超快颗粒分选的制作方法

超快颗粒分选
交叉引用
1.本申请要求于2018年8月31日提交的美国临时专利申请第62/725358号的权益，该申请通过引用并入本文。


背景技术：

2.基于细胞的疗法代表了再生医学和免疫疗法的基础。尽管许多遗留到治疗中的非治疗性细胞是无害的，但即使是少量特定的异常细胞类型也可能对患者造成严重的不良后果。因此，在将细胞移植到患者体内之前，将治疗细胞从有害细胞中纯化出来是至关重要的。为了加快基于细胞的再生医学技术向临床的转化，用于基于差异基表面标志物的表达以无菌且临床可应用的形式分离稀有干细胞和其他免疫细胞类型的高通量、高纯度的方法可能是必要的。


技术实现要素：

3.本文公开的实施方案提供了用于分选细胞的系统、方法和装置。在一些情况下，可以借助于激光(例如激光提取)和/或微孔阵列来分选细胞。微孔阵列可以包括可与激光相互作用以帮助提取目标细胞的涂层。在一些情况下，涂层可以剥落，同时破坏微孔阵列中保持的液体的弯月面。有利地，本文所述的方法能够提高细胞活力和提取效率，例如，因为将激光引导至阵列的表面，而不是直接引导至保持目标颗粒的液体处。
4.在一些方面，本公开内容提供了一种阵列，所述阵列包括具有第一表面和与所述第一表面相对的第二表面的基板，其中所述基板包括基板材料和表面材料，其中所述表面材料位于所述第一表面或第二表面处或与所述第一表面或第二表面相邻，并且所述基板包括限定从所述第一表面延伸到所述第二表面的内腔的多个孔，并且其中所述基板的特征在于：所述多个孔中的每个孔的最大直径为500微米或更小，所述多个孔中的每个孔的纵横比为10或更大，并且所述表面材料选自吸收大于10％的入射电磁辐射的材料。
5.在一些方面，本公开内容提供了一种阵列，所述阵列包括：具有第一表面和与所述第一表面相对的第二表面的基板，其中所述基板包括基板材料和表面材料，其中所述表面材料位于所述第一表面或第二表面处或与所述第一表面或第二表面相邻，并且所述基板包括从所述第一表面延伸到所述第二表面的多个孔，并且其中所述基板的特征在于：孔密度为100个或更多个孔/平方毫米，所述多个孔中的每个孔的纵横比为10或更大，并且所述表面材料选自吸收大于10％的入射电磁辐射的材料。
6.在某些实施方案中，每个孔的最大横截面积为约0.008mm2或更小。在某些实施方案中，所述多个孔中的每个孔的孔径在5微米至100微米的范围内。在某些实施方案中，所述多个孔中的每个孔的孔径在15微米至50微米的范围内。在某些实施方案中，每个孔具有选自约1mm至约500mm的长度。在某些实施方案中，每个孔具有选自约1mm至约100mm的长度。在某些实施方案中，每个孔具有选自约1mm至约10mm的范围的长度。
7.在某些实施方案中，所述孔密度在100个孔/平方毫米至2500个孔/平方毫米的范
围内。在某些实施方案中，所述孔密度在500个孔/平方毫米至1500个孔/平方毫米的范围内。在某些实施方案中，所述表面材料与所述基板材料基本相似。在某些实施方案中，所述表面材料不同于所述基板材料。在某些实施方案中，所述基板材料是玻璃，而所述表面材料不是玻璃。在某些实施方案中，所述表面材料包含金属。在某些实施方案中，所述表面材料吸收大于10％的入射电磁辐射，所述入射电磁辐射的波长选自0.4微米至2.5微米。在某些实施方案中，所述表面材料吸收大于50％的入射辐射。在某些实施方案中，所述表面材料吸收大于50％的入射电磁辐射，所述入射电磁辐射的波长选自0.4微米至1.5微米。
8.在某些实施方案中，所述纵横比在10至100的范围内。在某些实施方案中，所述纵横比为20或更大。在某些实施方案中，所述纵横比为50或更大。在某些实施方案中，所述纵横比为100或更大。在某些实施方案中，所述表面材料涂覆或部分涂覆所述第二表面。在某些实施方案中，所述表面材料涂覆或部分涂覆所述第一表面。在某些实施方案中，所述表面材料不阻挡进入所述孔的所述内腔。在某些实施方案中，所述表面材料具有约20nm至500nm的平均厚度。在某些实施方案中，所述表面材料具有约100nm至500nm的平均厚度。在某些实施方案中，所述表面材料是疏水性的。
9.在某些实施方案中，所述第一表面和第二表面是基本平行的平面。在某些实施方案中，所述多个孔相对于从所述第一表面到所述第二表面的表面法线成一定角度延伸。在某些实施方案中，所述角度在0度至90度的范围内更大。在某些实施方案中，所述多个孔从所述第一表面正交地延伸到所述第二表面。在某些实施方案中，所述多个孔横穿从所述第一表面到所述第二表面的间接路径。
10.在一些方面，本公开内容提供了一种用于对混合物的组分进行分选的系统，该系统包括根据本公开内容的任何方面所述的阵列；以及壳体，所述壳体包括被配置为接收从所述阵列释放的所选择的内容物的内表面。在某些实施方案中，所述内表面位于所述基板的所述第二表面的下方。
11.在一些方面，本公开内容提供了一种从阵列的孔释放所选择的内容物的方法，所述方法包括：识别具有所选择的内容物的阵列的孔，其中所述阵列包括具有第一表面和与所述第一表面相对的第二表面的基板，其中所述基板包括基板材料和表面材料，其中所述表面材料位于所述第一表面或第二表面处或与所述第一表面或第二表面相邻，并且所述基板包括限定从所述第一表面延伸到所述第二表面的内腔的多个孔，其中所述基板的特征在于以下中的一项或多项：(a)多个孔中的每个孔的最大直径为500微米或更小；(b)多个孔中的每个孔的纵横比为10或更大；(c)孔密度为100个或更多个孔/平方毫米；和(d)所述表面材料选自吸收大于10％的入射电磁辐射的材料；以及用被引导至所述识别的孔内或与所述识别的孔相邻之处的表面材料的电磁辐射从所述阵列的所述第一表面或第二表面去除所述表面材料的一部分，从而释放所述识别的孔的所述内容物。
12.在某些实施方案中，所述电磁辐射选自0.2微米至2.5微米的波长、足以破坏所述内容物与所述孔之间的附着力的通量水平、以及在1ns至1毫秒的范围内的脉冲持续时间。在某些实施方案中，去除表面材料包括烧蚀。在某些实施方案中，去除表面材料包括机械去除。在某些实施方案中，机械去除包括剥落。在某些实施方案中，去除表面材料包括光热去除。在某些实施方案中，去除表面材料包括光化学去除。在某些实施方案中，去除表面材料包括光声学去除。
13.在某些实施方案中，所述所选择的内容物包括水溶液中的细胞。在某些实施方案中，所述细胞选自inkt细胞、tmem、treg、hspc及其组合。在某些实施方案中，所述多个孔中的每个孔的横截面积各自为约0.008mm2或更小。在某些实施方案中，所述多个孔中的每个孔的孔径在5微米至100微米的范围内。在某些实施方案中，所述多个孔中的每个孔的孔径在15微米至50微米的范围内。在某些实施方案中，每个孔具有选自约1mm至约500mm的长度。在某些实施方案中，每个孔具有选自约1mm至约100mm的长度。在某些实施方案中，每个孔具有选自约1mm至约10mm的长度。
14.在某些实施方案中，阵列上的所述孔密度在100个孔/平方毫米至2500个孔/平方毫米的范围内。在某些实施方案中，阵列的所述孔密度在500个孔/平方毫米至1500个孔/平方毫米的范围内。在某些实施方案中，所述阵列具有大于1000个孔/mm2的孔密度。在某些实施方案中，孔密度为5000个孔/mm2或更大。在某些实施方案中，所述纵横比在10至100的范围内。在某些实施方案中，所述孔的纵横比为20或更大。在某些实施方案中，所述孔的纵横比为50或更大。在某些实施方案中，所述孔的纵横比为100或更大。在某些实施方案中，所述表面材料在选自约0.4微米至约2.5微米的波长下吸收大于10％。在某些实施方案中，所述表面材料吸收大于50％的入射辐射。在某些实施方案中，所述表面材料吸收大于50％的入射辐射，所述入射辐射的波长选自约0.4微米至约2.5微米。
15.在某些实施方案中，所述阵列的特征在于以下中的两项或更多项：(a)多个孔中的每个孔的最大直径为500微米或更小，(b)多个孔中的每个孔的纵横比为10或更大，(c)孔密度为100个或更多个孔/平方毫米，和(d)所述表面材料选自吸收大于10％的入射电磁辐射的材料。在某些实施方案中，所述表面材料的一部分与所述识别的孔相邻。在某些实施方案中，所述表面的一部分包括所述识别的孔的内腔表面。在某些实施方案中，将所述表面的一部分去除至100微米或更小的深度。在某些实施方案中，将所述表面的一部分去除至50微米或更小的深度。在某些实施方案中，所述方法还包括在识别具有所选择的内容物的所述孔之前，用包含所述所选择的内容物的溶液装载所述阵列。在某些实施方案中，识别具有所述所选择的内容物的所述孔包括分析从所述阵列的所述孔发射的电磁辐射。在某些实施方案中，释放所述内容物包括以约5,000个孔/秒至约100,000,000个孔/秒的速率释放所述内容物。
16.在一些方面，本公开内容提供一种珠粒，其包括：红外吸收性核；和非红外吸收性壳，其中所述非红外吸收性壳的外径等于或小于约10微米。
17.在某些实施方案中，所述非红外吸收性壳包含琼脂糖、右旋糖酐或两者。在某些实施方案中，所述红外吸收性核包含红外吸收性染料。在某些实施方案中，所述珠粒具有等于或小于约20微米的直径。
18.在一些方面，本公开内容提供了一种溶液，其包含：多个根据本公开内容的任何方面所述的珠粒；和目标颗粒。在某些实施方案中，所述目标颗粒是细胞。在某些实施方案中，所述多个所述珠粒的数量与多个所述细胞的数量的比率为约1:1至10:1。援引并入
19.本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指出通过引用被并入。
附图说明
20.在所附权利要求中具体阐述了本发明的新颖特征。通过参考阐述了说明性实施方案的以下详细描述和附图将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在所述说明性实施方案中利用了本发明的原理，在附图中：
21.图1a是用于分选细胞的阵列的侧视横截面图。
22.图1b是用于分选颗粒的阵列的俯视图。
23.图1c示出了具有不同细胞浓度的阵列的示例性图像。
24.图2a是用于分选颗粒的示例性阵列的侧视横截面图。
25.图2b是示例性阵列的示例性基板的正交图。
26.图3a是用于分选颗粒的包括铬涂层的示例性阵列的正交图。
27.图3b是用于分选颗粒的包括通过激光在邻近孔的位置处去除的铬涂层的示例性阵列的正交图。
28.图4a是包括铬涂层的示例性第一阵列中的吸收ir能量的经荧光染料染色的pbmc的正交图。
29.图4b是在提取pbmc之后的包括铬涂层的示例性第一阵列的正交图。
30.图5a示出了包括微球的阵列的侧视横截面图。
31.图5b示出了包括微球和水性样品溶液的阵列的侧视横截面图。
32.图6a示出了填充有微球和细胞的微孔阵列的明场图像。
33.图6b示出了从单个孔中提取细胞的明视场图像。
34.图6c示出了填充有微球和一个细胞的孔阵列的图像。
35.图6d示出了从单个微孔中提取细胞之后的阵列的图像。
36.图7a示出了所提取的细胞的示例性明场图像。
37.图7b示出了所提取的细胞的示例性图像。
38.图8示出了包含琼脂糖和右旋糖酐的示例性微球的明场图像。
39.图9示出了包含琼脂糖和右旋糖酐的示例性微球的高倍红外图像。
40.图10a示出了包含琼脂糖和ir吸收性染料的示例性微球的明场图像。
41.图10b示出了包含琼脂糖和ir吸收性染料的示例性微球的红外图像。
42.图11示出了包含铬的示例性微球的红外图像。
43.图12示出了示例性阵列中包含铬的示例微球的红外图像。
44.图13示出了在微孔中包含铬的示例铬微球的高倍红外图像。
45.图14a示出了包括阵列、壳体和内表面的系统的侧视横截面图。
46.图14b示出了包括阵列、壳体、内表面和电磁辐射源的系统的侧视横截面图。
47.图15a是示例性系统在0小时时的检漏试验的正交初始视图。
48.图15b是示例性系统在5小时时的检漏试验的正交最终视图。
49.图16a示出了提供包括多个孔的阵列的侧视横截面图。
50.图16b示出了在阵列内沉积水溶液的侧视横截面图。
51.图16c示出了将图1的示例性阵列插入盒内的侧视横截面图。
52.图16d示出了第一细胞和第二细胞的信号图的图像。
53.图16e示出了提取第二细胞的侧视横截面图。
54.图16f示出了收集细胞的侧视横截面图。
55.图17示出了细胞阵列的示例原始荧光图像。
56.图18示出了如图17所示的阵列的50万个孔的示例性散布图。
具体实施方式
57.存在对于提供具有高速度和无菌性的细胞分选系统的需要。因此，本文提供了用于通过从诸如微孔阵列的阵列中进行激光提取来分选细胞的系统、装置和方法。本文的系统、装置和方法采用的微孔分选可以被配置为约10,000个细胞/秒的高分选速率，或配置为比现有技术快100
‑
1000倍。此外，本文所述的实施方案可以在不损害细胞活力或功能的情况下实现这样的分选速率，同时保持无菌性和操作者生物安全性、减少样品
‑
样品污染、并消除任何流速时间限制。特别地，微孔阵列的表面材料及其系统和使用方法允许释放孔内容物，而对孔内容物的热影响可忽略不计。阵列
58.本文提供了一种阵列。本文所述的阵列可用于分选颗粒。颗粒可以是目标颗粒，例如需要富集用于治疗用途的细胞。该阵列可以包括基板。基板可包括第一表面，例如顶表面；与第一表面相对的第二表面，例如底表面；以及从第一表面延伸到第二表面的多个孔。所述孔可限定内腔，其可以具有如本文所述的不同的形状。所述孔可以是微孔或微通道。
59.在一个非限制性示例中，包括多个孔的基板的特征在于，每个孔的最大直径为500微米或更小，每个孔的纵横比为10或更大，并且表面材料选自吸收大于10％的入射电磁辐射的材料。在另外的或可替代的非限制性示例中，包括多个孔的基板的特征在于孔密度为100个或更多个孔/平方毫米，每个孔的纵横比为10或更大，并且表面材料选自吸收大于10％的入射电磁辐射的材料。
60.图1
‑
13描绘了用于分选颗粒的非限制性示例性阵列。图1a是根据一些实施方案的贯穿用于分选颗粒的阵列的竖直切片。参照图1，阵列100可以包括基板110，基板110包括第一表面111和与第一表面111相对的第二表面112；从第一表面111延伸到第二表面112的多个孔113。多个孔可以彼此基本平行，并且可以被构造成将颗粒与液体保持在一起。例如，液体可以通过表面张力而保持在孔内，并且在某些情况下可以形成弯月面。
61.基板110可以包含基板材料。基板材料可以是玻璃，例如硅酸盐玻璃、熔融二氧化硅、熔融石英等。基板材料可以是塑料，例如petg、peek等。基板可以是金属，例如铝、钢、铬等。
62.基板110可包括多个孔113。在一些情况下，多个孔113包括约10万至约1000亿个孔。在一些情况下，多个孔113包括约1000至约10亿个孔。在一些情况下，多个孔113包括约100万至约1000亿个孔。
63.基板110可以具有孔密度。孔密度可以包括阵列的每平方毫米的孔数。可以在第一表面111或第二表面112处测量孔密度。任选地，在一些实施方案中，第一阵列100具有约66％或约40％至约75％的开放阵列分数(堆积密度)。在一些情况下，孔密度可以在100至2500个孔/平方毫米的范围内。在一些情况下，孔密度可以在500至1500个孔/平方毫米的范围内。一种制造高孔密度的方法可以是通过使诸如毛细管的管熔合。可以通过改变管的壁厚和中心直径来改变孔密度。
64.在一个非限制性示例中，第一阵列110的宽度和长度分别为10
×
10英寸，并包括2.4亿个孔113，每个孔113的直径为15um。
65.另外，按照图1，第一阵列100的阵列高度110a被测量为第一表面111与第二表面112之间的法向距离。在一些实施方案中，阵列高度110a可以被测量为第一表面111与第二表面112之间的最大或最小法向距离。在一些实施方案中，阵列高度110a可以被测量为孔113的法向高度。在一些实施方案中，阵列高度110a可以被测量为孔113的最大或最小长度。长度可以在孔之间是均匀的，或所述孔可以从孔到孔改变(例如在制造过程中通过变形或不规则性)。任选地，每个孔113的长度等于或小于约50mm。在一些情况下，每个孔的长度可以选自约1mm至约500mm。在一些情况下，每个孔的长度可以选自约1mm至约100mm。在一些情况下，每个孔的长度可以选自约1mm至约10mm。
66.任选地，多个孔113可以与第一表面111和第二表面112正交。在一些实施方案中，多个孔113可以基本上彼此平行。在一些实施方案中，与第二表面相对的第一表面可以是基本平行的平面。多个孔可以从第一表面正交地延伸到第二表面。孔可以从第一表面垂直延伸到第二表面。可替代地，多个孔可以相对于从第一表面到第二表面的表面法线以一定角度延伸。与法线所成的角度可以小于90度。该角度可以小于60度、小于45度、小于30度或更小。该角度可以在5度至90度的范围内。
67.在一些实施方案中，多个孔可以横穿从第一表面到第二表面的间接路径。在这样的实施方案中，孔可以是缠结的、编织的或交错的。孔可包括一个或多个弯曲部，使得相对于从第一表面到第二表面的直接路径，穿过孔的路径实质上改变了方向。
68.图1b是用于分选颗粒的阵列100的俯视图。在一些示例中，阵列100具有多个孔113。每个孔可以包括横截面。横截面可以是圆形的，可以是椭圆形的，可以是多面的(例如，正方形、六边形、八边形、十二边形等)，或者可以具有不规则形状。孔之间的形状可以是均匀的，或所述孔可以从孔到孔改变(例如在制造过程中通过变形或不规则性)。
69.横截面可包括最大横截面尺寸113b。最大横截面尺寸可以在阵列的两个表面中的一处或中间位置处测量。最大横截面尺寸可以在单个横截面处测量。附加地或可替代地，最大横截面尺寸可以在沿着孔的许多位置上取平均值。可以以多种方式来测量尺寸，例如在使用参考的显微镜下，通过干涉仪，根据流量等来计算。在一些示例中，阵列的每个孔的横截面尺寸可以在5微米至100微米的范围内。在一些示例中，每个孔的横截面尺寸可以在15微米至50微米的范围内。
70.在一些情况下，最大横截面尺寸可以是直径。术语直径旨在涵盖贯穿圆形、近似圆形或椭圆形的孔的最大横截面距离。在一些示例中，阵列的每个孔的孔径可以在5微米至100微米的范围内。在一些示例中，每个孔的直径可以在10微米至50微米的范围内。
71.每个孔113可以具有横截面积。可以在单个横截面处测量横截面积。另外地或可替代地，横截面积可以在沿着孔的许多位置上取平均值。图1b所示的孔113的白色区域可以限定孔的第一表面处的横截面积。任选地，每个微孔113具有等于或小于约1平方毫米的横截面积。在一些情况下，多个孔中的每个孔可以具有约0.008mm2或更小的最大横截面积。
72.阵列的每个孔113可以具有纵横比。纵横比可以是孔的长度相对于孔的最大横截面尺寸的分数。纵横比可以是孔的长度相对于孔的直径的分数。在一些情况下，纵横比可以在10至100的范围内。在一些情况下，纵横比可以为10或更大。在一些情况下，纵横比可以为
20或更大。在一些情况下，纵横比可以为100或更大。
73.图1c示出了具有不同细胞浓度的阵列的示例性图像。如图示的实施方案中所示，每个孔可以包含一个或多个目标颗粒，例如细胞。一个或多个颗粒可以包括一个或多个细胞。多个细胞的数量可以是约1个、约5个、约25个或更多。在一些示例中，多个细胞的数量可以小于约100或小于约1000。
74.在一些实施方案中，可以例如通过将水性样品溶液散布到阵列100上来将水性样品溶液沉积到阵列100上。在一些实施方案中，阵列100的亲水性第一表面111吸收水性样品溶液进入孔113中。在一些实施方案中，阵列100的第一表面111在微孔113之间分布目标颗粒，例如水性样品溶液内的细胞。在一些实施方案中，阵列100的第一表面111将水性样品溶液内的目标颗粒随机地分布在微孔113中。在一些实施方案中，目标颗粒可以沉降在每个微孔113的底部。任选地，在一些实施方案中，可以通过水性样品溶液的表面张力将目标颗粒保留在每个微孔113中。
75.基板材料可以被配置为响应于被引导到基板材料的一部分或与其相邻的电磁辐射而被破坏。因此，一旦识别到目标颗粒被保持在阵列的特定微通道内，就可以将电磁辐射引导到第一表面以破坏基板材料，这可以导致保持在微通道中的液体的弯月面破裂，以释放目标颗粒。在某些实施方案中，电磁辐射去除(例如烧蚀)微阵列中的孔中或附近的基板材料的一部分，从而使保持在孔的微通道中的液体的弯月面破裂。表面材料
76.本文提供的是包括表面材料的阵列100的非限制性示例，如图2
‑
17b所示。表面材料120可以包括涂层。涂层可以耦合到第一表面111。在一些实施方案中，表面材料可以包括与基板材料不同的材料。在一个示例中，涂层可包含金属，例如过渡金属，例如铬。表面材料或涂层可以被配置为响应于被引导至表面材料的一部分或与表面材料的一部分相邻之处的电磁辐射而从第一表面破坏。因此，一旦识别到目标颗粒被保持在阵列的特定微通道内，就可以将电磁辐射引导至表面以破坏和/或剥离涂层，这可以使保持在微通道中的液体的弯月面破裂，以释放目标颗粒。
77.图2a是根据一些实施方案的用于分选颗粒的示例性阵列的侧视横截面图。如图2a所示，阵列100可以包括基板110。基板可以包括多个孔113。基板110可以包括第二表面112和与第二表面112相对的第一表面111。任选地，多个孔113可以从第一表面111延伸到第二表面112。在一些实施方案中，涂层120可以可操作地耦合到第一表面111。
78.在一些实施方案中，阵列100具有约66％的开放阵列分数(堆积密度)。在一些实施方案中，每个孔113具有等于或小于约1平方毫米的横截面积。在一些实施方案中，每个孔113具有约50um至约150um的直径。在一些实施方案中，每个孔113具有等于或小于约50mm的长度。在一些实施方案中，多个孔113与第二表面112和第一表面111正交。在一些实施方案中，多个孔113中的每个孔113可以基本上彼此平行。在一些实施方案中，多个孔113包括约100万至约1000亿个孔。
79.另外，按照图2a，阵列100可以具有被测量为从第二表面112到表面材料120的距离的阵列高度110a。在一些实施方案中，阵列高度110a可以被测量为第一表面111和第二表面112之间的法向距离。在一些实施方案中，阵列高度110a可以被测量为第一表面111与第二表面112之间的最大或最小法向距离。在一些实施方案中，阵列高度110a测量可以被为孔
113的法向高度。在一些实施方案中，阵列高度110a可以被测量为孔113的最大或最小高度。
80.图2b是根据一些实施方案的示例性阵列的俯视图。按照图2b，在阵列100内的多个孔113以正交图案布置。在一些实施方案中，图案包括线性图案、三角形图案、六边形图案、不规则图案或其任何组合。按照图2b，孔113的正交图案具有第一间隔113b和第二间隔113c中的至少一个，其中在连续孔1513的中心点之间测量第一间隔113b和第二间隔。在一些实施方案中，第一间隔113b和第二间隔中的至少一个被测量为连续孔113的表面上的相对点之间的法向距离。在一些实施方案中，第一间隔113b和第二间隔113c中的至少一个可以为约10mm至约40mm。
81.本文所述的阵列可以包括涂层120。涂层可以可操作地耦合至基板。涂层可以被配置为在经受电磁辐射时被破坏。例如，响应于被引导至涂层的一部分处的来自激光的电磁辐射，涂层可以剥落或剥离。任选地，涂层可以包括与基板的材料不同的材料。例如，基板110可以包括第一材料，并且涂层120可以包括与第一材料不同的第二材料。
82.在一些情况下，表面材料可以涂覆或部分涂覆第二表面。在另外的或可替代的情况下，表面材料可以涂覆或部分涂覆第一表面。在一些情况下，表面材料可以基本上不阻碍进入孔的内腔。但是，由于制造过程中涂层厚度的变化，可能会堵塞一些孔。表面材料可以具有约20纳米(nm)至500nm的平均厚度。表面材料可以具有约100nm至500nm的平均厚度。
83.在一些情况下，表面材料可以与基板材料基本相似。在一些情况下，阵列可以是均质的。在一些实施方案中，均质阵列不包括涂层。在一些实施方案中，均质阵列包括均匀的团聚物或合金材料。在一个示例中，阵列包括准金属、过渡金属(例如铬)，或两者。在一些实施方案中，基板材料包括玻璃、塑料、铝、钢、不锈钢或其任何组合。
84.在一些情况下，表面材料可以与基板材料实质上不同。基板材料可以是玻璃，并且表面材料可以是与玻璃不同的材料。在一些情况下，表面材料可以包括金属。在一些情况下，金属可以包括铬、银、金、铝等。在一些情况下，表面材料可以包括金属氧化物，例如氟化镁、氟化钙、二氧化硅等。表面材料可以包括金属和/或金属氧化物层，以形成定制的光学性质，例如反射或吸收。
85.在一些实施方案中，表面材料包括过渡金属，例如铬。在一些实施方案中，第二材料包括准金属。在一些实施方案中，第二材料包括金属氧化物。在一些实施方案中，第二材料包括钪、钛、钒、铬、锰、铁、钴、镍、铜、锌、钇、锆、铂、金、汞、铌、铱、钼、银、镉、钽、钨、铝、硅、磷、锡，前述任何一种的氧化物或它们的任何组合。
86.在一些实施方案中，表面材料选自不会负面影响细胞活力的材料。例如，表面材料可以是生物相容性的。表面材料可以是无毒的。在某些实施方案中，表面材料选自当与电磁辐射接触时不会引起细胞损伤或细胞死亡的材料。例如，通过使表面材料与电磁辐射接触而产生的产品本身可以不会引起细胞损伤或细胞死亡。也就是说，例如通过烧蚀表面材料产生的产物可以是生物相容性的和/或对细胞无毒的。在某些实施方案中，通过在细胞暴露于表面材料之前和之后测量细胞活力来评价对细胞活力的影响。在某些实施方案中，细胞活力保持相同或降低小于40％、小于30％、小于20％、小于15％、小于10％或甚至小于5％。在某些实施方案中，可以通过在使表面材料与电磁辐射接触之前和之后测量细胞活力来评价细胞活力。例如，在将细胞装载到阵列中之前以及通过使表面材料与电磁辐射接触而将细胞从阵列的孔中释放之后，评价细胞的活力。在一些示例中，使表面材料与电磁辐射接触
后，活力保持相同或降低小于40％、小于30％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％或甚至小于1％。
87.在一些情况下，阵列可以具有定制的疏水性。在一个示例中，第二表面112可以是亲水的。任选地，第二表面112本身不必是亲水的，而是可以可操作地耦合至亲水涂层。在一些实施方案中，涂层120的一部分可以被配置为从第一表面111被破坏。在一些实施方案中，涂层120的一部分可以被配置为响应于被引导至涂层的所述一部分的电磁辐射而从第一表面111被破坏。在一些实施方案中，涂层120可以是疏水性的。
88.涂层可以被配置为响应于被引导至表面材料的一部分的电磁辐射而被破坏。因此，一旦识别到目标颗粒被保持在阵列的特定微通道内，就可以将电磁辐射引导至涂层以破坏和/或剥离涂层，这可以使保持在微通道中的液体的弯月面破裂，以释放目标颗粒。涂层可以在与电磁辐射源发射的波长相对应的波长或波长范围内吸收。
89.因此，一旦识别到目标颗粒被保持在阵列的特定孔内，就可以将电磁辐射引导至该特定孔附近或与该特定孔相邻之处以释放目标颗粒。在一些实施方案中，第二表面的破坏包括去除阵列材料的至少一部分、阵列上的涂层或两者。
90.在一些实施方案中，阵列的破坏可以通过局部加热引起。当脉冲持续时间较长、峰值功率密度较低和/或入射辐射的波长在红外光范围内时，这种机制是可能的。局部加热可以导致表面材料或阵列材料的升华。在一些实施方案中，基板材料和涂层具有不同的热膨胀系数，这可以导致剥落。
91.另外地或可替代地，阵列的破坏可以通过烧蚀引起。当入射峰值功率密度较高、脉冲持续时间较短、入射功率较高和/或入射辐射在可见光范围内时，这种机制是可能的。烧蚀可包括阵列或基板材料的局部键断裂和/或汽化。
92.另外地或可替代地，阵列的破坏可以通过等离子体产生而引起。当入射辐射的脉冲持续时间特别短、入射辐射的波长与多光子电离机制共振，和或入射辐射的波长非常短时，这种机制是可能的。与局部加热相比，皮秒至飞秒量级的脉冲持续时间可得到更快的等离子体产生，从而导致对基板或表面材料的光学蚀刻。
93.另外地或可替代地，阵列的破坏可以通过冲击波产生而发生。当峰值功率密度较高、声子共振和/或脉冲持续时间较短时，这种机制可更加有可能。冲击可以引起表面或阵列材料的物理振动、剥落或晃动。
94.在一个示例中，表面材料吸收可见光或红外光范围内的一系列波长。在一些实施方案中，表面材料可以是不透明的。表面材料可以吸收在可见光和红外光范围内选择的至少5纳米波段。表面材料可以吸收大于10％的在选自0.4至2.5微米的至少5纳米波段内的入射辐射。表面材料可以吸收大于10％的选自0.4微米至2.5微米的波长的入射电磁辐射。在一些情况下，表面材料可以吸收大于50％的在至少5纳米波段内的入射辐射。可以在0.4至2.5微米的波长范围内选择5纳米波段。表面材料可以吸收大于50％的选自0.4微米至1.5微米的波长的入射电磁辐射。表面材料可以吸收大于10％的波长选自掺杂型正钒酸镱或镱铝石榴石固态激光器的谐波的入射辐射。表面材料可以吸收大于10％的入射1064纳米辐射。
95.在一个示例中，阵列的涂层(例如铬涂层)具有约500nm的平均厚度，其通过红外(ir)激光厚度减小了约100nm或更小，例如约75nm纳米或更小，或甚至约50纳米或更小。涂层厚度可以为100至500nm。
96.在一些实施方案中，电磁辐射源可以被配置为将涂层的平均厚度减小约1nm至约5nm、减小约1nm至约10nm、减小约1nm至约20nm、约1nm至约30nm、约1nm至约40nm、约1nm至约60nm、约1nm至约70nm、约1nm至约80nm、约1nm至约10nm约90nm，或约1nm至约100nm。
97.在一些实施方案中，电磁辐射源可以被配置为以约1nm至约5nm、约1nm至约10nm、约1nm至约20nm、约1nm至约30nm、约1nm至约40nm、约1nm至约60nm、约1nm至约70nm、约1nm至约80nm、约1nm 1nm至约90nm或约1nm至约100nm的平均深度烧蚀阵列的一部分。
98.在一些实施方案中，电磁辐射源可以被配置为去除涂层或阵列的一部分，该部分的表面积为约1μm2至约30μm2、1μm2至约20μm2、约1μm2至约10μm2，或约1μm2至约5μm2。
99.在一些实施方案中，电磁辐射源可以被配置为在距微孔的周边约1nm至约5nm、约1nm至约10nm、约1nm至约20nm、约1nm至约30nm、约1nm至约40nm、约1nm至约60nm、约1nm至约70nm、约1nm至约80nm、约1nm至约90nm或约1nm至约100nm的平均距离处烧蚀阵列的一部分。
100.图3a示出了根据一些实施方案的用于分选颗粒的包括铬涂层的示例性阵列的俯视图。图3b示出了根据一些实施方案的包括铬涂层(通过激光去除)的非限制性示例性阵列的俯视图，该阵列用于分选颗粒。根据3a
‑
b，涂层120吸收电磁能，从而使其从基板110破坏，这扰乱了每个孔113内的流体的弯月面以排出其中的细胞。图3b示出了通过电磁能从基板110去除的涂层120的碎片。如图3b所示，激光可以聚焦在单个孔处或其相邻处、两个相邻孔之间或与三个孔等距之处。在一些实施方案中，将红外激光聚焦在单个孔附近、两个相邻孔之间或与三个孔等距之处，会分别干扰一个、两个或三个孔113内的流体的弯月面，以排出其中的细胞。在一些实施方案中，将激光聚焦在更靠近特定孔之处，会减少无意中排放相邻孔内的细胞的可能性。在一些实施方案中，红外激光器的强度和持续时间中的至少一个可以被配置为控制一个、两个或三个孔内的细胞的排出。
101.在一些实施方案中，可以通过在玻璃阵列上溅射100nm厚的铬来形成表面材料120。在一些实施方案中，可以在真空下进行溅射。在一些实施方案中，真空可以为约0.08至约0.02mbar。在一些实施方案中，可以在约100v至3kv的电压下进行溅射。在一些实施方案中，可以在0至50ma的电流下进行溅射。任选地，在一些实施方案中，可以仅在玻璃阵列的一侧溅射铬。在一些实施方案中，然后可以将涂覆有铬的阵列浸泡在碱性溶液例如naoh溶液中。在一些实施方案中，naoh溶液的浓度为约1m。在一些实施方案中，可以将涂覆有铬的阵列浸泡约12小时的时间。在一些实施方案中，然后可以将涂覆有铬的阵列在10％的漂白剂中浸泡多达1小时，其中之后喷水除去任何残留的漂白剂。在一些实施方案中，然后可以在装载细胞之前将涂覆有铬的阵列吹干。
102.在一些实施方案中，pbmc的提取包括将表面活性剂和接收介质添加到涂覆有铬的阵列上；可以将插入的阵列组装到盒中，使涂覆有铬的一侧面向下，朝向接收介质；将pbmc滴在阵列上，并使pbmc沉降到孔中。在一些实施方案中，表面活性剂保护细胞膜的完整性并改善在液体剪切下的稳固性。在一些实施方案中，表面活性剂包括非离子表面活性剂。在一些实施方案中，非离子表面活性剂包含0.1％的pluoronic f68。在一些实施方案中，接收介质包括optipeak t细胞介质。在一些实施方案中，接收介质还包括链霉亲和素。在一些实施方案中，使pbmc沉降到微孔中持续约5分钟的时间。
103.在一些实施方案中，从激光器发射并被铬涂层吸收的ir能量可使涂层在每个微孔的底部边缘膨胀和分层，以从每个微孔中提取pbmc。每个微孔底部边缘处的铬涂层的分离
使其中流体的弯月面破裂，从而释放pbmc。
104.图4a是根据一些实施方案的包括铬涂层的非限制性示例性第一阵列中的吸收ir能量的经荧光染料染色的pbmc的俯视图。图4b是根据一些实施方案的在提取pbmc之后的包括铬涂层的示例性第一阵列的俯视图。珠粒
105.在某些实施方案中，阵列的孔可包括吸收电磁辐射并影响孔中流体弯月面破裂的珠粒。在一些情况下，珠粒可以结合到孔的内腔表面或可以是未结合的(添加到液体混合物中的孔中)。本文提供了一种包括核和壳的珠粒。本公开内容的珠粒可以称为“微球”。所述核可以包括红外(ir)吸收性核。所述壳可以包括非ir吸收性壳。本公开内容的珠粒可以与阵列的孔关联，并且该珠粒可以吸收电磁辐射。非红外吸收性壳可以使红外吸收性核与附近的颗粒(例如细胞)隔离，从而保护颗粒免受红外吸收的辐射对核的破坏作用。珠粒还可以包含琼脂糖。非红外吸收性壳可以包含琼脂糖。珠粒还可以包含右旋糖酐。珠粒可以用红外吸收性染料染色。珠粒的直径可以等于或小于约20μm，例如为约1μm至约20μm，或约5μm至约20μm。珠粒可以包括可以等于或小于约10微米的吸收性壳。在一些实施方案中，本文所述的阵列的表面材料可以包括包含红外吸收性核和非红外吸收性壳的珠粒，其中非红外吸收性壳的外径等于或小于约10微米。
106.图5a示出了包括布置在其中的珠粒的阵列100。在一些情况下，珠粒可以布置在孔的内腔的内部。在一些情况下，珠粒可以布置在第一表面111上。在一些情况下，珠粒可以布置在孔的内腔内。图5b示出了图5a的示例性阵列内的水性样品溶液的侧视横截面图。在一些实施方案中，将水性样品溶液521沉积到阵列100上包括将水性样品溶液521铺展到阵列100上。在一些实施方案中，阵列100的亲水性第一表面111将水性样品溶液521吸收到孔113中。在一些实施方案中，阵列100的亲水性第一表面111将水性样品溶液521内的第一细胞522和第二细胞523均匀地分布在孔113之中。在一些实施方案中，阵列100的亲水性第一表面111将水性样品溶液521内的第一细胞522和第二细胞523随机地分布在孔113之中。在一些实施方案中，第一细胞522和第二细胞523沉降在每个孔113的底部。任选地，在一些实施方案中，通过水性样品溶液521的表面张力，将第一细胞522和第二细胞523保留每个孔113中。
107.图6a示出了根据一些实施方案的填充有微球和细胞的微孔阵列的明场图像。如图6a所示，阵列600内的每个微孔601可以被每个各自的微孔601中的微珠和细胞堵塞。图6b示出了根据一些实施方案的从单个微孔提取细胞的明场图像。如图6b所示，阵列600内的仅一个微孔601未能被细胞堵塞，表明只有单个微孔601内的细胞已被去除。图6c示出了根据一些实施方案的填充有微球和一个细胞的微孔阵列的图像。如图6c所示，阵列600内的仅一个微孔601中包括细胞。图6d示出了根据一些实施方案的从单个微孔中提取细胞之后的阵列600的图像。如图6d所示，阵列600内的微孔601均不包含细胞，表明单个微孔601中的单个细胞已被去除。
108.图7a示出了根据一些实施方案的所提取的细胞的示例性明场图像。图7b示出了根据一些实施方案的所提取的细胞的示例性图像。
109.根据图8
‑
13，本文提供了示例性珠粒或微球。图8示出了示例性琼脂糖和右旋糖酐微球的明场图像。在一些实施方案中，琼脂糖和右旋糖酐微球800被配置为吸收红外光。在
一些实施方案中，琼脂糖和右旋糖酐微球800是不透明的、黑色的或为两者。在一些实施方案中，琼脂糖和右旋糖酐微球800包括聚合物壳氧化铁微球800。在一些实施方案中，琼脂糖和右旋糖酐微球800的直径为约6um至约20um。
110.图9示出了示例性琼脂糖和右旋糖酐微球的高倍红外图像。如图9所示，琼脂糖和右旋糖酐微球800包括红外(ir)吸收性核910和非红外吸收性壳920。在一些实施方案中，ir吸收性核910包括ir吸收性染料。在一些实施方案中，ir吸收性染料包括epolight 1178。在一些实施方案中，非ir吸收性壳920包含琼脂糖和右旋糖酐。
111.使用ir核染色颗粒对于有效的细胞提取可能是有利的。首先，整合到琼脂糖核的分子结构中的染料相比染料涂层可以增加ir吸收。此外，非ir吸收性软壳可以充当缓冲层，以保护细胞免受与任何潜在吸收的热量、体积膨胀和/或微气泡形成相关的应力和热冲击。两者都可以提高提取效率(成功提取事件的次数更多)和高细胞活力。
112.图10a示出了示例性琼脂糖和ir染料微球的明场图像。图10b示出了示例性琼脂糖和ir染料微球的红外图像。如图10b所示，琼脂糖和ir染料微球1000可以是红外(ir)吸收性的。在一些实施方案中，琼脂糖和ir染料微球1000包含琼脂糖。在一些实施方案中，琼脂糖和ir染料微球1000包含ir吸收性染料。在一些实施方案中，ir吸收性染料包括epolight 1178。在一些实施方案中，该染料包含绿色荧光蛋白。在一些实施方案中，该染料包含红色荧光蛋白。在一些实施方案中，该染料包括花青染料、吖啶染料、荧光酮染料、噁嗪染料、若丹明染料、香豆素染料、菲啶(pheanthridine)染料、bodipy染料、alexa染料、二萘嵌苯染料、蒽染料、萘染料等。在一些实施方案中，琼脂糖和ir染料微球1000的直径为约2μm至约16μm。
113.图11示出了包含铬的示例性微球的红外图像。图12示出了示例性阵列中包含铬的示例微球的红外图像。图13示出了在微孔中包含铬的示例性微球的高倍红外图像。在一些实施方案中，微球1100包含过渡金属，例如铬。任选地，在一些实施方案中，微球1100包括铬涂层。
114.本文提供了一种形成红外吸收性珠粒的方法。在一些实施方案中，该方法包括：洗涤琼脂糖珠粒；将琼脂糖珠粒染色；并形成琼脂糖珠粒的核。在一些实施方案中，洗涤琼脂糖珠粒包括将琼脂糖珠粒悬浮在第一溶剂中并将琼脂糖珠粒和第一溶剂离心。在一些实施方案中，第一溶剂包括有机溶剂，例如丙酮；或水性溶剂，例如水，或其组合。在一些实施方案中，可以以约1,000rpm至约4,000rpm的速率进行离心。在一些实施方案中，可以以约2,000rpm的速率进行离心。在一些实施方案中，每50mg的琼脂糖珠粒可使用1ml的第一溶剂。在一些实施方案中，琼脂糖珠粒包括superdex珠粒。
115.在一些实施方案中，将琼脂糖珠粒染色包括：形成染色溶液，将该染色溶液离心，并将该染色溶液添加到琼脂糖珠粒上。染色溶液可以包含epolin 1178和第二溶剂。在一些实施方案中，第二溶剂包括丙酮、水、去离子水或其任何组合。可以以约2,000rpm至约10,000rpm，例如约5,000rpm的速率进行离心。在一些实施方案中，将琼脂糖珠粒染色还包括将琼脂糖珠粒和染色溶液温育。温育可以进行约15分钟至约1小时，例如约30分钟。在一些实施方案中，温育可以在室温下进行。温育可以在持续混合下进行。在一些实施方案中，将琼脂糖珠粒染色还包括在温育后例如以约750rpm至约3,000rpm的速率将琼脂糖珠粒离心。在一些实施方案中，将琼脂糖珠粒染色还包括将暗珠与亮珠分离。在一些实施方案中，将琼脂
糖珠粒染色还包括将琼脂糖珠粒悬浮在0.2％的bsa
‑
pbs中。
116.在一些实施方案中，形成琼脂糖珠粒的核包括将琼脂糖珠粒悬浮在第三溶剂中并将琼脂糖珠粒和第三溶剂离心。在一些实施方案中，第三溶剂包含1:1的丙酮
‑
水混合物。在一些实施方案中，可以以约500rpm至约2,000rpm的速率进行离心。在一些实施方案中，离心可以进行约10秒至约60秒。
117.可替代地，在一些实施方案中，形成琼脂糖珠粒的核包括在缓冲液中温育珠粒。在一些实施方案中，缓冲液包含bsa
‑
pbs。在一些实施方案中，缓冲液具有约0.2％的浓度。在一些实施方案中，可在约4℃的温度下在缓冲液中温育珠粒。在一些实施方案中，可将珠粒在缓冲液中温育至少约5天的时间。形成琼脂糖珠粒的核还可以包括每天更换缓冲液。
118.本文提供了一种溶液，其包含多个如本文所述的珠粒和如本文所述的目标颗粒。在一些情况下，目标颗粒是细胞。在一些情况下，溶液具有约为1:1至10:1的多个珠粒的数量与多个细胞的数量的比率。可以将包含目标颗粒的溶液嵌入本文所述的阵列的一个或多个孔中。就实施例5和实施例6进一步描述示例性溶液。系统
119.本文提供的另一方面是一种用于分选颗粒的系统。本文提供了一种用于分选混合物组分的系统。该系统可以包括如本文所述的阵列的任何实施方案、变型或示例。
120.图14a示出了包括阵列100、壳体1431和内表面1432的系统。用于分选颗粒的系统可以包括阵列100，该阵列100包括：基板110，其包括第一表面111；与第一表面111相对的第二表面112；和从第一表面111延伸到第二表面112的多个孔113，每个孔113的横截面积等于或小于约1平方毫米且长度等于或小于约10mm，其中基板110包含第一材料；以及可操作地耦合到第二表面112的涂层120，其中涂层120包含不同于第一材料的第二材料，并且其中涂层120的一部分可以被配置为响应于被引导至涂层120的一部分的电磁辐射而从第二表面112被破坏；以及阵列100的多个孔113内的流体，其中多个孔113内的流体的弯月面基本上与涂层120相邻。
121.在一些实施方案中，第一表面111可以是亲水的。在一些实施方案中，第一表面111可以可操作地耦合至亲水涂层120。在一些实施方案中，涂层120可以是疏水性的。在一些实施方案中，涂层120能够在等于或大于1小时的时间内防止从孔泄漏。在一些实施方案中，涂层120以其整体覆盖第二表面112。
122.在一些实施方案中，第二材料可以是铬。在一些实施方案中，第二材料包括银、金、铝、钛、铜、铂、镍或钴。在一些实施方案中，第一材料可以是玻璃。在一些实施方案中，横截面积可以等于或小于约0.03mm2。在一些实施方案中，长度可以等于或小于约1.5mm。在一些实施方案中，涂层120具有等于或小于约200nm的厚度。在一些实施方案中，基板110具有约0.5m
‑1的表面积与体积之比。在一些实施方案中，涂层120的一部分可以被配置为吸收电磁辐射并且响应于被引导到涂层120的该部分的电磁辐射而从第二表面112脱离。在一些实施方案中，多个微孔1133与第一表面111和第二表面112正交。在一些实施方案中，多个微孔113基本彼此平行。在一些实施方案中，多个微孔113是约100万至约1000亿个微孔113。在一些实施方案中，第二材料是不透明的。第二材料可以被配置为吸收红外(ir)能量。基板110和涂层120可以具有不同的热膨胀系数。
123.任选地，该系统可以另外包括壳体1431，该壳体1431包括被配置为接收从阵列释
放的所选择的内容物的内表面1432。该系统可以包括如本文所述的阵列的任何实施方案、变型或示例，以及包括内表面的壳体。内表面可以位于基板的第二表面下方。该系统可以另外包括细胞分选仪。所述阵列被安装在细胞分选仪上。
124.任选地，用于分选颗粒的系统可以包括电磁辐射源。
125.图14b示出了用于分选颗粒的系统，该系统包括阵列100、电磁辐射源1451。所述阵列可以被配置为响应于被引导至第一表面或第二表面的一部分的电磁辐射而在第一表面或第二表面处被破坏。在一些情况下，使分选系统能够释放保持在阵列的特定隔室中的颗粒而无需将激光或其他能源直接引导至保持目标颗粒的隔室(例如，当目标颗粒是细胞时，有助于于增加细胞活力)是有益的。将激光能量聚焦在阵列的表面而不是阵列的孔的内部，可以避免或减少由于热冲击、热膨胀、微气泡产生和局部剪切应力而对孔内容物造成的可能损害。
126.产生电磁辐射的源可以包括激光器。激光器可以是掺杂型固态激光器。激光器可以是光纤激光器。激光器可以是半导体二极管激光器。激光器可以是气体激光器，例如hene激光器或准分子激光器。激光可以发射波长范围内的电磁辐射。在一些实施方案中，电磁辐射可以在可见光和/或红外光范围内发射。电磁辐射于是可以在可见光或红外光范围内的5纳米波段内发射。电磁辐射可以以诸如掺杂型正钒酸镱或镱铝石榴石的掺杂型固态激光器的谐波发射。电磁辐射可以包括1064nm的辐射。
127.电磁辐射可以包括入射能量。入射能量可以大于0.1微焦耳/脉冲。入射能量可以小于1毫焦耳/脉冲。入射能量可以在1皮焦耳/脉冲至1焦耳/脉冲的范围内。平均功率可以小于10瓦。平均功率可以小于100毫瓦。平均功率可以大于1微瓦。
128.电磁辐射可以具有入射峰值功率密度。峰值功率密度可以小于10太瓦/平方厘米。峰值功率可以小于10吉瓦/平方厘米。
129.电磁辐射可以具有入射光斑直径。光斑直径可以足够小，使得可以辐射与孔相邻的区域而不显著地辐射细胞内容物。光斑直径可以基于孔的尺寸和孔间隔来调节。光斑直径可以足够小，使得可以辐射孔内腔的内壁而不显著辐射孔内容物(例如内腔内部的细胞)。光斑直径可以小于10毫米(mm)、小于1毫米、小于100微米(μm)、小于10μm或更小。
130.电磁辐射可以具有入射脉冲持续时间。脉冲持续时间可以大于约5飞秒。脉冲持续时间可以大于约100飞秒。脉冲持续时间可以大于约1纳秒或更长。脉冲持续时间可以小于约1微秒。
131.示例性的电磁辐射源包括功率为0.1mj、功率密度为108‑
109w/mm2的1064nm的镱光纤激光器，其中在脉冲持续时间为4ns的最大激光功率的10％
‑
30％下，光斑直径20μm能够为阵列提供30
‑
90j/cm2。
132.所述系统可以另外包括一个或多个透镜，用于聚焦电磁辐射源。所述一个或多个透镜可包括显微镜物镜。可以在阵列的表面上光栅扫描显微镜物镜，以便瞄准阵列的特定部分。所述系统可以包括一个或多个平移台，其可以控制物镜相对于阵列表面的定位。
133.所述系统可以包括一个或多个分束器、滤光片或二向色滤光片。包括一个或多个分束器、滤光片或二向色滤光片的系统可以允许用户监控阵列的表面，同时将电磁辐射源对准或引导至阵列的表面。可以以比将破坏阵列的更低功率或以相同功率的电磁辐射来进行对准。所述系统可以包括一个或多个位置敏感性光学检测器，例如ccd，以便监控电磁辐
射源的对准。
134.所述系统可以包括第二电磁辐射源。第二电磁辐射源可以用于对准。第二电磁辐射源可用于激发诸如荧光团的吸收体。第二电磁辐射源可以是相干的或不相干的。第二电磁辐射源可以是宽波段或窄波段。第二电磁辐射源可以具有本文关于电磁辐射源描述的任何性质，例如功率、脉冲持续时间、波长等。
135.图15a和图15b示出了包括阵列和壳体的示例性系统1400。图15a是在0小时时的检漏试验的俯视初始视图。图18b是示例性阵列在5小时时的检漏试验的俯视初始视图。根据图15a至图15b，用去离子水在约5小时的时间段内对框架1510中的示例性阵列100进行检漏试验，其中没有去离子水通过阵列的微孔泄漏。在一些实施方案中，示例性阵列100的涂层能够在等于或大于约1小时的时间段内防止从孔泄漏。在一些实施方案中，示例性阵列100的涂层能够在等于或大于约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时或10小时的时间段内防止从孔泄漏。方法
136.本文描述的阵列的实施方案、示例和变型可以用于从阵列的孔中释放颗粒的方法中。本文描述的系统的实施方案、示例和变型可以用于从阵列的孔中释放颗粒的方法中。本文提供了一种从阵列的孔中释放颗粒的方法，该方法包括：填充孔，将溶液的一部分保持在孔中，将电磁辐射引导至阵列的一部分，破坏阵列的所述一部分，并释放包含目标颗粒的溶液的一部分。可以用溶液的至少一部分填充所述孔。该溶液可以包含目标颗粒。可以通过表面张力将溶液的一部分保持在孔中。破坏阵列的一部分可以破坏保持在孔中的溶液的一部分的表面张力。
137.本文提供了一种从阵列的孔中释放所选择的内容物的方法，该方法包括：识别具有所选择的内容物的阵列的孔，其中阵列包括具有第一表面和与第一表面相对的第二表面的基板，其中基板包括基板材料和表面材料，其中表面材料位于第一表面或第二表面处或与第一表面或第二表面相邻，并且基板包括限定从第一表面延伸至第二表面的内腔的多个孔，其中所述基板的特征在于以下中的一项或多项：(a)多个孔中的每个孔的最大直径为500微米或更小；(b)多个孔中的每个孔的纵横比为10或更大；(c)孔密度为每100个或更多个孔/平方毫米，和(d)表面材料选自吸收大于10％的入射电磁辐射的材料；以及用被引导至识别的孔内或与识别的孔相邻之处的表面材料的电磁辐射从阵列的第一表面或第二表面去除表面材料的一部分，从而释放识别的孔的内容物。
138.在一些示例中，阵列的特征可以在于以下中的两项或多项：(a)多个孔中的每个孔的最大直径为500微米或更小，(b)多个孔中的每个孔的纵横比为10或更大；(c)孔密度为100个或更多个孔/平方毫米；和(d)表面材料选自吸收大于10％的入射电磁辐射的材料。
139.图16a
‑
e示出了如本文所述利用图1的示例性阵列分选细胞的示例性方法的侧视横截面图。根据图16a
‑
e，利用示例性第一阵列100分选细胞的示例性方法1600包括：提供1610包括多个孔113的阵列100。在一些实施方案中，操作1610还可包括根据图5a用微球覆盖孔113的最接近阵列100的第一表面111的一部分。方法1600的操作1620可以包括在阵列内沉积水溶液1621。在一些情况下，根据图16b，阵列可以包括将第一细胞1622和第二细胞1623沉积到第一阵列100上。根据图16c，方法1600的操作1630可包括将阵列100插入壳体1631内。在一些情况下，壳体可以包括盒。壳体可以包括内表面1632。方法100的操作1640可
以包括捕获所选择的颗粒的信号图。根据图16d，所选择的颗粒可以包括第一细胞1622和第二细胞1623。根据图16e，方法1600可以还包括，在第一细胞和第二细胞1623的信号图内定位1640第一细胞1622的信号图。方法1600可以还包括从阵列100中提取1640第二细胞1623；以及根据图16f，收集1650第二细胞1623。从阵列中提取细胞的步骤可以包括破坏阵列100的表面上或附近的涂层。破坏的步骤可以包括在选定位置向阵列的表面提供电磁辐射。图16a示出了根据示例性方法的提供包括涂层的、包括多个孔的阵列的侧视横截面图。
140.图16b示出了在图1的示例性阵列内沉积水性样品溶液的侧视横截面图。在一些实施方案中，将水性样品溶液1621沉积1620到阵列100上包括将水性样品溶液1621铺展到阵列100上。在一些实施方案中，阵列100的亲水性第一表面111将水性样品溶液1621吸收到孔113中。在一些实施方案中，阵列100的亲水性第一表面111将水性样品溶液1621内的第一细胞1622和第二细胞1623均匀地分布在孔113之中。在一些实施方案中，阵列100的亲水性第一表面111将水性样品溶液1621内的第一细胞1622和第二细胞1623随机地分布在孔113之中。在一些实施方案中，第一细胞1622和第二细胞1623沉降在每个孔113的底部。任选地，在一些实施方案中，通过水性样品溶液1621的表面张力将第一细胞1622和第二细胞1623保持在每个孔113中。在一些实施方案中，所述细胞选自inkt细胞、tmem、treg、hspc及其组合。
141.图16c示出了根据一些实施方案的将图1的示例性阵列插入封闭的盒内或壳体内的侧视横截面图。根据图16c，盒1631包括在阵列100的顶部上的增湿膜1633和用于收集第二细胞1623的收集托盘1632。任选地，在一些实施方案中，盒1631包括封闭的盒1631。任选地，在一些实施方案中，盒1631包括湿度受控的盒1631。任选地，在一些实施方案中，增湿膜1633减少从孔113的蒸发。任选地，在一些实施方案中，收集托盘1632可放置在盒1631内的阵列100下方。任选地，在一些实施方案中，收集托盘1632包括透明收集托盘1632。
142.图16d示出了根据一些实施方案的第一细胞和第二细胞的信号图的图像。根据图16d，可以确定第二细胞的信号图1641。在一些实施方案中，可以确定第一细胞的信号图1642。在一些实施方案中，可以通过量化由自动荧光扫描系统拍摄的图像来捕获图。所述第一细胞可以在第一波长下是荧光性的，并且所述第二细胞可以在第二波长下是荧光性的。在一些实施方案中，可以确定组合图像。图17示出了细胞阵列的示例非限制性原始荧光图像。图18示出了如图17所示的阵列的50万个微孔的示例性非限制性散布图。
143.图16e示出了根据一些实施方案的提取第二细胞的侧视横截面图。根据图16e，通过将包括第二细胞1623的孔113(根据图16d中的第二细胞1623的信号图)暴露于激光器1651的脉冲，从阵列100中提取第二细胞1623。激光器激发可包括特定孔113内的微球的涂层。任选地，在一些实施方案中，激光器1651包括纳秒激光器1651。
144.图16f示出了根据一些实施方案的收集细胞的侧视横截面图。根据图16f，可以将通过激光器1651从阵列100提取的第二细胞1623收集在收集托盘1661中。
145.本文提供的另一方面是从阵列的孔中释放颗粒的方法，所述方法包括：用溶液的至少一部分填充所述孔，其中所述溶液的所述部分包含目标颗粒；通过表面张力将溶液的所述一部分保持在孔中；将电磁辐射引导至阵列的一部分；破坏阵列的所述一部分，从而破坏保持在孔中的溶液的所述一部分的表面张力；并释放包含目标颗粒的溶液的所述一部分。在一些实施方案中，阵列包括基板和可操作地耦合至基板的涂层。在一些实施方案中，基板包括第一表面、与第一表面相对的第二表面以及孔，其中孔从第一表面延伸至第二表
面。在一些实施方案中，第一表面是亲水的，并且涂层是疏水的。在一些实施方案中，阵列的所述一部分是阵列的涂层。在一些实施方案中，阵列的所述一部分是靠近孔的阵列的涂层。在一些实施方案中，涂层包含铬。在一些实施方案中，阵列包括多个孔。在一些实施方案中，所述方法还包括用溶液填充多个孔。在一些实施方案中，所述方法还包括释放被保持在多个孔的子集中的溶液，其中多个孔的子集保持包含目标颗粒的溶液。所述方法可以还包括分析每个颗粒的多个荧光特征。在一些实施方案中，所述方法还包括基于该分析来确定保持包含目标颗粒的溶液的所述一部分的孔。在一些实施方案中，以约5,000至约100,000,000个目标颗粒/秒的速率释放所述颗粒。在一些实施方案中，目标颗粒包括细胞。在一些实施方案中，以等于或大于60％的活力释放细胞。在一些实施方案中，所述方法还包括将目标颗粒接收在壳体中，其中该壳体包括用于接收目标颗粒的内表面。在一些实施方案中，所述内表面容纳接收介质。在一些实施方案中，所述接收介质包括pluoronic f68。
146.在一些实施方案中，所述方法还包括利用被引导至识别的孔内或与识别的孔相邻之处的表面材料的电磁辐射，从阵列的第一表面或第二表面去除表面材料的一部分，从而释放识别的孔中的内容物。在一些示例中，表面材料的所述一部分可以与识别的孔相邻。表面的所述一部分可以包括识别的孔的内腔表面。表面的所述一部分可以被去除达100微米或更小的深度。表面的所述一部分可以被去除达50微米或更小的深度。
147.在一些情况下，在识别具有选择的内容物的孔之前，进行用包含选择的内容物的溶液装载阵列的步骤。在一些情况下，识别具有选择的内容物的孔的步骤包括分析从阵列的孔发射的电磁辐射。在一些情况下，释放内容物的步骤包括以约5,000至约100,000,000个孔/秒的速率释放内容物。
148.产生电磁辐射的源可以包括激光器。激光器可以是掺杂型固态激光器。激光器可以是光纤激光器。激光器可以是半导体二极管激光器。激光器可以是气体激光器，例如hene激光器或准分子激光器。激光可以发射波长范围内的电磁辐射。在一些实施方案中，电磁辐射可以在可见光和/或红外光范围内发射。电磁辐射于是可以在可见光或红外光范围内的5纳米波段内发射。电磁辐射可以以诸如掺杂型正钒酸镱或镱铝石榴石的掺杂型固态激光器的谐波发射。电磁辐射可以包括1064nm的辐射。
149.电磁辐射可以选自0.2微米至2.5微米的波长、足以破坏内容物与孔之间的附着力的通量水平以及1ns至1毫秒范围内的脉冲持续时间。
150.因此，一旦识别到目标颗粒被保持在阵列的特定孔内，就可以将电磁辐射引导至该特定孔附近或与该特定孔相邻之处，以释放目标颗粒。在一些实施方案中，第二表面的破坏包括去除阵列材料的至少一部分、阵列上的涂层或两者。
151.在一些实施方案中，去除表面材料的一部分的步骤可以通过局部加热引起。当脉冲持续时间较长、峰值功率密度较低和/或入射辐射的波长在红外光范围内时，这种机制可为可能的。局部加热可以导致表面材料或阵列材料升华。在一些实施方案中，基板材料和涂层具有不同的热膨胀系数，这可以导致剥落。
152.在一些情况下，去除表面材料的一部分的步骤可以通过烧蚀引起。当入射峰值功率密度较高、脉冲持续时间较短、入射功率较高和/或入射辐射在可见光范围内时，这种机制可为可能的。烧蚀可包括阵列或基板材料的局部键断裂和/或汽化。
153.在一些情况下，去除表面材料的一部分的步骤可以通过等离子体产生引起。当入
射辐射的脉冲持续时间特别短、入射辐射的波长与多光子电离机制共振，和或入射辐射的波长非常短时，这种机制可为可能的。与局部加热相比，皮秒至飞秒量级的脉冲持续时间可得到更快的等离子体产生，从而导致对基板或表面材料的光学蚀刻。
154.在一些情况下，去除表面材料的一部分的步骤可以通过冲击波产生而发生。当峰值功率密度较高、声子共振和/或脉冲持续时间较短时，这种机制可能更加有可能。冲击可以引起表面或阵列材料的物理振动、剥落或晃动。
155.在一些情况下，去除表面材料的一部分的步骤是光化学去除，例如光电离。在一些情况下，去除表面材料的一部分的步骤包括光声去除，例如通过冲击波的光学产生。术语和定义
156.除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语均具有与本公开所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
157.如本文所使用的，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。除非另有说明，否则本文中对“或”的任何引用旨在涵盖“和/或”。
158.如本文所用，术语“约”是指接近所述量达10％、5％或1％的量，包括其中的增量。
159.如本文所用，术语“pbmc”是指外周血单核细胞。
160.如本文所用，术语“正交”是指垂直布置或关系。实施例
161.以下说明性实施例代表本文描述的软件应用程序、系统和方法的实施方案，并且并非意图以任何方式进行限制。实施例1
‑
涂覆有铬的微孔阵列的制备：
162.向购自income inc.的玻璃微孔阵列(c00113，3005722，20μm孔，60％的孔覆盖率)于lga薄膜上溅射厚度为100nm的铬(santa clara,ca，真空度：8
×
10
‑2×
l0
‑
2 mbar，溅射电压：100v至3kv，电流：0至50ma)。仅在孔板的一侧溅射铬。然后，首先将涂覆有铬的微孔阵列用1m naoh溶液浸泡12小时，用10％的漂白剂浸泡长达1小时，然后喷水以去除任何残留的漂白剂并吹干，然后装载细胞。实施例2
–
盒组装：
163.盒包括(从顶部到底部)：密封到盒顶部的玻璃；用于保持微孔板的铝合金框架；与微孔板的间隔保持一致或可变距离的接收玻璃板。将不同体积(取决于盒尺寸)的具有0.1％pluoronic f68(目录号24040032，thermofisher scientific inc.)的接收介质(optipeak t细胞介质，invitria,junction city,ks)添加到接收板中。将涂覆有铬的微孔阵列组装到盒中，其中涂覆有铬的一侧朝下(面向接收介质)。添加到接受介质中的pluoronic f68可以将从孔中提取的细胞的活力从0％提高到>75％。实施例3
‑
用涂覆有铬的微孔阵列进行细胞分选：
164.将在optipeak t细胞介质中的密度为200万个/ml的pbmc滴在微孔阵列的顶部，并沉降5分钟，以通过表面张力将单个细胞捕获在微孔的底部。之后，将盒安装在细胞分选仪上。10
‑
100％的激光功率可用于从微孔中提取细胞。微孔底部边缘处的铬涂层吸收了ir激光能量，并且铬薄层被去除。弯月面破裂，细胞从期望的微孔中释放出来。实施例4
‑
具有ir吸收性核的琼脂糖珠粒的制造：
165.该过程描述了具有透明壳和ir吸收性核的琼脂糖珠粒的制备。
166.步骤1.将50mg superdex珠粒(superdex 75 100/300gl,ge healthcare life sciences)悬浮于1ml丙酮中。以2000rpm离心以收集superdex珠粒。弃去丙酮。在丙酮中制备饱和的红外吸收性染料(epolight 1178，epolin，新泽西，美国)溶液1ml。以5000rpm离心以除去所有未溶解的ir染料。将ir染料溶液加入superdex珠粒中。在室温下在持续搅拌下温育30分钟。以1500rpm离心混合物。弃去顶部液体。仅将深色沉淀保存在底部。不用丙酮进一步洗涤，将所得深色沉淀悬浮在0.2％bsa
‑
pbs中。这得到均匀地掺入ir染料的superdex珠粒。
167.步骤2.为了从珠粒的外部去除染料，在不到15秒的时间内，通过移液在1:1的丙酮
‑
水混合物中冲洗珠粒。之后，立即将混合物以1000rpm离心30秒，并弃去顶部液体。这将得到ir核结构。
168.可替代地，可以通过将来自步骤1的珠粒在0.2％bsa
‑
pbs中在4度下温育>5天来制备ir吸收性核。每天更换缓冲液1次。这将仅通过分子扩散将来自superdex珠粒的ir染料缓慢溶解。
169.ir染料微球的功效示于下表1中。
170.铬微球的功效示于下表2中。实施例5
‑
使用pluronic f68作为介质补充剂的单个pbmc活力：
171.该过程描述了用于在细胞分选过程中增强细胞活力的介质补充剂。将细胞悬浮并收获在补充有0.1％pluronic f68和1x青霉素/链霉素的用于细胞装载和收获的optipeak t淋巴细胞完全培养基(777opt069)中。在此实施例中，对于具有20μm微孔尺寸的示例性阵列，三个样品中每个样品的百分比活力分别测量为81％、74％和
65％。实施例6
‑
pbmc提取：
172.该过程描述了包含目标颗粒和珠粒的溶液。
173.将含有人pbmc细胞的溶液滴在微孔阵列的顶部。10分钟后，将单个pbmc装载到微孔中。然后，将包含对照珠粒(涂覆有ir染料的tio2珠粒)，或琼脂糖和右旋糖酐珠粒，或琼脂糖和ir染料微球的溶液装载到微孔阵列的顶部。15
‑
30分钟后，将珠粒通过重力装载到微孔中。将具有细胞和珠粒的孔阵列安装在含有细胞培养介质的接收储器的顶部。将ir脉冲激光引导至对准装载珠粒的孔的底部，并将细胞提取到细胞培养介质中。提取后，收获含有提取的细胞的细胞培养介质以进行活力测定。实施例7
‑
细胞活力：
174.该过程描述了确定细胞活力。
175.通过定量夹心elisa测定(人ifn
‑
γelispot试剂盒，r&dsystems inc.，编号el285)确定细胞活力。该测定采用了对人细胞因子干扰素γ(ifn
‑
γ)有特异性的捕获抗体，该抗体被预先包被在pvdf支持的微板上。将收获的细胞直接移液到孔中，并且使分泌细胞附近的经固定抗体与分泌的人ifn
‑
γ结合。洗涤步骤并与生物素化的检测抗体一起温育后，添加与链霉亲和素缀合的碱性磷酸酶。随后通过洗涤去除未结合的酶，并加入底物溶液。蓝色着色沉淀可在细胞因子的位点处形成，并以斑点的形式出现，其中每个单独的斑点代表单个的人ifn
‑
γ分泌细胞。对斑点进行计数。还以与收获的细胞样品相同的方式铺板(plated)了具有已知活细胞数的系列稀释的标准细胞样品。通过计数每个孔中的蓝色斑点，绘制标准曲线。通过标准曲线确定收获的样品中的活细胞数。
176.虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员显而易见的是，仅以举例的方式提供这些实施例。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。应该理解的是，在实践本发明时可以采用本文所述的本发明实施方案的各种可替代方案。