再插入1mol/l盐酸溶液中浸泡1h，清洗后烘干，使玻璃毛细管表面的硅羟基活化，再插入3-甲基丙烯酰基-丙基-三甲氧基硅烷中进行硅烷化反应，反应后用甲醇清洗，氮气吹干得到经硅烷化试剂修饰的内衬玻璃毛细管i；同时准备一端烧结的玻璃毛细管ii作为外套；

（2）将1mmol的模板分子双酚a，4mmol的功能单体丙烯酰胺溶解于123.6mmol的聚合溶剂甲醇中，预聚合8h后加入20mmol的交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯和0.12mmol的引发剂偶氮二异丁腈，超声混合均匀后，吹氮气10分钟除去氧气，将混合溶液注入1.8-2.2mm的玻璃毛细管外套ii中，插入经硅烷化试剂修饰的毛细管i，用橡胶带封住两毛细管间的空隙以隔离氧气，在60-62℃的恒温水浴锅中聚合24h；

（3）聚合反应结束后，去掉玻璃毛细管ii，取出覆载了涂层的内衬玻璃毛细管i，然后将玻璃毛细管i附着涂层的长度截取为1.8cm，保留玻璃毛细管i上端，采用甲醇-乙酸作为模板去除过程中的洗脱溶剂，得到双酚a分子印迹聚合物，标记为mip-bpa；

（4）重复重复步骤（1）-步骤（3），将模板分子替换为双酚b（bpb）、双酚f（bpf）、对羟基苯甲酸甲酯（mp）、对羟基苯甲酸乙酯（ep）、对羟基苯甲酸丙酯（pp）、邻苯二甲酸二甲酯（dmp）和邻苯二甲酸二乙酯（dep），依次制备分子印迹聚合物，得到8种覆载分子印迹聚合物固相微萃取涂层的毛细管，分别标记为mip-bpb、mip-mp、mip-ep、mip-pp、mip-dmp、mip-dep；

（5）非分子印迹聚合物的制备：制备方法与步骤（1）基本相同，不同之处在于非分子印迹聚合物的制备不加任何模板分子，制备得到非分子印迹聚合物固相微萃取涂层的毛细管。

采用高效液相色谱法，使用8种分子印迹聚合物分别对八种环境雌激素的同时检测，色谱柱为j&kscientificltdc18色谱柱(5µm，4.6×250mm)，流动相乙腈-水（50-50，v/v)，流速1ml/min，柱温为30℃，进样体积为20μl；采用三波长等度洗脱进行检测，波长一是双酚类三种物质的检测波长230nm，波长二是对羟基苯甲酸酯类三种物质的检测波长254nm，波长三是邻苯二甲酸酯类两种物质检测波长为225nm。

如图1所示为同时检测浓度均为5mg/l的八个分析物质的混合溶液在三个检测波长下的色谱图；其中a)邻苯二甲酸二甲酯（dmp；b)邻苯二甲酸二乙酯（dep）；c)双酚f（bpf）；d)双酚a（bpa）；e)双酚b（bpb）；f)对羟基苯甲酸甲酯（mp）；h)对羟基苯甲酸乙酯（ep）；i)对羟基苯甲酸丙酯（pp）；从图中可以看出，在4-12min内，八个目标分析物得到有效的基线分离，表明检测方法能够用于这八个分析物的定性和定量分析。

实施例2

基于多种模板分子印迹聚合物固相微萃取的8阵列分析平台的构建，具体步骤如下：将实施例1的步骤（4）中制得的八种覆载分子印迹聚合物固相微萃取涂层的毛细管搭建得到8阵列分析平台，即8根mips并排置于泡沫板上。

8阵列分析平台的高通量吸附性能研究：

将平台应用于水介质中八种目标分析物的吸附分离，将平台的涂布有涂层部分完全浸入萃取溶液当中，其中萃取溶剂为10%的nacl水溶液，萃取的体积为100ml，萃取混合溶液中每种目标分析物的浓度均为50μg/l，萃取时间300min，然后进行解吸，解吸溶剂为甲醇，超声解吸3min，解吸液的体积为250μl，解吸模式为8种固相微涂层分别进行解吸。

采用高效液相色谱法对解吸溶液进行分析检测，色谱柱为j&kscientificltdc18色谱柱(5µm，4.6×250mm)，流动相乙腈-水（50-50，v/v)，流速1ml/min，柱温为30℃，进样体积为20μl；采用三波长等度洗脱进行检测，波长一是双酚类三种物质的检测波长230nm，波长二是对羟基苯甲酸酯类三种物质的检测波长254nm，波长三是邻苯二甲酸酯类两种物质检测波长为225nm。

图2为本实施例中8阵列分析平台对八个分析物的吸附性能研究；结果显示：8阵列分析平台中的单阵列（单根毛细管）也可以同时吸附八种分析物，比较总吸附量，双酚类中mip-bpf的吸附性能最好，对羟基苯甲酸酯类中mip-mp的吸附性能最好，邻苯二甲酸酯类中mip-dep的吸附性能最好。

实施例3

基于多种模板分子印迹聚合物固相微萃取的3阵列分析平台的构建，具体步骤如下：将实施例1的步骤（4）中制得的三种覆载分子印迹聚合物固相微萃取涂层的毛细管搭建得到3阵列分析平台，即3根mips并排置于泡沫板上。

构建以下几种3阵列分析平台：

（1）3阵列分析平台-ⅰ：将双酚类中萃取性能较佳的mip-bpf，对羟基苯甲酸酯类中的印迹效果较佳的mip-mp以及邻苯二甲酸酯类中的mip-dep用于搭建3阵列分析平台，3根涂层并排置于泡沫板上，得到3阵列分析平台-ⅰ。

（2）3阵列分析平台-ⅱ：将双酚类的mip-bpa、mip-bpb和mip-bpf用于搭建3阵列分析平台，3根并排置于泡沫板上，得到3阵列分析平台-ⅱ。

（3）3阵列分析平台-ⅲ：将对羟基苯甲酸酯类的mip-mp、mip-ep和mip-pp用于搭建3阵列分析平台，3根并排置于泡沫板上，得到4阵列分析平台-ⅲ。

（4）3阵列分析平台-ⅳ：将邻苯二价酸酯类的mip-dmp和mip-dep以及非分子印迹涂层nip用于搭建3阵列分析平台，3根并排置于泡沫板上，得到3阵列分析平台-ⅳ。

将本实施例搭建的3阵列分析平台应用于水中八种目标分析物的吸附分离，其中萃取溶剂为10%的nacl水溶液，萃取的体积为100ml，萃取混合溶液中每种目标分析物的浓度均为50μg/l，萃取时间300min，解吸溶剂为甲醇，超声解吸3min，然后进行解吸，解吸液的体积为250μl，解吸模式为3根涂层同时解吸。

图3为本实施例中3阵列分析平台对八个分析物的吸附性能研究；从图中可以看出，3阵列的分析平台对双酚类的三种分析物的吸附量明显高于其余两类物质的分析物，而针对8个分析物的总吸附量，综合得出3阵列分析平台-ⅰ为较优分析平台。

实施例4

基于多种模板分子印迹聚合物固相微萃取的4阵列分析平台的构建，具体步骤如下：将实施例1的步骤（4）中制得的四种覆载分子印迹聚合物固相微萃取涂层的毛细管搭建得到4阵列分析平台，即4根mips并排置于泡沫板上。

构建以下几种4阵列分析平台：

（1）4阵列分析平台-ⅰ：将在三类别中分别选出的三种吸附性能较佳的mips以及nip用于搭建4阵列分析平台，4根并排置于泡沫板上，得到4阵列分析平台-ⅰ。

（2）4阵列分析平台-ⅱ：将在双酚类以及对羟基苯甲酸酯类中分别使用两根mip-bpf和mip-mp并排置于泡沫板上，得到4阵列分析平台-ⅱ。

（3）4阵列分析平台-ⅲ：将在双酚类以及对羟基苯甲酸酯类中分别使用两根mip-bpf和mip-dep并排置于泡沫板上，得到4阵列分析平台-ⅲ。

（4）4阵列分析平台-ⅳ：将在双酚类以及对羟基苯甲酸酯类中分别使用两根mip-mp和mip-dep并排置于泡沫板上，得到4阵列分析平台-ⅳ。

将本实施例搭建的4阵列分析平台应用于水中八种目标分析物的吸附分离，其中萃取溶剂为10%的nacl水溶液，萃取的体积为100ml，萃取混合溶液中每种目标分析物的浓度均为50μg/l，萃取时间300min，解吸溶剂为甲醇，超声解吸3min，然后进行解吸，解吸液的体积为250μl，解吸模式为4根涂层同时解吸。

图4为本实施例中4阵列分析平台对八个分析物的吸附性能研究；从图中可以看出，针对8个分析物的总吸附量，综合选出较优的分析平台为4阵列分析平台-ⅰ。

实施例5

基于多种模板分子印迹聚合物固相微萃取的其他阵列分析平台的构建，构建以下几种4阵列分析平台：

（1）将在三类别中分别选出的三种吸附性能较佳的mips用于同种覆载分子印迹聚合物固相微萃取涂层的毛细管不同数量的分析平台搭建，使用mip-bpf的1根得到1mip-bpf分析平台；使用2根得2mip-bpf分析平台；3根得到3mip-bpf分析平台；4根可得4mip-bpf分析平台。

（2）使用1根mip-mp得到1mip-mp分析平台；使用2根可得2mip-mp分析平台；3根得到3mip-mp分析平台；4根搭建得4mip-mp分析平台。

（3）使用1根mip-dep得到1mip-dep分析平台；使用2根搭建得2mip-dep分析平台；3根得到3mip-dep分析平台；4根可得4mip-dep分析平台。

将所搭建的分析平台应用于水中八种目标分析物的吸附分离，其中萃取溶剂为10%的nacl水溶液，萃取的体积为100ml，萃取混合溶液中每种目标分析物的浓度均为50μg/l，萃取时间300min，解吸溶剂为甲醇，超声解吸3min，然后进行解吸，解吸液的体积为250μl，解吸模式为各分析平台的多根同时解吸。

图5为实施例5中同种mip不同数量分析平台对八个分析物的高通量吸附研究结果，结果显示：随着数量的增加，平台对八个分析物的吸附通量增加。

总结：当检测物质仅有双酚类时，从实施例3的实验结果，可选择三阵列的分析平台，优选3阵列分析平台-ⅰ；从实施例4的实验结果，当检测物含有双酚类、对羟基苯甲酸酯类和邻苯二甲酸酯类时，可选择四阵列分析平台，以提高三类物质在萃取分析时的容量，从而提高分析时的灵敏度；当不清楚待检测样品中物质种类时，可采用八阵列萃取平台，不同的固相微萃取涂层可进行不同分析物质的选择性萃取，有利于多类别分析物质的筛查确认。

上面结合附图对本发明的具体实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提。