制备多肽步骤中色谱固定相的再生方法与流程

本发明涉及色谱纯化领域。更具体的说，本发明涉及再生色谱固定相的方法。
背景技术：
：多肽药物已被应用于多种疾病如糖尿病和肿瘤等的治疗，批准的多肽药物包括胰岛素及其突变体、利拉鲁肽、索玛鲁肽、艾塞那肽、戈舍瑞林、亮丙瑞林等，这些药物的全球市场销售额超过100亿美元，在改善患者的生活质量和提高患者健康方面发挥着重要作用。由于天然的多肽药物一般半衰期较短，因此一般需要通过化学修饰等技术手段改善其药理特定，例如典型的变体为酰胺、糖类、烷基、酰基、酯、聚乙二醇化等修饰，相关的技术报道可参考wo96/29342、wo98/08871、wo99/43708、wo00/34331、wo00/69911、cn97198413.1和cn200680006674.6等。多肽药物在制备过程中，由于其分子量较普通蛋白质要小一些，因此纯化的整个过程中经常用到多步纯化法。其中，反相高压色谱法(rp-hplc)是工业上分离多肽的优选方法，而且该方法已被证明对于大规模纯化多种多肽是通用的。同时，只有高纯度的多肽样品才能满足治疗的需要，以避免在对患者施用时引起不良事件。生产过程中需要应用反相色谱纯化来达到制备高纯度多肽的目的，随着循环次数的增加，色谱柱分离效能会逐渐降低，这是由于一些沉积物在色谱柱中逐渐积累所引起的，导致多次循环后色谱柱纯化效果逐渐降低，产物纯度和收率逐渐下降。然而，色谱固定相非常昂贵，频繁更换色谱固定相无疑会大量增加生产成本，所以需要对色谱固定相进行再生，以提高反复利用度。而大规模生产高纯度多肽的经济性，对于多肽产品的商业化和现有疗法的推广具有关键性的作用。wo00/61493中公开了再生多种来源的粒状物质(黏土、砂、二氧化硅等)的方法。它是一种5步法，包括：将所述物质与a)有机物质提取，b)氧化剂接触，随后与c)酸溶液接触，d)将物料加热以及e)回收所述物质。可见，该酸性溶液再生色谱固定相的方法非常复杂，而且再生溶液需要在色谱柱外与固定相接触，由于操作繁琐，不适合大规模的工业化应用。cn200480009293.4中公开了采用较纯的甲酸(含水量低于1％的甲酸溶液)作为再生溶液再生色谱固定相。但是，纯甲酸属于易挥发性强酸，具有极强的腐蚀性，因此，纯甲酸存在生产设备腐蚀风险和安全风险。当然，也有研究用苛性碱溶液再生色谱固定相，例如0.1摩尔氢氧化钠(videliliedahl，“致力于肽的基于二氧化硅的hplc纯化的十二年”，tides2000，2000年5月10日，lasvegas，usa)。该再生方法可将用于纯化胰岛素的二氧化硅的使用寿命增大至100～600次循环。但是，二氧化硅物质暴露于苛性碱条件下时不稳定，特别是取代的二氧化硅物质可能不适合通过苛性碱溶液再生。由于现有色谱固定相再生方法的不足，以及色谱固定相的昂贵价格，为了降低大规模工业化生产高纯度多肽的生产成本和操作难度，开发一种操作简单，安全，不破坏色谱柱固定相，且适用于工业化应用的色谱固定相再生方法是十分必要的。技术实现要素：本发明的一个目的是提供一种适用于工业化应用的色谱固定相再生方法，通过色谱固定相与再生溶液接触来恢复色谱固定相的性能，操作简单、安全且经济有效。本发明提供了一种再生色谱固定相的方法，其中所述色谱固定相与含有至少一种弱碱、一种有机溶剂和少于70％(v/v)的水的再生溶液接触。所述弱碱是再生方法中至关重要的条件，在没有弱碱的情况下，无法达到再生的目的。本发明的一个实施方案中，所述弱碱包括氨水、碳酸盐、diea等铵类化合物，优选为氨水。本发明的一个实施方案中，所述弱碱浓度为0.1-2％(v/v)，优选为0.2-1.5％，更优选为0.5-1.5％，更优选为0.8-1.2％，更优选为1％。一定比例的有机溶剂是再生方法中的重要参数，洗脱后残留在色谱柱中的残留物多为疏水性较强的物质，再生溶液中含有一定比例的有机溶剂可以增强残留物的溶解度，并减少残留物在色谱柱中保留。本发明的一个实施方案中，所述有机溶剂包括乙腈、乙醇、甲醇、异丙醇等，优选乙腈。另一个实施方案中，所述有机溶剂浓度为30％-70％(v/v)，优选为35％-65％，更优选为40％-60％，更优选为45％-55％，最优选为50％。在另一个实施方案中，所述再生液中的水含量少于70％(v/v)，更优选少于65％、60％、55％或者50％。在另一个优选实施方案中，所述弱碱为氨水，而且所述有机溶剂为乙腈。在另一个实施方案中，所述弱碱为0.1-2％(v/v)的氨水，而且所述有机溶剂为30％-70％(v/v)的乙腈。在另一个实施方案中，所述再生液的ph范围为9-12，优选为9.5-11.5，更优选为10-11，最优选ph为11。在另一个实施方案中，本发明提供了一种再生色谱固定相的方法，其中所述色谱固定相与再生溶液接触，其中所述的再生溶液含有0.1-2％(v/v)的氨水，30％-70％(v/v)的乙腈和少于70％(v/v)的水，溶液的ph为范围为9-12。在另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种再生色谱固定相的方法，其中所述色谱固定相与再生溶液接触，其中所述的再生溶液含有0.2-1.5％(v/v)的氨水，35％-65％(v/v)的乙腈和少于65％(v/v)的水，溶液的ph为范围为9.5-11.5。在另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种再生色谱固定相的方法，其中所述色谱固定相与再生溶液接触，其中所述的再生溶液含有0.5-1.5％(v/v)的氨水，40％-60％(v/v)的乙腈和少于60％(v/v)的水，溶液的ph为范围为10-11。在另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种再生色谱固定相的方法，其中所述色谱固定相与再生溶液接触，其中所述的再生溶液含有0.8-1.2％(v/v)的氨水，45％-55％(v/v)的乙腈和少于55％(v/v)的水，溶液的ph为范围为10-11。在另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种再生色谱固定相的方法，其中所述色谱固定相与再生溶液接触，其中所述的再生溶液含有1％(v/v)的氨水，50(v/v)的乙腈和少于50％(v/v)的水，溶液的ph为范围为10。在又一个实施方案中，所述色谱固定相与再生溶液优选在色谱柱内接触。这样，因与再生步骤相关的停车时间而损失的生产能力最小。所以，不用再次填充色谱柱就可以进行再生色谱固定相的操作。在另一个实施方案中，在所述再生过程中流化色谱固定相。在另一个实施方案中，将所述色谱固定相与所述再生溶液接触之前用水溶性有机溶剂替换色谱洗脱剂或平衡缓冲液。优选地，所述水溶性有机溶剂也存在于色谱洗脱剂或平衡缓冲液内。更优选地，所述水溶性有机溶剂也存在于再生溶液内。本发明的另一个实施方案中，所述色谱固定相与再生液接触是指在常规色谱方案中通过色谱柱洗脱产品后，走再生液达到恢复色谱柱性能的目的，再生液体积为0.5-2个柱体积。在另一个实施方案中，所述色谱固定相是rp-hplc基体。用于rp-hplc的色谱固定相是机械上很刚性的物质，它们可能是二氧化硅或取代的二氧化硅，例如c4、c6、c8、c10、c12、c16、c18、c30或苯基二氧化硅。用作色谱固定相的适当二氧化硅材料是球形颗粒，它具有窄孔径分布而且粒径在3μm-100μm，应用的孔径在对于压力稳定的聚合材料来说，孔径为或更高。在另一个实施方案中，用于rp-hplc的色谱固定相是压力稳定的取代或未取代的聚合材料，所述压力稳定的聚合材料是source30q或xad1180。生产规模色谱柱通常具有15-100cm的直径，而且这类体系可能具有动态轴向压缩。对于少量多肽的生产来说，生产柱可能具有例如15cm、20cm或25cm的直径。对于大量多肽的生产来说，生产柱可能具有例如40cm、60cm、80cm或更大的直径。在再生色谱固定相方法的一个实施方案中，将所述色谱固定相与所述再生溶液接触至少1秒，优选至少1分钟，更优选至少5分钟，例如1分钟-24小时，1分钟-5小时，1分钟-2小时，1分钟-60分钟，5分钟-30分钟。在再生色谱固定相方法的另一个实施方案中，所述色谱固定相与所述再生溶液的接触是在约5℃-60℃，例如10℃-50℃，例如15℃-45℃，或者18℃-30℃范围内的温度下进行的。在再生色谱固定相方法的另一个实施方案中，所述色谱固定相的使用寿命是至少500次色谱循环，优选至少700次色谱循环，更优选至少1000次色谱循环，最优选至少2000次色谱循环。在再生色谱固定相方法的另一个实施方案中，对于每次色谱循环都将所述方法应用于所述色谱固定相，每2次色谱循环至少应用一次，每5次色谱循环至少应用一次，每10次色谱循环至少应用一次，每20次色谱循环至少应用一次，每50次色谱循环至少应用一次，或者每100次色谱循环至少应用一次。在本发明的另一个实施方案中，对色谱固定相进行再生操作的次数是至少25次，至少50次，至少100次，至少200次，至少400次或者至少1000次。本发明另一发明目的是提供一种生产治疗用多肽或其前体的方法，所述方法包括至少一步色谱处理步骤，该步骤中，通过上述再生方法再生色谱固定相。因此，本发明提供一种生产治疗用多肽或其前体的方法，它包括至少一个色谱处理步骤，其中通过一种再生色谱固定相的方法将色谱固定相再生，其中，在5℃～60℃范围内的温度下，将所述色谱固定相与含有至少一种弱碱、一种有机溶剂和少于70％(v/v)的水的再生溶液接触；其中，所述治疗用多肽选自酰化的glp-1或酰化的glp-1类似物。在本发明的一个实施方案中，所述酰化的glp-1或酰化的glp-1类似物具体可参考cn97198413.1和cn200680006674.6中列举的各种类型的酰化glp-1类似物。所述的酰化定义为亲脂性取代基连接到glp-1多肽或其类似物的n-末端或c-末端氨基酸残基上。亲脂性取代基具体可参考中国专利cn97198413.1和cn200680006674.6中列举的那些。连接到glp-1部分的亲脂性取代基优选含有4-40个碳原子，尤其是8-25个碳原子。该亲脂性取代基可以通过其羧基和与之相连的氨基酸残基的氨基形成酰胺键而连接到glp-1部分的氨基上。或选择地，该亲脂性取代基可以通过其氨基和所述氨基酸残基的羧基形成酰胺键而连接到该氨基酸残基上。作为另外一种选择，该亲脂性取代基可以通过酯键而连接到glp-1部分。或者，该亲脂性取代基通过一个间隔基团的一个羧基与glp-1部分的一个氨基形成酰胺键，从而连接到glp-1部分。适宜的间隔基团的例子有琥珀酸、lys、glu、asp或gly-lys的二肽。更优选的，用于被酰化的glp-1多肽或其类似物可选自glp-1(7-37)，glp-1(8-37)，glp-1(9-37)，glp-1(10-37)，glp-1(11-37)，glp-1(12-37)，glp-1(13-37)，glp-1(14-37)，glp-1(15-37)或glp-1多肽类似物，包括：arg34-glp-1(7-37)，arg26-glp-1(7-37)，lys36-glp-1(7-37)，arg26,34lys38-glp-1(7-38)，arg26,34lys39-glp-1(7-39)，arg26,34lys40-glp-1(7-40)，arg26lys36-glp-1(7-37)，arg34lys36-glp-1(7-37)，arg26lys39-glp-1(7-39)，arg34lys40-glp-1(7-40)，arg26,34lys36,39-glp-1(7-39)，arg26,34lys36,40-glp-1(7-40)，gly8arg26-glp-1(7-37)，gly8arg34-glp-1(7-37)，gly8lys36-glp-1(7-37)，gly8arg26,34lys36-glp-1(7-37)，gly8arg26,34lys39-glp-1(7-39)，gly8arg26,34lys40-glp-1(7-40)，gly8arg26lys36-glp-1(7-37)，gly8arg34lys36-glp-1(7-37)，gly8arg26lys39-glp-1(7-39)，gly8arg34lys40-glp-1(7-40)，gly8arg26,34lys36,39-glp-1(7-39)，gly8arg26,34lys36,40-glp-1(7-40)，arg26,34lys38-glp-1(7-38)，arg26,34lys39-glp-1(7-39)，arg26,34lys40-glp-1(7-40)，arg26,34lys41-glp-1(7-41)，arg26,34lys42-glp-1(7-42)，arg26,34lys43-glp-1(7-43)，arg26,34lys44-glp-1(7-44)，arg26,34lys45-glp-1(7-45)，arg26,34lys38-glp-1(1-38)，arg26,34lys39-glp-1(1-39)，arg26,34lys40-glp-1(1-40)，arg26,34lys41-glp-1(1-41)，arg26,34lys42-glp-1(1-42)，arg26,34lys43-glp-1(1-43)，arg26,34lys44-glp-1(1-44)，arg26,34lys45-glp-1(1-45)，arg26,34lys38-glp-1(2-38)，arg26,34lys39-glp-1(2-39)，arg26,34lys40-glp-1(2-40)，arg26,34lys41-glp-1(2-41)，arg26,34lys42-glp-1(2-42)，arg26,34lys43-glp-1(2-43)，arg26,34lys44-glp-1(2-44)，arg26,34lys45-glp-1(2-45)，arg26,34lys38-glp-1(3-38)，arg26,34lys39-glp-1(3-39)，arg26,34lys40-glp-1(3-40)，arg26,34lys41-glp-1(3-41)，arg26,34lys42-glp-1(3-42)，arg26,34lys43-glp-1(3-43)，arg26,34lys44-glp-1(3-44)，arg26,34lys45-glp-1(3-45)，arg26,34lys38-glp-1(4-38)，arg26,34lys39-glp-1(4-39)，arg26,34lys40-glp-1(4-40)，arg26,34lys41-glp-1(4-41)，arg26,34lys42-glp-1(4-42)，arg26,34lys43-glp-1(4-43)，arg26,34lys44-glp-1(4-44)，arg26,34lys45-glp-1(4-45)，arg26,34lys38-glp-1(5-38)，arg26,34lys39-glp-1(5-39)，arg26,34lys40-glp-1(5-40)，arg26,34lys41-glp-1(5-41)，arg26,34lys42-glp-1(5-42)，arg26,34lys43-glp-1(5-43)，arg26,34lys44-glp-1(5-44)，arg26,34lys45-glp-1(5-45)，arg26,34lys38-glp-1(6-38)，arg26,34lys39-glp-1(6-39)，arg26,34lys40-glp-1(6-40)，arg26,34lys41-glp-1(6-41)，arg26,34lys42-glp-1(6-42)，arg26,34lys43-glp-1(6-43)，arg26,34lys44-glp-1(6-44)，arg26,34lys45-glp-1(6-45)，arg26lys38-glp-1(1-38)，arg34lys38-glp-1(1-38)，arg26,34lys36,38-glp-1(1-38)，arg26lys38-glp-1(7-38)，arg34lys38-glp-1(7-38)，arg26,34lys36,38-glp-1(7-38)，aib8,arg34-glp-1(7-37)，aib8,22,arg34-glp-1(7-37)，arg26,34lys38-glp-1(7-38)，arg26lys39-glp-1(1-39)，arg34lys39-glp-1(1-39)，arg26,34lys36,39-glp-1(1-39)，arg26lys39-glp-1(7-39)，arg34lys39-glp-1(7-39)或arg26,34lys36,39-glp-1(7-39)。更为优选的，所述的酰化的glp-1或酰化的glp-1类似物选自利拉鲁肽(liraglutide)或者索玛鲁肽(semagutide)。cn200580038571.3曾报道利拉鲁肽药物制剂溶液在长期保持时易形成原纤维，需要通过加热方法处理，该方法通过加热ph范围8.0-10.0的利拉鲁肽溶液至50℃和80℃，时间为3分钟到120分钟，可以使利拉鲁肽制剂稳定性提高。而本申请发明人通过大量实验意外发现，酰化的glp-1或酰化的glp-1类似物如利拉鲁肽或索玛鲁肽在生产纯化过程中，在低ph条件下容易形成原纤维聚集，特别是在酸性条件下会形成高聚物，所述的高聚物在纯化时会沉积在色谱固定相上，长期积累会使色谱固定相纯化性能下降。但对于未经修饰的glp-1多肽或其类似物来说，高聚物的形成并不明显，这有可能是连接到glp-1部分的亲脂性取代基所带来的影响所致。对于这种沉积在色谱固定相的污染物，cn200480009293.4曾公开了采用较纯的甲酸(含水量低于1％的甲酸溶液)作为再生溶液再生色谱固定相。但纯甲酸属于易挥发性强酸，具有极强的腐蚀性，而且纯甲酸存在生产设备腐蚀风险和安全风险。另外一种方法是用碱性溶液再生色谱固定相，但二氧化硅物质暴露于苛性碱条件下时不稳定，特别是取代的二氧化硅物质可能不适合通过强碱性溶液再生。而本申请发明人通过大量实验意外发现，上述的高聚物污染物主要是产品在酸性条件中形成，在弱碱条件下即可破坏高聚体，从而减小污染物的疏水性，从而有利于与色谱固定相在弱碱性条件下再生。这一发现显然是出乎意料的，因为发明人通过实验证明弱碱条件下的再生过程不会破坏色谱固定相，而且可以使色谱固定相恢复到污染前的性能状态，这显然是对于先前本领域所公认的碱性条件会破坏色谱固定相材料结构的认知的一种纠偏。在本发明的另一个实施方案中，本发明提供了一种生产治疗用多肽或其前体的方法，所述方法中再生色谱固定相的具体工艺参数如前所述。如前所述，本发明提供了以下的技术方案：1、一种再生色谱固定相的方法，其中所述色谱固定相与含有至少一种弱碱、一种有机溶剂和少于70％(v/v)的水的再生溶液接触。2、根据技术方案1所述的方法，其特征在于：所述弱碱包括氨水、碳酸盐、diea等铵类化合物。3、根据技术方案2所述的方法，其特征在于：所述弱碱为氨水。4、根据技术方案2所述的方法，其特征在于：所述弱碱浓度为0.1-2％(v/v)、0.2-1.5％(v/v)、0.5-1.5％(v/v)、0.8-1.2％(v/v)或1％(v/v)。5、根据技术方案1所述的方法，其特征在于：所述有机溶剂包括乙腈、乙醇、甲醇或异丙醇。6、根据技术方案5所述的方法，其特征在于：所述有机溶剂为乙腈。7、根据技术方案5所述的方法，其特征在于：所述有机溶剂浓度为30％-70％(v/v)、35％-65％(v/v)、40％-60％(v/v)、45％-55％(v/v)，或50％(v/v)。8、根据技术方案1所述的方法，其特征在于：所述再生液中的水含量少于65％(v/v)、60％(v/v)、55％(v/v)或者50％(v/v)。9、根据技术方案1所述的方法，其特征在于：再生液中弱碱为氨水，所述有机溶剂为乙腈。10、根据技术方案9所述的方法，其特征在于：再生液中弱碱为0.1-2％(v/v)的氨水，所述有机溶剂为30％-70％(v/v)的乙腈。11、根据技术方案1所述的方法，其特征在于：所述再生液的ph范围为9-12、9.5-11.5、10-11或ph为11。12、一种再生色谱固定相的方法，其中所述色谱固定相与再生溶液接触，其中所述的再生溶液含有0.1-2％(v/v)的氨水，30％-70％(v/v)的乙腈和少于70％(v/v)的水，溶液的ph为范围为9-12。13、根据技术方案12所述的方法，其特征在于，其中所述的再生溶液含有0.2-1.5％(v/v)的氨水，35％-65％(v/v)的乙腈和少于65％(v/v)的水，溶液的ph为范围为9.5-11.5。14、根据技术方案13所述的方法，其特征在于，其中所述的再生溶液含有0.5-1.5％(v/v)的氨水，40％-60％(v/v)的乙腈和少于60％(v/v)的水，溶液的ph为范围为10-11。15、根据技术方案14所述的方法，其特征在于，其中所述的再生溶液含有0.8-1.2％(v/v)的氨水，45％-55％(v/v)的乙腈和少于55％(v/v)的水，溶液的ph为范围为10-11。16、根据技术方案15所述的方法，其特征在于，其中所述的再生溶液含有1％(v/v)的氨水，50(v/v)的乙腈和少于50％(v/v)的水，溶液的ph为范围为10。17、根据技术方案1-16任一项所述的方法，其特征在于，所述色谱固定相与再生液接触是指在常规色谱方案中通过色谱柱洗脱产品后，走再生液达到恢复色谱柱性能的目的，再生液体积为0.5-2个柱体积。18、根据技术方案1-16任一项所述的方法，其特征在于，所述色谱固定相是rp-hplc基体。19、根据技术方案18所述的方法，其特征在于，用于rp-hplc的色谱固定相是二氧化硅或取代的二氧化硅，如c4、c6、c8、c10、c12、c16、c18、c30或苯基二氧化硅。20、根据技术方案19所述的方法，其特征在于，用于rp-hplc的色谱固定相source30q或xad1180。21、根据技术方案1-16任一项所述的方法，其特征在于，将所述色谱固定相与所述再生溶液接触至少1秒、至少1分钟、至少5分钟、1分钟-24小时、1分钟-5小时、1分钟-2小时、1分钟-60分钟或5分钟-30分钟。22、根据技术方案1-16任一项所述的方法，其特征在于，所述色谱固定相与所述再生溶液的接触是在约5℃-60℃、10℃-50℃、15℃-45℃或者18℃-30℃范围内的温度下进行的。23、根据技术方案1-16任一项所述的方法，其特征在于，所述色谱固定相的使用寿命是至少500次色谱循环、至少700次色谱循环、至少1000次色谱循环或至少2000次色谱循环。24、根据技术方案1-16任一项所述的方法，其特征在于，对于每次色谱循环都将所述方法应用于所述色谱固定相，每2次色谱循环至少应用一次，每5次色谱循环至少应用一次，每10次色谱循环至少应用一次，每20次色谱循环至少应用一次，每50次色谱循环至少应用一次，或者每100次色谱循环至少应用一次。25、根据技术方案1-16任一项所述的方法，其特征在于，对色谱固定相进行再生操作的次数是至少25次，至少50次，至少100次，至少200次，至少400次或者至少1000次。26、一种生产治疗用多肽或其前体的方法，包括至少一个色谱处理步骤，其中通过一种再生色谱固定相的方法将色谱固定相再生，其中，在5℃～60℃范围内的温度下，将所述色谱固定相与含有至少一种弱碱、一种有机溶剂和少于70％(v/v)的水的再生溶液接触；其中，所述治疗用多肽选自酰化的glp-1或酰化的glp-1类似物。27、根据技术方案26所述的方法，其特征在于，所述的酰化定义为亲脂性取代基连接到glp-1多肽或其类似物的n-末端或c-末端氨基酸残基上。28、根据技术方案27所述的方法，其特征在于，亲脂性取代基含有4-40个碳原子。29、根据技术方案28所述的方法，其特征在于，亲脂性取代基含有8-25个碳原子。30、根据技术方案27所述的方法，其特征在于，亲脂性取代基通过其羧基和与之相连的氨基酸残基的氨基形成酰胺键而连接到glp-1部分的氨基上；或通过其氨基和所述氨基酸残基的羧基形成酰胺键而连接到该氨基酸残基上；或通过酯键而连接到glp-1部分；或通过一个间隔基团的一个羧基与glp-1部分的一个氨基形成酰胺键，从而连接到glp-1部分，适宜的间隔基团为琥珀酸、lys、glu、asp或gly-lys的二肽。31、根据技术方案26所述的方法，其特征在于，用于被酰化的glp-1多肽或其类似物选自glp-1(7-37)，glp-1(8-37)，glp-1(9-37)，glp-1(10-37)，glp-1(11-37)，glp-1(12-37)，glp-1(13-37)，glp-1(14-37)，glp-1(15-37)或glp-1多肽类似物，包括：arg34-glp-1(7-37)，arg26-glp-1(7-37)，lys36-glp-1(7-37)，arg26,34lys38-glp-1(7-38)，arg26,34lys39-glp-1(7-39)，arg26,34lys40-glp-1(7-40)，arg26lys36-glp-1(7-37)，arg34lys36-glp-1(7-37)，arg26lys39-glp-1(7-39)，arg34lys40-glp-1(7-40)，arg26,34lys36,39-glp-1(7-39)，arg26,34lys36,40-glp-1(7-40)，gly8arg26-glp-1(7-37)，gly8arg34-glp-1(7-37)，gly8lys36-glp-1(7-37)，gly8arg26,34lys36-glp-1(7-37)，gly8arg26,34lys39-glp-1(7-39)，gly8arg26,34lys40-glp-1(7-40)，gly8arg26lys36-glp-1(7-37)，gly8arg34lys36-glp-1(7-37)，gly8arg26lys39-glp-1(7-39)，gly8arg34lys40-glp-1(7-40)，gly8arg26,34lys36,39-glp-1(7-39)，gly8arg26,34lys36,40-glp-1(7-40)，arg26,34lys38-glp-1(7-38)，arg26,34lys39-glp-1(7-39)，arg26,34lys40-glp-1(7-40)，arg26,34lys41-glp-1(7-41)，arg26,34lys42-glp-1(7-42)，arg26,34lys43-glp-1(7-43)，arg26,34lys44-glp-1(7-44)，arg26,34lys45-glp-1(7-45)，arg26,34lys38-glp-1(1-38)，arg26,34lys39-glp-1(1-39)，arg26,34lys40-glp-1(1-40)，arg26,34lys41-glp-1(1-41)，arg26,34lys42-glp-1(1-42)，arg26,34lys43-glp-1(1-43)，arg26,34lys44-glp-1(1-44)，arg26,34lys45-glp-1(1-45)，arg26,34lys38-glp-1(2-38)，arg26,34lys39-glp-1(2-39)，arg26,34lys40-glp-1(2-40)，arg26,34lys41-glp-1(2-41)，arg26,34lys42-glp-1(2-42)，arg26,34lys43-glp-1(2-43)，arg26,34lys44-glp-1(2-44)，arg26,34lys45-glp-1(2-45)，arg26,34lys38-glp-1(3-38)，arg26,34lys39-glp-1(3-39)，arg26,34lys40-glp-1(3-40)，arg26,34lys41-glp-1(3-41)，arg26,34lys42-glp-1(3-42)，arg26,34lys43-glp-1(3-43)，arg26,34lys44-glp-1(3-44)，arg26,34lys45-glp-1(3-45)，arg26,34lys38-glp-1(4-38)，arg26,34lys39-glp-1(4-39)，arg26,34lys40-glp-1(4-40)，arg26,34lys41-glp-1(4-41)，arg26,34lys42-glp-1(4-42)，arg26,34lys43-glp-1(4-43)，arg26,34lys44-glp-1(4-44)，arg26,34lys45-glp-1(4-45)，arg26,34lys38-glp-1(5-38)，arg26,34lys39-glp-1(5-39)，arg26,34lys40-glp-1(5-40)，arg26,34lys41-glp-1(5-41)，arg26,34lys42-glp-1(5-42)，arg26,34lys43-glp-1(5-43)，arg26,34lys44-glp-1(5-44)，arg26,34lys45-glp-1(5-45)，arg26,34lys38-glp-1(6-38)，arg26,34lys39-glp-1(6-39)，arg26,34lys40-glp-1(6-40)，arg26,34lys41-glp-1(6-41)，arg26,34lys42-glp-1(6-42)，arg26,34lys43-glp-1(6-43)，arg26,34lys44-glp-1(6-44)，arg26,34lys45-glp-1(6-45)，arg26lys38-glp-1(1-38)，arg34lys38-glp-1(1-38)，arg26,34lys36,38-glp-1(1-38)，arg26lys38-glp-1(7-38)，arg34lys38-glp-1(7-38)，arg26,34lys36,38-glp-1(7-38)，aib8,arg34-glp-1(7-37)，aib8,22,arg34-glp-1(7-37)，arg26,34lys38-glp-1(7-38)，arg26lys39-glp-1(1-39)，arg34lys39-glp-1(1-39)，arg26,34lys36,39-glp-1(1-39)，arg26lys39-glp-1(7-39)，arg34lys39-glp-1(7-39)或arg26,34lys36,39-glp-1(7-39)。32、根据技术方案26所述的方法，其特征在于，所述的酰化的glp-1或酰化的glp-1类似物选自利拉鲁肽(liraglutide)或者索玛鲁肽(semagutide)。33、根据技术方案26所述的方法，其特征在于，所述色谱固定相与含有至少一种弱碱、一种有机溶剂和少于70％(v/v)的水的再生溶液接触，再生条件根据技术方案1-25任一项所述的方法进行。本发明的色谱固定相再生方法，实现了在色谱纯化循环内完成色谱固定相的再生，使色谱柱再生后就可以进行下一个纯化循环，使多个纯化循环可以连续进行。同时，再生后的色谱柱也可以恢复到污染前的性能状态，使生产的产品纯度和得率稳定。此再生方法操作简单、安全，再生效果好，不破坏色谱固定相，适用于工业化大规模生产高纯度的多肽。附图说明图1表示新色谱柱与污染色谱柱测试图谱图2表示两种再生液冲洗图谱图3表示污染色谱柱再生后与新色谱柱测试图谱具体实施方式结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述。材料：利拉鲁肽(arg34lys26-(n-ε-(γ-glu(n-α-十六酰基)))-glp-1)粗品：杭州九源基因工程有限公司提供；乙腈采购于merck，批号i635730216；氨水采购于j.t.baker，批号j29028；反相硅胶柱kromasil公司提供，规格100-10-c84.6×250mm；仪器：agilenthplc1100；uv-2550紫外-可见分光光度计；柱子型号：kromasilc84.6×250mm；实施例1新色谱柱与污染色谱柱进样利拉鲁肽进行色谱纯化分离测试被污染色谱柱指新色谱柱经过多循环纯化，未用本发明方法再生色谱柱。实施过程如下：平衡缓冲液(0.1％tfa和20％乙腈体积比的水溶液)反相平衡色谱柱1个柱体积溶液；自动进样器进样利拉鲁肽粗品；平衡缓冲液(0.1％tfa和20％乙腈体积比的水溶液)平衡一个柱体积溶液；洗脱液用含0.1％tfa和乙腈的水溶液洗脱。其中乙腈用20个柱体积从35％升到50％比例梯度洗脱样品。从附图1中可以看出，新旧反相色谱柱在色谱峰形上存在很大差异。新反相色谱柱峰形窄高，旧色谱柱峰形宽矮。实施例2不同组分再生液清洗污染反相色谱填料测试实施过程如下：配制含不同比例氨水再生液a、b、c、d(见表1)，等量的四份实施例1中污染的反相色谱填料，分别加入再生液a、b、c、d。摇床上摇晃30min后取上清用紫外分光光度计检测吸收值。吸收值越高，反相色谱填料中污染物迁移到再生液中越多，该再生液清洗效果越好。检测结果见表1。表1不同比例氨水清洗效果再生液吸收值a：0.1％氨水+50％乙腈+49.9％水2.230b：0.5％氨水+50％乙腈+49.5％水2.839c：1％氨水+50％乙腈+49％水3.053d：2％氨水+50％乙腈+48％水3.148每组样品检测所选对照液均为该组再生液，以保证检测数据可靠。结果表明，氨水从0.1％增加到1％，吸收值变化快，说明清洗效果明显变好；再增加到2％，吸收值变化慢，效果增加不明显。实施例3再生液组分的确定将实施例1中污染反相色谱柱先用实施例2中c再生液冲洗，待完全出峰，基线走平；再用d再生液冲洗，至基线走平；再进行进样利拉鲁肽进行色谱纯化分离测试。清洗液冲洗结果见附图2。c再生液冲洗出一个峰，表明大量污染物被洗出，再用d再生液冲洗时基线平稳，表明几乎没有污染物洗出，说明1％比例氨水已经能够比较充分地再生污染反相色谱柱。实施例4污染反相色谱柱再生后进样利拉鲁肽进行色谱纯化分离测试实施过程如下：将实施例1中污染的反相色谱柱直接用实施例3中的再生液再生后，自动进样器进样利拉鲁肽粗品，平衡缓冲液平衡一个柱体积溶液，洗脱液梯度洗脱样品。测试结果见附图3，污染层析柱重生后出峰变窄变高，恢复到被污染前性能状态。同时，实现了在色谱纯化循环内完成色谱固定相的再生，使色谱柱再生后就可以进行下一个纯化循环，使多个纯化循环可以连续进行。当前第1页12