用于制备具有受控湿度的高亲水性类型产物的方法与流程

用于制备具有受控湿度的高亲水性类型产物的方法
1.本发明包括一种用于经由在合适的喷雾干燥设备中应用以下喷雾干燥参数进行喷雾干燥来制备具有受控湿度的高亲水性类型产物的方法：
2.入口n2温度(℃)150至300出口n2温度(℃)50至150
3.从而将经喷雾干燥的高亲水性类型产物的水含量控制在1％w/w至20％w/w的范围内。
4.高亲水性类型产物(诸如寡核苷酸)是为了获得通常冻干的固体形式的产物。由于其高吸湿性，高亲水性类型产物的冻干粉末往往带静电，不能自由流动，因此非常难以管理。为了获得一定的湿度和可管理的粉末形式，冻干粉末通常要经历额外的条件处理(conditioning，调节)程序，其中使粉末暴露于处于一定温度和湿度的气候室中的水蒸气(参见wo 2018/215391；第69页，第5行)。
5.该额外步骤耗费时间和资源，并且不利于此类产物的较大规模制造。
6.因此，本发明的目的是找到这样一种方法，该方法避免该额外的条件处理步骤并且允许生产具有受控湿度的高亲水性类型产物。
7.发现本发明的目的可通过用于制备具有受控湿度的高亲水性类型产物的方法来达到，其特征在于将高亲水性类型产物的水溶液在合适的喷雾干燥设备中应用以下喷雾干燥参数进行喷雾干燥：
8.入口n2温度(℃)150至300出口n2温度(℃)50至150
9.从而将经喷雾干燥的高亲水性类型产物的水含量控制在1％w/w至20％w/w的范围内。
10.在此，阐述以下定义以说明和定义用于描述本发明的各种术语的含义和范围。
11.术语高亲水性类型产物是指由于其分子结构而显示出高极性并因此显示对水的高亲和性(并因此展现出非常高的吸湿性)的产物。此类产物的实例是肽或寡核苷酸。
12.在优选的实施例中，术语高亲水性类型产物代表寡核苷酸。
13.图1示出了与非吸湿性化合物相比，高亲水性寡核苷酸的与相对湿度相关的吸收水从而增加重量的特性。
14.本文中所使用的术语寡核苷酸被定义为技术人员通常将其理解为包含两个或更多个共价连接的核苷酸的分子。为了用作具有治疗价值的寡核苷酸，寡核苷酸通常被合成为长度为10至40个核苷酸，优选地为10至25个核苷酸。
15.寡核苷酸可由任选地修饰的dna、rna或lna核苷单体或其组合组成。
16.lna核苷单体是经修饰的核苷，其在核苷酸的核糖环的c2'与c4'之间包含连接基基团(称为双基(biradicle)或桥)。这些核苷在文献中也称为桥连核酸或双环核酸(bna)。
17.如本文所用，任选地修饰的是指与等效dna、rna或lna核苷相比，通过引入糖部分或核碱基部分的一种或多种修饰而修饰的核苷。在优选的实施例中，经修饰的核苷包含经修饰的糖部分，并且可以例如包含一个或多个2’取代的核苷和/或一个或多个lna核苷。术
语经修饰的核苷在本文中还可与术语“核苷类似物”或经修饰的“单元”或经修饰的“单体”互换使用。
18.dna、rna或lna核苷通常由将两个核苷共价偶联在一起的磷酸二酯(p＝o)和/或硫代磷酸酯(p＝s)核苷间键连接。
19.因此，在一些寡核苷酸中，所有核苷间键都可由磷酸二酯(p＝o)组成，在其他寡核苷酸中，所有核苷间键都可由硫代磷酸酯(p＝s)组成，或者在又其他寡核苷酸中，核苷间键的序列不同并且包含磷酸二酯(p＝o)和硫代磷酸酯(p＝s)核苷间两者。
20.核碱基部分可以由每个相应核碱基的字母代码来表示，例如a、t、g、c或u，其中每一个字母可以任选地包括具有同等功能的经修饰的核碱基。例如，在示例的寡核苷酸中，对于lna核苷，核碱基部分用大写字母a、t、g和
me
c(5-甲基胞嘧啶)描述，对于dna核苷，核碱基部分用小写字母a、t、g、c和
me
c描述。经修饰的核碱基包括但不限于带有保护基团的核碱基，该保护基团为诸如叔丁基苯氧基乙酰基、苯氧基乙酰基、苯甲酰基、乙酰基、异丁酰基或二甲基甲脒基(dimethylformamidino)(参见维基百科，phosphoramidit-synthese,https://de.wikipedia.org/wiki/phosphoramidit-synthese,2016年3月24日)。
21.优选地，寡核苷酸由任选地修饰的dna、rna或lna核苷单体或其组合组成，并且长度为10至40个核苷酸，优选地为10至25个核苷酸。
22.寡核苷酸可以是5'氨基修饰的，这表示氨基连接基附接到寡核苷酸的5'末端基团。连接基优选地为具有2至12个碳原子的脂族烷基基团或含有1至10个乙二醇单元的乙二醇连接基。
23.优选的5’氨基修饰剂选自任选地经氨基基团保护的氨基c
2-12-烷基连接基或含有1至10个乙二醇单元的氨基乙二醇连接基。
24.用于5’氨基修饰的寡核苷酸的合适的氨基保护基团是三氟乙酰基(tfa)或单甲氧基三苯甲基(mmt)。
25.通常，氨基连接基经由可商购获得的氨基连接基亚磷酰胺被引入，诸如例如经由tfa-或mmt-c
6-连接基亚磷酰胺(例如来自sigma aldrich)或经由来自glen research的5'氨基修饰剂teg(三乙二醇)ce亚磷酰胺。
26.寡核苷酸合成的原理在本领域中是众所周知的(参见例如寡核苷酸合成；维基百科，免费百科全书；https://en.wikipedia.org/wiki/oligonucleotide synthesis，2016年3月15日)。
27.如今，更大规模的寡核苷酸合成是使用计算机控制的合成仪以自动化方式进行的。
28.通常，寡核苷酸合成是一种固相合成，其中正在组装的寡核苷酸通过其3'-末端羟基共价结合至固体支持物材料，并在整个链组装过程中与其保持附接。合适的支持物是市售的大孔聚苯乙烯支持物，如ge healthcare的primer support 5g或kinovate的hl支持物。
29.寡核苷酸合成在原理上是将核苷酸残基逐步添加到生长链的5'-末端，直到组装出所需的序列。
30.通常，每次添加都称为合成循环，且在原理上由化学反应组成
31.a1)将固体支持物上的受保护的羟基基团解封，
32.a2)将作为活化的亚磷酰胺的第一个核苷与固体支持物上的游离羟基基团偶联，
33.a3)氧化或硫化相应的p-连接的核苷以形成相应的磷酸二酯(p＝o)或相应的硫代磷酸酯(p＝s)；
34.a4)任选地，将固体支持物上的任何未反应的羟基基团封端；
35.a5)将附接至固体支持物的第一个核苷的5'羟基基团解封；
36.a6)将作为活化的亚磷酰胺的第二个核苷偶联以形成相应的p-连接的二聚体；
37.a7)氧化或硫化相应的p-连接的二核苷以形成相应的磷酸二酯(p＝o)或相应的硫代磷酸酯(p＝s)；
38.a8)任选地，将任何未反应的5'羟基基团封端；
39.a9)重复前面的步骤a5到a8，直到组装出所需的序列。
40.随后的从树脂上的裂解可以用浓氨水进行。磷酸酯和核苷酸碱基上的保护基团也在此裂解过程中被去除。
41.在进一步的实施例中，寡核苷酸可包含细胞靶向部分，用于将寡核苷酸靶向给定受体，诸如例如asyalglycoprotein受体(参见x.huang等人,bioconjugate.chem.2017,28,283-295)
42.在优选的实施例中，细胞靶向部分包含1至3个n-乙酰半乳糖胺(galnac)配体。
43.典型的包含galnac的细胞靶向部分可选自：
44.[0045][0046]
或选自以下式的部分
[0047][0048]
其中r2是氢或羟基保护基团，并且n是从0到10的整数，优选地是从0到5的整数，更优选地是从1到3的整数，但最优选地是2，其对映异构体和/或立体异构体。
[0049]
合适的羟基保护基团是酰基，特别是c
1-12-烷基羰基基团，更特别是c
1-6-烷基羰基基团，其任选地被c
1-6-烷基或苯基取代。更优选的是乙酰基、新戊酰基或苯甲酰基，其中乙酰基是最优选的羟基保护基团。
[0050]
在更优选的实施例中，包含galnac的细胞靶向部分可选自式v的部分。
[0051]
在进一步优选的实施例中，寡核苷酸是包含如上所述的5’氨基修饰的寡核苷酸的galnac寡核苷酸缀合物。
[0052]
高亲水性类型产物的纯化遵循本领域技术人员对于该类型产物通常已知的方法。
[0053]
通常，纯化包括层析、浓缩和分离的步骤，而层析和浓缩步骤可以重复应用。
[0054]
对于作为优选的高亲水性类型产物的寡核苷酸，合适的纯化程序包括以下顺序的步骤
[0055]
a)层析
[0056]
b)浓缩
[0057]
c)分离
[0058]
或者优选地，
[0059]
d)阴离子交换层析或反相层析
[0060]
e)切向流过滤
[0061]
f)冻干
[0062]
术语“层析”包括阴离子交换层析法或反相层析法及其组合。
[0063]
阴离子交换层析是基于样品溶液的带电离子与所用缓冲介质的竞争性相互作用。它可以用常规的可商购获得的阴离子交换树脂，优选地具有三甲基铵官能化的那些树脂进行。这些相材料可以例如从ge healthcare、tosoh bioscience、bio-rad或merck获得。使用从tosoh bioscience可获得的阴离子交换树脂tskgel super q-5pw(qae)取得了特别好的结果。
[0064]
反相层析可以使用传统的可商购获得的相材料(诸如改性硅胶吸附剂作为固定相)和合适的有机溶剂(诸如乙腈)以及缓冲液(如果适用的话)进行。合适的改性硅胶型相材料可选自kromasil
tm c18、kromasil
tm c8、ymc triart c18和ymc triart c8。使用来自ymc的triart prep c8-s取得了特别好的结果。
[0065]
术语浓缩包括切向流过滤法或蒸发法及其组合。
[0066]
在切向流过滤或横向流过滤中，进料相对于渗透侧在正压下(切向地)通过过滤膜。一部分小于膜孔径的物质作为渗透液或滤液通过膜；其他所有物质都作为渗余物保留在膜的进料侧。切向流过滤的原理也用于纳滤、超滤、渗滤和微滤工艺。合适的膜是可商购获得的，例如来自merck millipore商品名为pellicontm。合适的膜具有≤3kda的截留分子量(mwco)。优选mwco分别为1kda或3kda的膜merck millipore pellicon 2和3。
[0067]
如上所述，用于制备具有受控湿度的高亲水性类型产物的方法的特征在于将高亲水性类型产物的水溶液在合适的喷雾干燥设备中应用以下喷雾干燥参数进行喷雾干燥：
[0068]
入口n2温度(℃)150至300出口n2温度(℃)50至150
[0069]
从而将经喷雾干燥的高亲水性类型产物的水含量控制在1％w/w至20％w/w的范围内。
[0070]
在优选的实施例中，喷雾干燥参数为：
[0071]
进料溶液中高亲水性类型产物浓度(％w/w)1至50入口n2温度(℃)180至220出口n2温度(℃)70至100
[0072]
在更优选的实施例中，喷雾干燥参数为：
[0073]
进料溶液中高亲水性类型产物浓度(％w/w)5至25入口n2温度(℃)180至220出口n2温度(℃)70至100
[0074]
工艺参数通常取决于所应用的喷雾干燥设备。
[0075]
然而，干燥气体速率/进料速率比和喷嘴气体速率/进料速率比是与干燥室的尺寸和雾化器的类型无关的无量纲参数。
[0076]
通常，干燥气体速率与进料速率的比率因此选在1至200之间，优选地在10至150之间，并且喷嘴气体速率与进料速率的比率在0.5至10之间，优选地在1至8之间。
[0077]
适用于本发明方法的喷雾干燥设备是本领域常见的设备，包括带有雾化器的喷雾室和可能的后续设备，诸如例如用于收集经喷雾干燥的粉末的旋风分离器和用于从气体中
清除残留颗粒的过滤单元。
[0078]
雾化器的作用是将进料溶液以小液滴的形式精细分散到喷雾室中，并使其暴露于热气。
[0079]
气体通常是惰性气体，通常是氮气。
[0080]
雾化器通常选自压降喷嘴或双流体喷嘴或者选自旋转式雾化器。
[0081]
常见的喷雾干燥设备是可商购获得的，例如来自gea(niro sd micro)、来自anhydro(spx)或来自b
ü
chi(b
ü
chi mini)。
[0082]
参数的组合决定了对分散液滴的干燥，并最终控制经喷雾干燥的产物的湿度。
[0083]
在优选的实施例中使用了双流体喷嘴。
[0084]
典型的进一步的干燥参数为：
[0085]
干燥气体速率(kg/h)10至50，优选地为15至25喷嘴气体速率(kg/h)0.5至3，优选地为0.8至1.5进料速率(g/min)3至18，优选地为7至13
[0086]
经喷雾干燥的高亲水性类型产物的残留水含量可优选地被控制在5％w/w至15％w/w的范围内，更优选地在10％w/w至15％w/w的范围内。
[0087]
经喷雾干燥的高亲水性类型产物的堆积密度可被调整在0.1g/ml至0.5g/ml的范围内，优选地在0.3g/ml至0.5g/ml的范围内。
[0088]
如上所述，优选的高亲水性类型产物是寡核苷酸，优选地为这样的寡核苷酸，该寡核苷酸由任选地修饰的dna、rna或lna核苷单体或其组合组成，并且长度为10至40个核苷酸，优选地为10至25个核苷酸，它们任选地被5'氨基修饰并且包含如上定义的包含galnac的细胞靶向部分。
[0089]
举例来说，选择了以下寡核苷酸：
[0090]
gn2-am-c6-5`-cag*
me
c*g*t*a*a*a*g*a*g*a*g*g-3`
[0091]
5'-t*g*g*c*a*a*g*c*a*t*c*c*t*g*t*a-3'
[0092]
gn2-am-c6-5`-cac*c*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*a*g*a*c-3`
[0093]
其中am-c6是指c6氨基连接基；*代表硫代磷酸酯桥；a、g、t和
me
c(5-甲基胞嘧啶)是lna核苷单体，并且a、t、c、g是dna核苷单体，并且gn2是上述式v的galnac簇部分(n＝2；r2＝乙酰基)。
[0094]
本文公开的化合物具有以下核碱基序列
[0095]
seq id no.1:cagcgtaaagagagg'
[0096]
seq id no.2:tggcaagcatcctgta
[0097]
seq id no.3:cacctatttaacatcagac
[0098]
实例
[0099]
gn2-am-c6-5`-cag*
me
c*g*t*a*a*a*g*a*g*a*g*g-3`的制备
[0100]
标题产物已根据国际专利公开wo 2018/215391的实例3b制备并根据实例4b1纯化。
[0101]
实例1
[0102]
gn2-am-c6-5`-cag*
me
c*g*t*a*a*a*g*a*g*a*g*g-3`的喷雾干燥
[0103]
在室温下将13g标题寡核苷酸溶解在117g水中。通过并流双流体喷嘴(
温度50℃，氮气雾化流速0.8kg/h)将该溶液进料到niro sdmicrotm(gea process engineering a/s,soeborg denmark)中。以10g/min的液体进料速率和15kg/h的氮气流速将进料雾化成热氮气流(入口温度220℃)。获得的出口温度为大约70℃。通过与干燥室连接的旋风分离器将生成的固体从气流中分离到玻璃瓶中：收集到11.4g固体，其残留水含量为12.3％w/w(针对水含量90％校正的分离产率)，并且堆积密度为0.45g/ml。
[0104]
实例2至31
[0105]
以下实例是根据实例1做出的，但关键参数有所变化。
[0106]
[0107][0108]
*干燥气体速率/进料速率比和喷嘴气体速率/进料速率比是与干燥室和雾化器的尺寸无关的无量纲参数。
[0109]
选择的堆积密度：
[0110][0111]
比较实例
[0112]
标题产物已根据国际专利公开wo 2018/215391的实例3b制备，根据实例4b1纯化并根据实例4b2冻干。
[0113]
获得的材料非常吸湿，带静电，不能自由流动，因此难以管理。
[0114]
因此，将该材料在气候室中在21℃和50％相对湿度下进行条件处理，直到48h后达到重量恒定。
[0115]
实例32至34
[0116]
实例32至34已对lna执行以下操作
[0117]
·
5'-t*g*g*c*a*a*g*c*a*t*c*c*t*g*t*a-3’(实例32和33)
[0118]
·
gn2-am-c6-5`-cac*c*t*a*t*t*t*a*a*c*a*t*c*a*g*a*c-3`(实例34)根据实例1。
[0119]