一种青霉胺功能化的亲水介孔硅材料及制备和应用

本发明涉及一种青霉胺功能化的亲水性介孔硅材料的制备及其在复杂生物样品中糖肽富集的应用。

背景技术：

蛋白质的糖基化是重要也是最普遍的蛋白质翻译后修饰之一。糖基化蛋白质的样品前处理是几乎所有分析程序中的基本且必不可少的步骤，尤其是对于具有复杂基质的生物和环境样品的分析而言。所以在进行ms分析(文献1.dalpathado,d.s.,heather,d.analyst,2008,133(6):731-738.)之前，需要大量的前处理工作来减少复杂环境的影响，提高检测准确度。目前现有的糖肽或糖蛋白的富集方法有：凝集素富集，具有较高的特异性，但是覆盖范围较窄，操作过程中需要同时使用多种凝集素，并且种类有限；有机溶剂萃取富集，主要是将其中的蛋白质沉淀，操作简便，但蛋白质去除不完全；超滤结合石墨化碳富集，样品处理步骤繁琐、通量低；活性炭富集，存在蛋白残留的问题，干扰后续的检测；亲水作用色谱富集(文献2.mccalley,d.v.journalofchromatographya,2017,1523:49-71.)，操作简便，高糖肽覆盖率，再现性良好且与后续检测兼容，但方法的进一步应用受到亲水性基质选择性不足的限制。所以发展一种简单易制备亲水材料仍是研究人员的热点。迄今为止，在材料领域中，已有许多亲水材料于糖肽富集，例如二氧化硅，磁性纳米颗粒，氧化石墨烯和金属有机骨架等。(文献3.qiao,l.；shi,x.；xu,g.trendsanal.chem.,2016,81:23-33.)

介孔二氧化硅具有较大介孔骨架结构，在液相传质过程中，较大的空间结构使得液体传质速率加快，色谱分离效率提高。该类材料通常还具有较大的比表面积且表面的硅羟基易于修饰各种功能化基团来满足不同的实际需要。目前，已经介孔二氧化硅在催化、能源和水处理等领域有着广泛的应用。(文献4.t.yokoi,y.kubota,t.tatsumi.appliedcatalysisa:general,2012,421:14-37.文献5.sun,m.h.；huang,s.z.chemicalsocietyreviews,2016,45(12):3479-563.文献6.liu,j.；sun,z.k.；deng,y.h.；zou,；zhao,d.y.angewandtechemieinternationaledition.2009,48:5875-5879.)

本专利采用溶胶-凝胶法，制备出了含有介孔的二氧化硅材料，随后用光引发巯基-烯反应对其表面进行修饰，使其可以成功应用于复杂样品中糖肽的高效富集。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种青霉胺功能化的亲水性介孔硅材料的制备及应用，其可用作亲水色谱的固定相高效的富集复杂生物样品中的糖肽。

为实现上述目的，可按如下步骤操作，

(1)介孔无机硅材料的制备：在50～70ml的1.5～2.5m盐酸溶液体系中加入模板剂1.0～1.5gf127和1.0～1.5ml溶胀剂均三甲苯，12～15℃下，加入4.0～5.0mlteos作为硅源，搅拌20～24h后，把混合溶液放入反应釜中，130～170℃下加热12h～5d，过滤，干燥，500～600℃下煅烧5～6h即得到介孔无机硅材料；

(2)青霉胺功能化亲水介孔硅材料的制备：将制备的介孔无机硅加入到50～70ml体积百分含量为10～20％的盐酸溶液中加热90～110℃，回流4～6h，过滤洗涤得到酸化的介孔无机硅；将酸化的介孔无机硅分散在20～40ml无水甲苯溶液中并加热45～60℃，搅拌下加入0.8～1.4ml的三乙胺反应30～45min后，再加入1.0～2.0ml二甲基乙烯基氯硅烷磁力搅拌10～14h，反应后用甲醇洗涤，即得到表面具有双键官能团的杂化介孔硅材料；随后对其进行亲水化修饰；

首先将500～700mg青霉胺和20～35mg的光引发剂2,2-二甲氧基-苯基苯乙酮(2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone，dmpa)溶解在30～50ml乙醇体积百分含量为40％～70％的水溶液中，得到修饰液；其次将获得的乙烯基功能化的杂体材料200～400mg平铺于直径为4～7cm的表面皿中，吸取10～15ml青霉胺修饰液于表面皿中，使材料完全浸没于溶液之中；然后将表面皿至于紫外灯下曝光10～30min；取出后用药勺搅动杂化材料，再添加10～15ml青霉胺修饰液；再次将表面皿至于紫外灯下曝光10～30min；用乙醇体积百分含量为40％～70％的水溶液洗涤所得到的材料3～5次，50～80℃真空干燥16～24h，得到青霉胺修饰的杂化材料。所述青霉胺功能化的亲水性介孔硅材料可用于复杂生物样品中糖肽的富集与分离。

本发明具有如下特点:

(1)制备方法操作简单、高效无毒，绿色环保。

(2)合成原材料易得、价格较便宜，适合大尺度制备。

附图说明

图1为介孔无机硅材料(a)和亲水性介孔硅材料制备的示意图(b)。

图2为介孔硅材料的扫描电镜图。a：实施例1；b：实施例2。

图3为青霉胺功能化的亲水性介孔硅材料的氮气吸附/脱附曲线和孔径分布图。a，b：实施例1；c，d：实施例2。

图4为无机介孔硅(a，c)和青霉胺功能化的亲水性介孔硅材料(b，d)的接触角图。a，b：实施例1；c，d：实施例2。

图5为亲水性介孔硅材料对人免疫球蛋白(igg)酶解液富集前后的质谱对比图。a，b，c：实施例1；d：实施例2。

图6为实施例1中亲水性介孔硅材料对人血清酶解液富集后的质谱图。

具体实施方式

实施例1青霉胺功能化亲水介孔硅材料用于糖肽的分离富集。(比表面积为114cm²/g，孔径16.4nm。)

青霉胺功能化亲水介孔硅材料的制备：

(1)无机介孔硅材料的制备：在50ml、2m盐酸溶液体系中加入1g模板剂f127和1.4ml溶胀剂三甲苯，14℃下，加入4.2mlteos作为硅源，搅拌24h后，把混合溶液转移到反应釜中，170℃下加热3d，过滤，干燥，550℃下煅烧5h即得到介孔无机硅；

(2)青霉胺功能化亲水介孔硅材料的制备：取上述步骤(1)制备的介孔无机硅加入到50ml体积百分含量为15％的盐酸溶液中加热100℃，回流5h，过滤洗涤得到酸化后的介孔无机硅；将酸化后的介孔无机硅分散在30ml无水甲苯溶液中并加热55℃，搅拌下加入1.0ml三乙胺反应35min后，再加入1.2ml二甲基乙烯基氯硅烷磁力搅拌12h，反应后用甲醇洗涤，即得到表面具有双键官能团的杂化介孔硅材料；随后对其进行亲水化修饰；

首先将600mg的青霉胺和30mg的光引发剂dmpa溶解在30ml乙醇体积百分含量为50％的水溶液中，得到修饰液；其次将获得的乙烯基功能化的杂体材料300mg平铺于直径为5cm的表面皿中，吸取10ml青霉胺修饰液于表面皿中，使材料完全浸没于溶液之中；然后将表面皿至于紫外灯下曝光30min；取出后用药勺搅动杂化材料，再添加15ml青霉胺修饰液；再次将表面皿至于紫外灯下曝光30min；用乙醇体积百分含量为50％的水溶液洗涤所得到的材料3次，60℃真空干燥20h，得到青霉胺修饰的杂化材料。

实施例2青霉胺功能化亲水介孔硅材料用于糖肽的分离富集。(比表面积为237cm²/g，孔径7.8nm。)

青霉胺功能化亲水介孔硅材料的制备：

(1)无机介孔硅材料的制备：在50ml、2m盐酸溶液体系中加入1g模板剂f127和1.4ml溶胀剂三甲苯，14℃下，加入4.2mlteos作为硅源，搅拌24h后，把混合溶液转移到反应釜中，130℃下加热3d，过滤，干燥，550℃下煅烧5h即得到介孔无机硅；

(2)青霉胺功能化亲水介孔硅材料的制备：按照与实施案例1中相似的修饰步骤对无机介孔硅材料进行亲水化修饰制备亲水介孔硅材料。

igg酶解样品的制备：首先将2mg人血清免疫球蛋白(humanimmunoglobuling，igg)溶解于含8m尿素的100mm碳酸氢铵缓冲液(ph＝8.3)中，然后用20μmoldtt在60℃时还原1h，再加入7.4mgiaa室温下避光反应40min。反应结束后，加入100mm碳酸氢铵缓冲液(ph＝8.3)将溶液中的尿素浓度稀释至1m，随后按照酶和底物的质量比为1:25的比例加入胰蛋白酶，37℃下反应16h。蛋白酶解液经tfa酸化后用自制的c18-spe柱除盐，冷冻干燥后置于-20℃下保存。

标准糖蛋白酶解液的富集：首先5mg青霉胺功能化的亲水介孔硅材料用200μl上样液(acn/h2o/tfa，85/14/1，v/v/v)洗两次，并加入200μl上样液(acn/h2o/tfa，85/14/1，v/v/v)和10μg的igg酶解液；然后在室温下轻微振荡孵育30min，离心弃去上清，再用上样液(200μl×3次)洗去材料上的非特异性吸附，最后用10μl洗脱液(acn/h2o/tfa，30/69/1，v/v/v)将材料上富集到的糖肽洗脱下来。所得洗脱液用maldi-tofms分析。

maldi-tofms分析：所有maldi-tofms分析实验均在5800飞行时间质谱仪(absciex,usa)上完成。该质谱仪配有脉冲nd/yag激光器，在正离子模式下的激发波长为355nm。样品制备采用dhb溶液(25g/l，h3po4/h2o/acn＝1/29/70，v/v/v)为基质，具体过程如下：取0.5μl样品点在madli靶上，待其完全干燥后，将0.5μldhb溶液覆盖在样品点上，自然干燥后送入质谱仪进行分析。

clc-ms/ms分析实验及数据库检索：所有的rplc-ms/ms实验均在ultimate3000rslcnanosystems(thermoscientific,usa)色谱-质谱联用仪上完成。该仪器配有四元纳升级别液相泵及ltqorbitrapvelos离子阱质谱检测系统(thermofisherscientific,sanjose,usa)。实验中使用含有0.1％fa(体积百分比)的水溶液为流动相a，含有0.1％fa(体积百分比)的乙腈溶液为流动相b。进样时，酶解液样品首先用流动相a以5μl/min的流速将酶解液样品注入一个实验室自制的c18硅胶微球(粒径为5μm，孔径12nm)填充的毛细管预柱中(3.0cm×200μmi.d)进行肽段捕捉，进样时间为5min。被捕捉到的肽段随后被流动相带入用c18硅胶微球(粒径3μm，孔径12nm)填充的分析柱(15.0cm×75μmi.d)中进行色谱分离。色谱分析梯度是：在2min内流动相b从0增加到5％(体积百分比)，接着在93min内流动相b从5％增加到35％，然后在8min内流动相b从35％增加到80％，最后100％流动相b保持10min。流速：550nl/min。数据采集软件为xcalibur2.1software(thermofisherscientific)工作站。质谱参数：数据采集模式为数据依赖模式；一级质谱全扫描范围为400～2000(m/z)，分辨率为70,000；取前20个最强离子峰破碎解离进行二级质谱扫描，归一化碰撞能量为27％；电喷雾电压为2.0kv；离子传输毛细管温度为250℃。

质谱数据分析：将xcalibur2.1工作站得到的“*.raw”文件经过proteomediscoverer(v1.2.0.208，thermo,sanjose，ca)软件转化成“*.mgf”f格式，再使用mascotdaemon(version2.5.1)蛋白鉴定软件工作站(matrixscience，london，uk)进行搜索鉴定。所使用数据库是从网站http://www.uniprot.org/.下载的人库uniprothumandatabase。糖肽的鉴定使用armonev2.0.软件工作站。母离子质量偏差容忍度设为20ppm，碎片离子质量偏差设为0.8da。酶切设为胰蛋白酶全酶切，最多两个漏切位点。半胱氨酸的碘乙酰化修饰设为固定修饰，甲硫氨酸的氧化修饰设为可变修饰；检索结果导出时设置打分门槛值为20，假阳性率(fdr)低于1％。

产物表征

扫面电镜图2显示，实施案例1和2所制备出的无机介孔硅材料均成六方形体状态，表面没有明显的大孔出现。

无机介孔硅材料的氮气吸附脱/附曲线如图3所示，实施案例1制备的无机硅材料(图3a、b)bet比表面积为114m²/g，孔体积为0.58cm³/g，平均孔径在16nm，表明在材料的孔道结构中含有丰富的介孔，但是其分布范围较宽。实施案例2制备的无机硅材料(图3c、d)，bet测试比表面积为237m²/g，孔体积为0.85cm³/g，平均孔径7.8nm，孔径分布范围较窄，说明其孔道分布更加均匀。这说明水热反应的温度对产物的孔道结构有非常重要的影响。降低反应温度可减小生成材料的介孔尺寸。

接触角测试结果如图4所示，实施案例1和2中无机介孔硅的水接触角分别为18.9°和39.4°(图4a、图4c)，经过青霉胺修饰后，分别降低到11.9°(图4b)和16.2°(图4d)，这说明青霉胺修饰的确可以增强材料的亲水性。

产物应用

采用标准蛋白igg酶解液为对象可以评价材料对糖肽的富集能力，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(maldi-tof-ms)进行检测。图5为igg酶解液富集前后的效果对比图。图5a显示，富集前，谱图中较强的信号峰绝大多数为非糖肽信号峰，糖肽的信号几乎都被抑制了，仅检测出一条明显的糖肽峰。用实施案例1材料富集后(图5b)，非糖肽信号峰明显减少，可以检测到21条典型的n-糖肽的信号峰。为了验证富集到的肽段均为糖肽，对这些肽段采用pngasef酶进行去糖基化处理。结果发现(图5c)，原图5b中的糖肽信号基本消失，仅能见到两条明显的肽段信号(eeqfnstfr，m/z＝1157.92；eeqynstyr，m/z＝1189.87)，这说明图5b中检测到的肽段均为糖肽。

表1实施例1亲水性介孔硅材料富集到的igg酶解液中糖肽的分子量及糖型组成

n#表示糖基化位点；hex:甘露糖；hexnac:n-乙酰葡糖胺；fuc:岩藻糖。

用实施例2中制备的亲水硅材料可以从igg酶解液中富集到14条糖肽(图5d)，低于同等条件下实施例1所制备的亲水材料的富集效果。

表2实施例2亲水性介孔硅材料富集到的igg酶解液中糖肽的分子量及糖型组成

将实施案例1制备的亲水材料进一步应用于复杂的生物样品-人血清酶解液中糖肽的深度富集，用nano-lc-ms/ms方法进行分析检测。具体是使用10mg吸附剂对240μg的人血清酶解液进行富集，然后在c18硅胶分析柱上进行分析检测。得到的色谱分离图如图6所示，通过对搜库结果的统计计算，总共鉴定到了来自132个蛋白的381条糖肽以及278个糖基化位点，表现出较强的对于n-糖肽的富集效率，该专利所采用的方法简单，成本低廉，适合大尺度制备。