本发明涉及化学物质的分离技术领域，具体涉及一种生鲜湿面褐变产物的分离方法。
背景技术：
生鲜湿面（指鲜面条）深受消费者喜欢，但是生鲜湿面的保质保鲜问题是其存储过程中的难题，在储存时生鲜湿面容易发生褐变和腐败变质，生鲜湿面制成后数个小时内便褐变严重。目前生鲜湿面多以作坊和面条铺的方式生产和销售，规模小，不宜监管，食品安全问题存在隐患；虽然大企业的生产管理好、质量控制好、监管体系健全，但是大型企业同样无法解决生鲜湿面褐变问题，无法达到其对长货架期的要求，生鲜湿面的褐变问题严重制约着大企业对生鲜湿面的开发、生产和销售。现有技术对生鲜湿面褐变产物的研究极少，针对生鲜湿面中褐变产物的提取、分离和纯化研究较少。
对生鲜湿面中的褐变产物进行提取、分离后得到褐变产物的组分，是对生鲜湿面褐变产物进行分子结构解析、明确褐变产物具体是什么化合物的基础，而根据分析出的化合物的分子结构，推理和模拟出其形成过程，并对此过程进行阻断或干扰，从而降低生鲜湿面褐变的程度，延长生鲜湿面的保质期，从而增加其货架期，更利于生鲜湿面的长时间存储，而从大规模生产。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种生鲜湿面褐变产物的分离方法。
本发明解决上述技术问题采用的技术方案为：
一种生鲜湿面褐变产物的分离方法，其包括以下步骤：
（1）褐变物的提取、纯化：经褐变反应后的生鲜湿面经微波提取工艺提取以及纯化工艺纯化后得到褐变物粗品；
（2）褐变物的一次分离确定：采用纤维素柱deae-52对步骤（1）得到的褐变物粗品进行分离，得到4个组分，将得到的组分采用葡聚糖凝胶柱g10进行进一步地分离，最终得到6种褐变组分。
进一步地，所述的生鲜湿面褐变产物的分离方法还包括褐变物的二次分离确定：采用硅胶柱层析技术对步骤（1）得到的褐变物粗品进行分离，经分离确定其中有6种褐变组分。
进一步地，步骤（1）中所述的微波提取工艺为：
（a）将褐变后的生鲜湿面避光晾干，粉碎为粒径＜125μm的粉状样品；
（b）将生鲜湿面粉碎后的粉状样品加入乙醇溶液（体积分数60%~90%）中，料液比为1:8~1:14，微波功率100~400w，微波时间2~5min，在以上参数下提取得到褐变产物粗提液；
（c）将步骤（b）得到的褐变产物粗提液于室温、5000~12000r/min转速下，离心15~30min，收集上清液；在真空条件下，将上清液置于20℃~40℃温度下浓缩去除提取液中的乙醇；再将剩余提取液在室温下以转速5000~12000r/min进行二次离心，时间为15~30min，收集上清液；在真空条件下，将二次离心收集的上清液于20℃~40℃温度下干燥去除溶液，最后收集到褐变物粗品。
进一步地，步骤（1）中所述的纯化工艺为：
（a）将微波提取工艺提取得到的褐变产物加入水中，再将正丁醇与氯仿混合溶液（1:1~1:7）加入水溶液中，振摇后静置1h，经过分液后收集水相，重复此过程4~10次；
（b）将褐变产物水溶液加入透析袋（截留分子量＞1000）中，将透析袋置于超纯水中，在30℃下，搅拌透析8~24h，收集渗出液，此步骤重复2~5次；
（c）将渗出液加入已处理好的大孔树脂柱（ab-8、dm130、lx-22和xda-7大孔树脂）中上样，再使用超纯水洗脱（3~6个柱体积），再使用乙醇溶液洗脱（50%~95%乙醇浓度），洗脱体积为1~5个柱体积（bv），流速控制为0.5~2bv/h，将流出的乙醇洗脱液通过真空蒸发，最后收集得到纯净的生鲜湿面褐变物粗品。
进一步地，所述的硅胶柱层析技术的分离参数为：硅胶粒度100~300目、径高比1:12~1:20、上样质量比为样品：硅胶=1:800~1:1600（g:g）、流速0.3~1.0bv/h，洗脱体系为分级洗脱（丙酮：水=1:0、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1）。
进一步地，所述的纤维素柱deae-52的分离参数为：径高比1:8~1:16、上样质量比为样品：硅胶=1:600~1:1200（g:g）、流速0.5~2.0bv/h，洗脱体系为纯水、0.1mol/l氯化钠溶液、0.2mol/l氯化钠溶液、0.3mol/l氯化钠溶液、0.4mol/l氯化钠溶液。
进一步地，所述的葡聚糖凝胶柱g10的分离参数为：径高比1:10~1:20、上样质量比为样品：硅胶=1:1000~1:1600（g:g）、流速0.5~3.0bv/h，洗脱溶液为纯水。
本发明提供了一种生鲜湿面褐变产物的分离方法，该技术方案通过生鲜湿面褐变产物的快速分离、纯化，得到褐变产物粗品，通过一次分离确定和二次分离确定的两次分离方法，确定褐变产物为6种褐变组分，得到的褐变组分可作为更深入解析褐变产物化合物组成的基础，并作为生鲜湿面褐变产物研究的基础原料，为揭示湿面褐变产物形成机理奠定基础。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1：一种生鲜湿面褐变产物的分离方法，其包括以下步骤：
（1）褐变物的提取、纯化：经褐变反应后的生鲜湿面经微波提取工艺提取以及纯化工艺纯化后得到褐变物粗品；
（2）褐变物的一次分离确定：采用纤维素柱deae-52对步骤（1）得到的褐变物粗品进行分离，得到4个组分，将得到的组分采用葡聚糖凝胶柱g10进行进一步地分离，最终得到6种褐变组分。
进一步地，所述的生鲜湿面褐变产物的分离方法还包括褐变物的二次分离确定：采用硅胶柱层析技术对步骤（1）得到的褐变物粗品进行分离，经分离确定其中有6种褐变组分。
进一步地，步骤（1）中所述的褐变反应为：在精制粉（小麦粉）中加入1%的食盐和34%的蒸馏水，经和面、熟化、压延、切条制成厚度为1mm的生鲜湿面，常温放置18-24h使其褐变。
进一步地，步骤（1）中所述的微波提取工艺为：
（a）将褐变后的生鲜湿面避光晾干，粉碎为粒径＜125μm的粉状样品；
（b）将生鲜湿面粉碎后的粉状样品加入体积分数75%的乙醇溶液中，料液比为1:10，微波功率250w，微波时间3min，在以上参数下提取得到褐变产物粗提液；
（c）在室温下，在10000r/min转速下，离心20min，收集上清液；在真空条件下，将上清液置于30℃温度下浓缩去除提取液中的乙醇；再将剩余提取液在室温下以转速10000r/min进行二次离心，时间为20min，收集上清液；在真空条件下，将二次离心收集的上清液于30℃温度下干燥去除溶液，最后收集得到的褐变物粗品。
进一步地，步骤（1）中所述的纯化工艺为：
（a）将微波提取工艺提取得到的褐变产物加入水中，再将正丁醇与氯仿混合溶液（1:4）加入水溶液中，振摇后静置1h，经过分液后收集水相，重复此过程7次；
（b）将褐变产物水溶液加入透析袋（截留分子量＞1000）中，将透析袋置于超纯水中，在30℃下，搅拌透析15h，收集渗出液，此步骤重复3次；
（c）将渗出液加入已处理好的大孔树脂柱（ab-8大孔树脂）中上样，再使用超纯水洗脱（5个柱体积），再使用乙醇溶液洗脱（70%乙醇浓度），洗脱体积为3个柱体积（bv），流速控制为1bv/h，将流出的乙醇洗脱液通过真空蒸发，最后收集得到纯净的生鲜湿面褐变物粗品。
进一步地，所述的硅胶柱层析技术的分离参数为：将褐变产物粗品溶解于50%丙酮水溶液中，在已处理好的硅胶柱中上样，硅胶柱参数为：硅胶粒度200~300目、径高比1:16、上样质量比为样品：硅胶=1:1200（g:g）、流速0.5bv/h，洗脱体系为分级洗脱（丙酮：水=1:0、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1），每个配比的洗脱液洗脱1个柱体积。流出液以10ml/管收集，测定流出液的铂钴指数，发现流出液谱图中有6种物质峰，分别编号为hb1号、hb2号、hb3号、hb4号、hb5号、hb6号6种组分，分别收集后，利用旋蒸将洗脱液蒸干，收集6种组分的粉状物质。
进一步地，所述的纤维素柱deae-52的分离参数为：将褐变产物粗品溶解于纯水中，在已处理好的deae-52纤维素柱上样，参数为：径高比1：14、上样质量比为样品：deae-52填料=1:1000（g:g）、流速1.0bv/h，洗脱体系为纯水、0.1mol/l氯化钠溶液、0.2mol/l氯化钠溶液、0.3mol/l氯化钠溶液、0.4mol/l氯化钠溶液。流出液以10ml/管收集，测定流出液的铂钴指数，发现各浓度的流出液洗脱出1个物质峰，分别收集，编号为a、b、c、d。
进一步地，所述的葡聚糖凝胶柱g10的分离参数为：在纤维素柱deae-52分离的基础上又使用g10葡聚糖凝胶柱对4个组分分别进行分离，参数为：径高比1:12、上样质量比为样品：硅胶=1:1200（g:g）、流速0.7bv/h，洗脱溶液为纯水。从组分b分离出组分b1和b2，从组分c中分理出组分c1和c2。对于最后得到6种组分，a、b1、b2、c1、c2、d。
实施例2：一种生鲜湿面褐变产物的分离方法，其包括以下步骤：
（1）褐变物的提取、纯化：褐变后的生鲜湿面经微波提取工艺提取以及纯化工艺纯化后得到褐变物粗品；
（2）褐变物的一次分离确定：采用纤维素柱deae-52对步骤（1）得到的褐变物粗品进行分离，得到4个组分，将得到的组分采用葡聚糖凝胶柱g10进行进一步地分离，最终得到6种褐变组分。
进一步地，所述的生鲜湿面褐变产物的分离方法还包括褐变物的二次分离确定：采用硅胶柱层析技术对步骤（1）得到的褐变物粗品进行分离，经分离确定其中有6种褐变组分。
进一步地，步骤（1）中所述的微波提取工艺为：
（a）将褐变后的生鲜湿面避光晾干，粉碎为粒径＜125μm的粉状样品；
（b）将生鲜湿面粉碎后的粉状样品加入体积分数60%的乙醇溶液中，料液比为1:8，微波功率100w，微波时间5min，在以上参数下提取得到褐变产物粗提液；
（c）在室温下，在5000r/min转速下，离心30min，收集上清液；在真空条件下，将上清液置于20℃℃温度下浓缩去除提取液中的乙醇；再将剩余提取液在室温下以转速12000r/min进行二次离心，时间为15min，收集上清液；在真空条件下，将二次离心收集的上清液于40℃温度下干燥去除溶液，最后收集到褐变物粗品。
进一步地，步骤（1）中所述的纯化工艺为同实施例1。
进一步地，所述的硅胶柱层析技术的分离参数为：硅胶粒度100~300目、径高比1:12、上样质量比为样品：硅胶=1:800（g:g）、流速0.3bv/h，洗脱体系为分级洗脱（丙酮：水=1:0、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1），每个配比的洗脱液洗脱1个柱体积。流出液以10ml/管收集，测定流出液的铂钴指数，发现流出液谱图中有6种物质峰，分别编号为hb1号、hb2号、hb3号、hb4号、hb5号、hb6号6种组分，分别收集后，利用旋蒸将洗脱液蒸干，收集6种组分的粉状物质。
进一步地，所述的纤维素柱deae-52的分离参数为：径高比1：8、上样质量比为样品：硅胶=1:600（g:g）、流速0.5bv/h，洗脱体系为纯水、0.1mol/l氯化钠溶液、0.2mol/l氯化钠溶液、0.3mol/l氯化钠溶液、0.4mol/l氯化钠溶液。流出液以10ml/管收集，测定流出液的铂钴指数，发现各浓度的流出液洗脱出1个物质峰，分别收集，编号为a、b、c、d。
进一步地，所述的葡聚糖凝胶柱g10的分离参数为：径高比1:10、上样质量比为样品：硅胶=1:1000（g:g）、流速0.5bv/h，洗脱溶液为纯水。从组分b分离出组分b1和b2，从组分c中分理出组分c1和c2。对于最后得到6种组分，a、b1、b2、c1、c2、d。
实施例3：一种生鲜湿面褐变产物的分离方法，其包括以下步骤：
（1）褐变物的提取、纯化：褐变后的生鲜湿面经微波提取工艺提取以及纯化工艺纯化后得到褐变物粗品；
（2）褐变物的一次分离确定：采用纤维素柱deae-52对步骤（1）得到的褐变物粗品进行分离，得到4个组分，将得到的组分采用葡聚糖凝胶柱g10进行进一步地分离，最终得到6种褐变组分。
进一步地，所述的生鲜湿面褐变产物的分离方法还包括褐变物的二次分离确定：采用硅胶柱层析技术对步骤（1）得到的褐变物粗品进行分离，经分离确定其中有6种褐变组分。
进一步地，步骤（1）中所述的微波提取工艺为：
（a）将褐变后的生鲜湿面避光晾干，粉碎为粒径＜125μm的粉状样品；
（b）将生鲜湿面粉碎后的粉状样品加入体积分数90%的乙醇溶液中，料液比为1:14，微波功率400w，微波时间2min，在以上参数下提取得到褐变产物粗提液；
（c）在室温下，在12000r/min转速下，离心15min，收集上清液；在真空条件下，将上清液置于40℃温度下浓缩去除提取液中的乙醇；再将剩余提取液在室温下以转速5000r/min进行二次离心，时间为30min，收集上清液；在真空条件下，将二次离心收集的上清液于20℃温度下干燥去除溶液，最后收集到褐变物粗品。
进一步地，步骤（1）中所述的纯化工艺为同实施例1。
进一步地，所述的硅胶柱层析技术的分离参数为：硅胶粒度100~300目、径高比1:20、上样质量比为样品：硅胶=1:1600（g:g）、流速0.3~1.0bv/h，洗脱体系为分级洗脱（丙酮：水=1:0、20:1、10:1、5:1、2:1、1:1），每个配比的洗脱液洗脱1个柱体积。流出液以10ml/管收集，测定流出液的铂钴指数，发现流出液谱图中有6种物质峰，分别编号为hb1号、hb2号、hb3号、hb4号、hb5号、hb6号6种组分，分别收集后，利用旋蒸将洗脱液蒸干，收集6种组分的粉状物质。
进一步地，所述的纤维素柱deae-52的分离参数为：径高比1:16、上样质量比为样品：硅胶=1:1200（g:g）、流速2.0bv/h，洗脱体系为纯水、0.1mol/l氯化钠溶液、0.2mol/l氯化钠溶液、0.3mol/l氯化钠溶液、0.4mol/l氯化钠溶液。流出液以10ml/管收集，测定流出液的铂钴指数，发现各浓度的流出液洗脱出1个物质峰，分别收集，编号为a、b、c、d。
进一步地，所述的葡聚糖凝胶柱g10的分离参数为：径高比1:20、上样质量比为样品：硅胶=1:1600（g:g）、流速3.0bv/h，洗脱溶液为纯水。从组分b分离出组分b1和b2，从组分c中分理出组分c1和c2。对于最后得到6种组分，a、b1、b2、c1、c2、d。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。