用于将配体偶联至复合材料的方法与流程

用于将配体偶联至复合材料的方法


背景技术：

1.在20世纪70年代首次引入基于膜的水处理方法。此后，基于膜的分离技术已经用于许多其他行业。在医药行业和生物技术行业中，使用制备色谱、直流(direct flow)过滤(dff)和切向流过滤(tff)(包括微滤、超滤、纳滤和渗滤)是用于分离溶解分子或悬浮颗粒的确立已久的方法。对于生物分子制造中的分离和纯化而言，超滤(uf)膜和微滤(mf)膜已经成为必不可少的。生物分子制造(无论其规模如何)通常采用一个或多个使用过滤的步骤。这些膜分离的吸引力在于几个特征，所述特征包括例如高分离能力和简单性，仅需在进料流与渗透物之间施加压差。这种将样品简单且可靠地一步过滤成两个部分使膜分离成为用于分离和纯化的有价值的方法。
2.缀合至复合材料(如膜)的流体可及表面的配体可用于分离和纯化方法。然而，膜的化学改性比树脂更具挑战性。树脂可以容易地悬浮在溶液中，并且因此树脂可以在大型反应器中改性(其中通过搅拌悬浮液来促进试剂扩散至树脂中)。对膜进行改性更具挑战性，因为它们必须在改性过程期间被支撑以避免损坏膜结构。这可以在卷对卷方法(roll-to-roll process)中实现，其中当反应动力学非常快时，膜以物理方式移动通过反应溶液的槽。用较慢的反应化学过程(chemistry)对膜进行改性(如蛋白a配体与活性膜的偶联)需要较长的反应时间。较长的反应时间使卷对卷膜改性方法行不通，所述卷对卷膜改性方法需要膜的极慢移动并且因此需要极长处理时间。
3.需要复合材料改性方法，其中反应溶液在长时间段内流动通过复合材料的支持组件。增加配体与复合材料的偶联提高亲和介质的结合容量。缀合方法应当充分利用快速、有效且易于控制的反应来将配体偶联至复合材料。


技术实现要素：

4.在一个方面，本发明涉及用于将配体偶联至官能化的复合材料的方法，其中所述官能化的复合材料被布置成共同延伸的片材的共面堆叠、管状配置或螺旋卷绕配置，所述方法包含以下步骤：
5.a.提供官能化的复合材料，所述官能化的复合材料包含：
6.i.支持构件，所述支持构件包含延伸通过所述支持构件的多个孔；以及
7.ii.大孔交联凝胶，其中所述大孔交联凝胶包含由一种或多种可聚合单体与一种或多种交联剂反应形成的聚合物；所述大孔交联凝胶包含多个侧挂反应性官能团；所述大孔交联凝胶位于所述支持构件的所述孔中；并且所述大孔交联凝胶的所述大孔小于所述支持构件的所述孔；以及
8.b.使第一溶液以第一流速基本上流动通过或基本上流动横跨(across)所述官能化的复合材料，其中所述第一溶液包含多个第一配体，使得在所述反应性官能团与所述第一配体之间形成多个共价键。
附图说明
9.图1a描绘了堆叠在夹层(例如，筛网)之间的示例性复合材料的示意图，其中流体基本上流动横跨官能化的复合材料的层(切向流)。
10.图1b描绘了堆叠在夹层(例如，筛网)之间的示例性复合材料的示意图，其中流体基本上流动通过官能化的复合材料的层(直流)。
11.图2示出呈螺旋卷绕配置的具有夹层的示例性复合材料。
12.图3示出与使用分批法缀合的膜相比，使用流通法(flow through method)缀合的蛋白a亲和配体膜在10膜体积/分钟的流速下的igg动态结合容量。
13.图4是图示说明组装在色谱柱中的复合材料层(即，膜)、夹层(即，筛网)和流量分配层的草图。将包含10个膜的该图案再重复9次，直至组装100个膜。然后，添加一个额外的流量分配层。
14.图5a示出随着堆叠内的膜位置而变化的igg动态结合容量。
15.图5b示出随着堆叠内的膜位置而变化的膜通量。
16.图6是图示说明不同位置的草图，其中在用筛网夹层的螺旋卷绕卷上与蛋白a配体切向流偶联后，将复合材料的圆形区段从矩形膜片材中取出。
具体实施方式
17.概述
18.亲和介质的容量很大程度上取决于可以缀合至介质(如复合材料)的流体可及表面的亲和配体的量。增加配体与复合材料偶联的缀合方法将增加结合容量。在一些实施方案中，这些方法充分利用快速、有效且易于控制的反应来使复合材料官能化。在一些实施方案中，复合材料是吸附性大孔色谱膜。在一些实施方案中，与分批或静态缀合方法相比，涉及使配体溶液直接流动通过膜(即，死端流(dead-end flow))或流动横跨膜(即，切向流)的用于亲和配体缀合的方法产生具有改善的动态结合容量的亲和膜。
19.色谱膜利用快速对流传质机制来促进快速纯化或分离操作。然而，为了使这些操作的生产率最大化，膜对目标化合物的结合容量必须被最大化。在一些实施方案中，本发明描述了用于在流速、缓冲液ph和浓度、亲和配体浓度和暴露时间的适当条件下将配体缀合至含有侧挂反应性官能团的膜的流通(flowthrough)或死端流方法。在一些实施方案中，本发明描述了用于在流速、缓冲液ph和浓度、亲和配体浓度和暴露时间的适当条件下将配体缀合至含有侧挂反应性官能团的膜的错流或切向流方法。在一些实施方案中，所述方法产生缀合亲和色谱膜，所述缀合亲和色谱膜的蛋白质结合容量大于通过使用类似缓冲条件和亲和配体使用分批、非流动缀合方法所实现的蛋白质结合容量。
20.流通缀合方法和错流缀合方法产生始终较高的膜结合容量，并且可以在含有在线(in-line)测量工具的设备上进行，所述在线测量工具容许实时观察反应进展以及由此优化反应过程。与快速结合动力学相结合的较高的膜结合容量实现快速、高生产力的色谱纯化操作。
21.定义
22.为方便起见，在进一步描述本发明之前，在此处收集说明书、实施例和所附权利要求中采用的某些术语。这些定义应当根据本公开的其余部分来解读，并且为本领域技术人
员所理解。除非另有定义，否则本文使用的全部技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
23.在描述本发明时，在说明书中使用各种术语。标准术语广泛地用于过滤、流体输送和一般流体处理领域中。
24.冠词“一个(种)(a和an)”在本文中用于指该冠词的语法对象中的一个(种)或超过一个(种)(即，至少一个(种))。例如，“要素(an element)”是指一个(种)要素或超过一个(种)要素。
25.术语“包含(comprise和comprising)”用于包含性、开放性意义，这意味着可以包括附加的要素。
26.术语“包括”用于意指“包括但不限于”。“包括”和“包括但不限于”可互换地使用。
27.术语“亲和色谱”是指基于固定化配体与其结合配偶体之间的特异性结合相互作用的分离方法。特异性结合相互作用的实例包括但不限于抗体/抗原相互作用、酶/底物相互作用和酶/抑制剂相互作用。
28.术语“亲和介质”是指包含多个固定化配体的材料。例如，包含共价结合的配体的复合材料。
29.术语“聚合物”是指由重复单元(单体)的结合形成的大分子。术语聚合物还包括共聚物。
30.术语“共聚物”是指至少两种或更多种不同单体的聚合物。如果交联剂是双官能单体，则共聚物可以由交联剂和单体组成。
31.术语“官能化的复合材料”是指位于支持构件的孔中的包含多个侧挂反应性官能团的大孔交联凝胶。
32.术语“侧挂反应性官能团”是指一官能团，当配体溶液与所述官能团接触时，所述官能团将与所述配体形成一个或多个共价键。将与包含胺基的配体形成共价键的侧挂反应性官能团的实例包括但不限于环氧化物、醛、羧酸、反应性卤素、反应性酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、磺酰卤、碳二亚胺(carboniimide)、酰叠氮、氟苯、碳酸酯、n-羟基琥珀酰亚胺酯、亚氨酸酯和氟苯基酯。将与包含硫醇基团的配体形成共价键的侧挂反应性官能团的实例包括但不限于环氧化物、硫醇、二硫化物、碳-碳双键、碳-碳三键、马来酰亚胺、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物、硫代硫酸酯和反应性卤素。
33.术语“配体”是指结合特定结合配偶体的分子。例如，蛋白质、抗体、激素或药物结合至特定受体。
34.如本文所使用的，术语“蛋白a”或“pra”是指来自金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)的细菌蛋白、蛋白a衍生物或者重组蛋白a，其具有以高亲和力结合免疫球蛋白g(igg)类的哺乳动物抗体的能力。例如，蛋白a可以从其天然来源(例如，金黄色葡萄球菌)中回收。蛋白a可以以合成方式生产(例如，通过肽合成或者通过重组技术)，并且其片段和变体保留结合具有ch2/ch3区(如fc区)的蛋白质的能力。蛋白a可以商业购买(例如，从repligen、pharmacia、emd millipore和fermatech)。蛋白a的基因已经被克隆并且在大肠埃希氏菌(escherichia coli)中表达，从而允许生产大量重组蛋白a和蛋白a衍生物。
35.与偶联方法相关的术语“洗涤溶液”是指将带走偶联反应物的溶液。即，将去除任
何过量可聚合单体和任何过量配体的溶液。
36.与偶联方法有关的术语“淬灭溶液”用于意指包含反应性化合物的溶液，所述反应性化合物将与任何残留的侧挂反应性官能团共价键合以形成非反应性基团。即，反应性化合物将使任何残留的侧挂反应性官能团转化为非反应性基团。
37.术语“非反应性基团”是指在进一步偶联反应和分离方法的条件下不会形成共价键的基团。例如，非反应性基团暴露于包含物质混合物的流体将不造成物质与非反应性基团之间形成共价键。
38.术语“缓冲液”是指通过其酸碱共轭组分的作用抵抗ph变化的溶液。可以用于本文所述方法的各种缓冲液描述于buffers.a guide for the preparation and use of buffers in biological systems,gueffroy,d.,ed.calbiochem corporation(1975)中。不同的缓冲液维持不同的ph范围，例如磷酸盐缓冲液通常用于介于6.0与8.0之间的ph，而对于较高的ph，可以使用硼酸盐缓冲液，并且对于较低的ph，可以使用碳酸盐缓冲液。本领域普通技术人员将能够根据要维持的ph容易地确认待使用的适合的缓冲液。可以在根据本发明的方法中使用的缓冲液的非限制性实例包括mes缓冲液、mops缓冲液、mopso缓冲液、tris缓冲液、hepes缓冲液、磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和铵盐缓冲液、以及这些的组合。
39.与流体流动和过滤有关的术语“错流”用于意指一流体流动或过滤配置，其中流动的流体被沿着复合材料(例如，过滤介质)的表面引导，并且流体的通过此类复合材料的一部分具有速度分量，所述速度分量是“交向的(cross-wise)”(即，与沿着此类复合材料的表面流动的流体的方向垂直)。
40.术语“切向流”或“切向过滤”用于意指一流体流动或过滤方法，其中流动的流体被基本上平行(即，相切)于复合材料(例如，过滤介质)的表面引导，并且流体的一部分通过此类复合材料以提供渗透物。术语“切向过滤”和“错流过滤”在本领域中经常可互换地使用。
41.与流体流动和过滤有关的术语“死端”用于意指一流体流动或过滤配置，其中流动的流体被引导通过复合材料(例如，过滤介质)，并且流体的通过此类复合材料的一部分具有速度分量，所述速度分量是通过的(即，与流动通过此类复合材料的流体的方向平行)。
42.术语“直流”或“直接过滤”用于意指一流体流动或过滤方法，其中流动的流体被引导基本上通过(即，直达)复合材料(例如，过滤介质)的表面，并且大部分流体通过此类复合材料以提供滤液。术语“直接过滤”和“死端过滤”在本领域中经常可互换地使用。
43.术语“渗透物”用于意指流体的通过过滤介质且通过过滤装置中的第一出口端口离开的一部分，所述第一出口端口可操作地连接至此类过滤介质。术语“倾析物(decantate)”用于意指流体的沿着过滤介质的表面流动但不通过此类过滤介质并通过过滤装置中的第二出口端口离开的一部分，所述第二出口端口可操作地连接至此类过滤介质。
44.错流过滤和切向过滤是公知的过滤方法。可以参考例如美国专利号5,681,464、6,461,513、6,331,253、6,475,071、5,783,085、4,790,942(其公开内容通过引用并入本文)。还可以参考“filter and filtration handbook”,4th ed.,t.christopher dickenson,elsevier advanced technology,1997(其公开内容通过引用并入本文)。
45.如本文所使用的，“结合-洗脱模式”是指一种用于色谱的操作方法，其中确立缓冲
条件以使靶蛋白和不期望的污染物两者都结合至色谱载体或复合材料。靶蛋白与其他组分的分级分离随后通过改变条件使得靶蛋白与污染物分别洗脱来实现。在某些实施方案中，本文所述的膜可以以“结合-洗脱模式”使用，其特征在于高传导性、高体积通量和选择性下的高动态结合容量。在某些实施方案中，洗脱液中靶蛋白的量减少约50％至约99％。在某些实施方案中，靶蛋白的聚集体中的洗脱液减少约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％。
46.如本文所使用的，术语“流通模式”是指一种用于色谱的操作方法，其中确立缓冲条件以使完整的靶蛋白在施加后流动通过膜，而污染物选择性地保留。在某些实施方案中，本文所述的膜可以在蛋白a纯化后的过程中以“流通模式”使用，以在单个步骤中去除关键污染物(如dna、宿主细胞蛋白(hcp)、浸出的蛋白a、不期望的聚集体和病毒)。
47.大孔交联凝胶的术语“平均孔径”可以被本领域普通技术人员理解为通过任何适合的方法被确定。例如，平均孔径可以通过表面的环境扫描电子显微镜(esem)图像估算。esem可以是一种用于表征微滤膜的非常简单且有用的技术。可以从顶层、截面和底层角度获得膜的清晰且简洁的图片；孔隙率和孔尺寸分布可以从像片中估算。
48.支持构件的“体积孔隙率”通过简单的计算确定。例如，对于由聚丙烯制成的支持构件，测量支持构件的外部尺寸，并且计算总计体积[例如，对于平坦圆盘：v＝πr2h，支持构件(如果其是实心的或者不是多孔的)的体积]。然后，确定支持构件的质量。因为聚丙烯的密度是已知的或者可以从polymer handbook,edited by brandrup et al.,chapter vii,wiley and sons,new york,1999中确定，因此体积孔隙率按以下实例计算：
[0049]
体积孔隙率＝{(支持构件(如果实心)的体积)-[(支持构件的质量)/(聚丙烯的密度)]}/(支持构件(如果实心)的体积)。
[0050]
在该计算中，支持构件的空隙体积＝(支持构件的外部尺寸的体积)-[(支持构件的质量)/(聚丙烯的密度)]。例如，聚丙烯的密度＝0.91g/cm3。
[0051]
复合材料的体积孔隙率ε是每种复合材料的实验确定值。它由质量计算。大孔交联凝胶被合并至支持构件的空隙体积中。在干燥至恒重之后，测量合并的凝胶的质量。聚合物的微分比容是已知的或者可以从polymer handbook,edited by brandrup et al.,chapter vii,wiley and sons,new york,1999中确定。凝胶可以占据的最大体积是支持构件的空隙体积(如上所述计算)。计算凝胶的体积孔隙率：
[0052]
ε＝{(支持构件的空隙体积)-[(凝胶质量)
×
(凝胶聚合物的微分比容)]}/(支持构件的空隙体积)
[0053]
在一些实施方案中，配体是蛋白a(pra)。pra捕获色谱是生物治疗性单克隆抗体(mab)的下游纯化中的一个重要步骤。pra配体选择性地结合至mab上的fc和/或fab结合结构域，同时允许大多数杂质(宿主细胞蛋白、dna、残留细胞培养基)流动通过树脂。通常在负载步骤之后洗涤pra介质以去除额外的杂质，并且然后在低ph下洗脱捕获的mab。洗脱液中的mab纯度显著更大，并且相对于澄清的细胞培养物也已经浓缩。然而，亲和介质(例如，具有pra)非常昂贵，并且必须在几年内用于许多批料以降低每批料的成本。理想地，亲和介质可以用于其用于纯化单批目标物质(例如，mab)的最大数量的捕获色谱循环(～200)，这会显著降低处理单一批料所需的pra介质的体积。然后，pra介质可以在纯化单批mab之后被处理掉，从而消除与储存树脂相关的成本。目前，大多数用于生物治疗性mab的下游纯化中的
pra介质呈树脂形式。mab向多孔树脂结构中的缓慢传质需要长的负载时间，其中停留时间范围为2min至10min。减少负载步骤期间的停留时间显著地减小pra树脂的动态结合容量，所述动态结合容量被定义为负载至色谱介质上的mab的质量除以色谱介质的体积。较长的负载时间防止使树脂每批次循环超过数次(2-4次)，而无需将pra捕获色谱步骤延长至数天。
[0054]
pra膜可以在短很多的停留时间(例如，0.1-1min)下负载，并且因此提供使捕获色谱步骤快速循环的机会。在一些实施方案中，相对于相同体积的pra树脂，pra膜的快速循环允许在相同时间量内纯化多很多的mab。因此，在给定时间段内，小体积pra膜的快速循环可以用于捕获与循环较少次数的体积大很多的树脂相同量的mab。在一些实施方案中，pra膜提供使用pra膜的完整寿命来处理单批mab的潜力，从而显著地降低用于建立mab下游纯化过程的前期成本并且消除与储存树脂相关的成本。
[0055]
在一些实施方案中，蛋白a是亲和配体。在一些实施方案中，蛋白a是蛋白质、肽或重组蛋白，其包含结合单克隆抗体(例如，igg抗体)的配体和可以与侧挂反应性官能团(例如，cys的硫醇或lys的胺)形成共价键的部分。在一些实施方案中，蛋白a是蛋白质、肽或重组蛋白，其包含与抗体的fc结构域结合的配体和可以与侧挂反应性官能团形成共价键的部分。在一些实施方案中，蛋白a是蛋白质、肽或重组蛋白，其包含与抗体的fab结构域结合的配体和可以与侧挂反应性官能团形成共价键的部分。在一些实施方案中，蛋白a可以与多个侧挂反应性官能团形成多个共价键。在一些实施方案中，蛋白a与官能化的复合材料形成多个共价键。
[0056]
在一些实施方案中，蛋白a包含多个结构域。在一些实施方案中，蛋白a包含1、2、3、4、5、6、7或更多个结构域。在一些实施方案中，蛋白a结构域彼此相同。在一些实施方案中，蛋白a结构域彼此不同。在一些实施方案中，蛋白a是耐降解的。
[0057]
在一些实施方案中，蛋白a固定在固相支持材料上。在一些实施方案中，蛋白a共价键合至复合材料。在一些实施方案中，蛋白a适用于包含与蛋白a共价连接的色谱固体支持基质的亲和色谱树脂或柱。
[0058]
复合材料的化学改性比树脂更具挑战性。例如，具有缓慢反应化学过程的膜的卷对卷改性方法将需要膜极慢移动通过反应溶液和极长的处理时间，这与大规模改性是不相容的。
[0059]
在一些实施方案中，本文公开的配体偶联方法可以用于使复合材料(如膜)改性。
[0060]
在一个方面，本发明涉及用于将配体偶联至官能化的复合材料的方法，所述方法包含以下步骤：
[0061]
a.提供官能化的复合材料，所述官能化的复合材料包含：
[0062]
i.支持构件，所述支持构件包含延伸通过所述支持构件的多个孔；以及
[0063]
ii.大孔交联凝胶，其中所述大孔交联凝胶包含由一种或多种可聚合单体与一种或多种交联剂的反应形成的聚合物；所述大孔交联凝胶包含多个侧挂反应性官能团；所述大孔交联凝胶位于所述支持构件的所述孔中；并且所述大孔交联凝胶的所述大孔小于所述支持构件的所述孔；以及
[0064]
b.使第一溶液以第一流速基本上流动通过或基本上流动横跨所述官能化的复合材料，其中所述第一溶液包含多个第一配体，使得在所述反应性官能团与所述第一配体之
间形成多个共价键；
[0065]
其中所述官能化的复合材料被布置成共同延伸的片材的共面堆叠、管状配置或螺旋卷绕配置。
[0066]
示例性官能化的复合材料
[0067]
凝胶的组成
[0068]
在一些实施方案中，交联凝胶可以通过一种或多种可聚合单体与一种或多种交联剂的原位反应形成。在某些实施方案中，凝胶可以通过一种或多种可交联聚合物与一种或多种交联剂的反应形成。
[0069]
在一些实施方案中，交联聚合物是大孔的。聚合物内的孔隙率可以在聚合期间通过交联度、聚合物网络形成期间聚合物链的溶剂排除、或者两者的一些组合来提高。在一些实施方案中，增加浓度的交联剂产生大孔交联凝胶。在一些实施方案中，孔隙率受到改变聚合物-(稀释剂+单体)相互作用的程度、交联剂的量、稀释剂的量、引发剂浓度和聚合温度的影响。
[0070]
聚合物中的交联度可以通过调整单体比例来调节。聚合物网络中聚合物的链长以及因此的交联度也可以通过使用赋予最终聚合物和膜特定物理化学性质的特定单体来控制。这些“调节”单体可以影响聚合物链与溶剂体系的相互作用。此外，这些单体的亲水性/疏水性会影响所得凝胶的最终水溶胀性质和聚合物网络的亲水/疏水表面性质。
[0071]
为了最小化不具有孔的复合材料的形成，选择溶剂体系和单体以确保存在足够的驱动力以在某一点将增长的聚合物链从溶液中排除，从而形成大孔。具体地，溶剂和非溶剂的混合物被调节以提供适合的反应体系，所述反应体系最初可以溶解全部反应物，但在交联的聚合物链增长至大于某一分子量时充当交联的聚合物链的不良溶剂。具有过高比例的不良溶剂(对于聚合物链)的溶剂体系会导致增长的聚合物链的快速沉淀，这减小孔隙率。大孔的尺寸通常取决于交联剂的性质和浓度、其中形成凝胶的一种或多种溶剂的性质、任何聚合引发剂或催化剂的量、以及成孔剂(porogen)(如果存在的话)的性质和浓度。在某些实施方案中，复合材料可以具有窄的孔尺寸分布。
[0072]
在一些实施方案中，大孔交联凝胶是由于在惰性稀释剂的存在下可聚合单体的自由基交联聚合期间的相分离而形成的。在一些实施方案中，反应体系包含聚合物网络、可溶性聚合物和低分子化合物(单体和稀释剂)以形成大孔交联聚合物。在一些实施方案中，大孔交联凝胶在溶剂中仅轻微溶胀。
[0073]
通常，许多高孔隙度且非刚性的聚合物材料相对弱，并且无法承受典型膜分离过程(例如，液相色谱)期间产生的压力。因此，为了制备机械上适合的膜，在某些实施方案中，包含多孔基材(如由化学惰性聚丙烯制成的织物基材)和多孔交联聚合物两者的复合材料通过在基材孔内直接合成聚合物来生产。
[0074]
在某些实施方案中，当使用环境扫描电子显微镜(esem)检验时，复合材料显示出合并在基材纤维内的连接良好的凝胶网络。
[0075]
在一些实施方案中，高聚合物密度区域的形成(也称为聚合物链的成束或侧向聚集)在高聚合物密度区域之间留下大孔。在一些实施方案中，大孔交联凝胶具有非均相外观。
[0076]
在某些实施方案中，在本发明中用作膜的复合材料描述于美国专利号7,316,919；
8,206,958；8,187,880；8,211,682；8,652,849；8,192,971；8,206,982；8,367,809；8,383,782；8,133,840；9,962,691；10,357,766；和美国专利申请序列号14/190,650、16/055,786和16/516,500(其中的全部均特此通过引用并入)中。
[0077]
在某些实施方案中，本发明涉及本文公开的方法中的任何一种，其中官能化的复合材料包含：
[0078]
i.支持构件，所述支持构件包含延伸通过所述支持构件的多个孔；以及
[0079]
ii.大孔交联凝胶，其中所述大孔交联凝胶包含由一种或多种可聚合单体与一种或多种交联剂的反应形成的聚合物；所述大孔交联凝胶包含多个侧挂反应性官能团；所述大孔交联凝胶位于所述支持构件的所述孔中；并且所述大孔交联凝胶的所述大孔小于所述支持构件的所述孔。
[0080]
在某些实施方案中，本发明涉及本文公开的方法中的任何一种，其中复合材料的大孔交联凝胶具有平均直径为约5nm至约10000nm的大孔。在某些实施方案中，大孔交联凝胶具有平均直径介于约10nm至约3000nm之间的大孔。在某些实施方案中，大孔交联凝胶具有平均直径介于约25nm与约1500nm之间的大孔。在某些实施方案中，大孔交联凝胶具有平均直径介于约50nm与约1000nm之间的大孔。在某些实施方案中，大孔交联凝胶具有平均直径为约50nm、约100nm、约150nm、约200nm、约250nm、约300nm、约350nm、约400nm、约450nm、约500nm、约550nm、约600nm、约650nm或约700nm的大孔。
[0081]
在某些实施方案中，大孔的直径通过本文所述的技术之一来估算。在某些实施方案中，大孔的直径通过毛细流动测孔法(capillary flow porometry)计算。因为仅最大孔隙率是给定材料的特征性质，因此相对于最大孔隙率来定义大孔隙率是合适的。
[0082]
在某些实施方案中，本发明涉及本文公开的方法中的任何一种，其中复合材料的大孔交联凝胶是中性水凝胶、带电水凝胶、聚电解质凝胶、疏水性凝胶、中性凝胶、或者包含官能团的凝胶。在某些实施方案中，本发明涉及本文公开的方法中的任何一种，其中复合材料的大孔交联凝胶是中性水凝胶或带电水凝胶；并且所述中性水凝胶或带电水凝胶选自交联的聚(乙烯醇)，聚(丙烯酰胺)，聚(异丙基丙烯酰胺)，聚(乙烯基吡咯烷酮)，聚(丙烯酸羟甲酯)，聚(环氧乙烷)，丙烯酸或甲基丙烯酸与丙烯酰胺、异丙基丙烯酰胺或乙烯基吡咯烷酮的共聚物，丙烯酰胺-2-甲基-1-丙磺酸与丙烯酰胺、异丙基丙烯酰胺或乙烯基吡咯烷酮的共聚物，(3-丙烯酰胺基-丙基)三甲基氯化铵与丙烯酰胺、异丙基丙烯酰胺或n-乙烯基-吡咯烷酮的共聚物，以及二烯丙基二甲基氯化铵与丙烯酰胺、异丙基丙烯酰胺或乙烯基吡咯烷酮的共聚物。在某些实施方案中，本发明涉及本文公开的方法中的任何一种，其中复合材料的大孔交联凝胶是聚电解质凝胶；并且所述聚电解质凝胶选自交联的聚(丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸)及其盐、聚(丙烯酸)及其盐、聚(甲基丙烯酸)及其盐、聚(苯乙烯磺酸)及其盐、聚(乙烯基磺酸)及其盐、聚(藻酸)及其盐、聚[(3-丙烯酰胺基丙基)三甲基铵]盐、聚(二烯丙基二甲基铵)盐、聚(4-乙烯基-n-甲基吡啶鎓)盐、聚(乙烯基苄基-n-三甲基铵)盐、以及聚(乙烯亚胺)及其盐。在某些实施方案中，本发明涉及本文公开的方法中的任何一种，其中复合材料的大孔交联凝胶是疏水性凝胶；并且所述疏水性凝胶选自丙烯酸乙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸辛酯、丙烯酸十二酯、十八烷基丙烯酰胺、丙烯酸十八酯和苯乙烯的交联的聚合物或共聚物。在某些实施方案中，本发明涉及本文公开的方法中的任何一种，其中复合材料的大孔交联凝胶是中性凝胶；并且所述中性凝胶选自丙烯酰胺、n,n-二
甲基丙烯酰胺、n-甲基丙烯酰基丙烯酰胺、n-甲基-n-乙烯基乙酰胺和n-乙烯基吡咯烷酮的交联的聚合物或共聚物。
[0083]
在某些实施方案中，交联复合材料(例如，膜)进一步用化学官能团或分子种(molecular species)接枝以提供官能化的复合材料。在某些实施方案中，交联聚合物可以通过聚合后改性被官能化以形成官能化的复合材料。在某些实施方案中，包含官能化的交联聚合物的官能化的复合材料可以通过聚合后改性偶联至配体。在该两步法中，过量的侧挂反应性官能团在单独的接枝步骤期间被改性，例如，在硫醇-烯烃聚合期间产生的过量硫醇或烯烃基团。通过控制单体与交联剂的进料比，最终聚合物可以具有过剩的侧挂反应性官能团。官能化的复合材料的侧挂反应性官能团随后可以用于偶联反应(如点击反应)中，以使最终聚合物化学组成和化学性质(chemistry)或官能团进一步改性。在某些实施方案中，复合材料中的交联聚合物含有残留的反应性基团(被称为侧挂反应性官能团，如硫醇或不饱和碳-碳键)，所述反应性官能团可以用于经由偶联反应连接各种配体。在某些实施方案中，该方法可用于制备含有可用于色谱的各种配体的聚合物复合材料(例如，膜)。例如，生物分子(例如，蛋白质)的色谱分离。例如，该方法可以用于向复合材料(例如，膜)引入离子交换官能团(例如，羧酸盐、磺酸盐、季铵盐、胺)、疏水性相互作用部分(如通过使用1-辛硫醇或1-辛烯的辛基)和用于生物亲和色谱的生物分子(如用于单克隆抗体纯化的半胱氨酸-蛋白a)。
[0084]
在一些实施方案中，复合材料显示出高选择性和高流速、低背压、便宜并且允许长的柱寿命、短的处理时间和整体操作灵活性。
[0085]
在某些实施方案中，本发明涉及前述复合材料中的任何一种，其中所述复合材料是膜。
[0086]
在某些实施方案中，本发明涉及前述复合材料中的任何一种，其中所述复合材料的水接触角为约50
°
至约120
°
。
[0087]
多孔支持构件
[0088]
在一些实施方案中，支持构件具有空隙体积；并且支持构件的空隙体积基本上被大孔交联凝胶填充。在一些实施方案中，多孔支持构件的体积孔隙率为约40％至约90％。在一些实施方案中，多孔支持构件的体积孔隙率为约50％至约80％。在一些实施方案中，多孔支持构件的体积孔隙率为约50％、约60％、约70％或约80％。
[0089]
在某些实施方案中，多孔支持件是平坦的。
[0090]
在某些实施方案中，多孔支持件是盘形的。
[0091]
许多多孔基材或膜可以用作支持构件。在一些实施方案中，多孔支持构件由聚合物材料制成。在某些实施方案中，支持件可以是可以低成本获得的聚烯烃。在某些实施方案中，聚烯烃可以是聚(乙烯)、聚(丙烯)或聚(偏二氟乙烯)。提及通过热诱导相分离(tips)或非溶剂诱导相分离制备的经延展的聚烯烃膜。在某些实施方案中，支持构件可以由天然聚合物(如纤维素或其衍生物)制成。在某些实施方案中，适合的支持件包括聚醚砜膜、聚(四氟乙烯)膜、尼龙膜、纤维素酯膜、玻璃纤维或滤纸。在一些实施方案中，支持构件包含选自聚砜、聚醚砜、聚苯醚、聚碳酸酯、聚酯、纤维素和纤维素衍生物的聚合物材料。
[0092]
在某些实施方案中，多孔支持件由织造纤维材料或非织造纤维材料(例如聚烯烃，如聚丙烯)构成。此类纤维织造或非织造支持构件可以具有比tips支持构件更大的孔尺寸，
在一些情况下高达约75μm。支持构件中较大的孔容许形成在大孔凝胶中具有较大大孔的复合材料。也可以使用非聚合物支持构件(如基于陶瓷的支持件)。多孔支持构件可以采用各种形状和尺寸。
[0093]
在一些实施方案中，支持构件呈膜的形式。
[0094]
在一些实施方案中，支持构件的厚度为约10μm至约2000μm、约10μm至约1000μm、或约10μm至约500μm。在一些实施方案中，支持构件的厚度为约30μm至约300μm。在一些实施方案中，支持构件的厚度为约30μm、约50μm、约100μm、约150μm、约200μm、约250μm或约300μm。
[0095]
在一些实施方案中，支持构件的孔的平均孔径为约0.1μm至约50μm。在一些实施方案中，支持构件的孔的平均孔径为约0.1μm至约25μm。在一些实施方案中，支持构件的孔的平均孔径为约0.5μm至约15μm。在一些实施方案中，支持构件的孔的平均孔径为约0.5μm、约1μm、约2μm、约3μm、约4μm、约5μm、约6μm、约7μm、约8μm、约9μm、约10μm、约11μm、约12μm、约13μm、约14μm或约15μm。
[0096]
在其他实施方案中，可以组合多个多孔支持单元(例如，通过堆叠)。在一个实施方案中，多孔支持膜的堆叠(例如，2至10个膜)可以在多孔支持件的空隙内形成凝胶之前组装。在另一个实施方案中，单个支持构件单元用于形成复合材料膜，所述复合材料膜然后在使用前堆叠。
[0097]
凝胶与支持构件之间的关系
[0098]
凝胶可以锚定在支持构件内。术语“锚定”旨在意为凝胶保持在支持构件的孔内，但该术语不一定限于意为凝胶以化学方式结合至支持构件的孔。尽管在一些实施方案中，凝胶可以接枝至支持构件的孔的表面，但凝胶可以通过与支持构件的结构元件缠络和缠结由施加在其上的物理约束来保持，而实际上没有以化学方式接枝至支持构件。
[0099]
在某些实施方案中，交联凝胶是大孔的。在这些情况下，因为大孔存在于占据支持构件的孔的凝胶中，因此凝胶的大孔必须小于支持构件的孔。因此，复合材料的流动特性和分离特性取决于凝胶的特性，但在很大程度上独立于多孔支持构件的特性，条件是支持构件中存在的孔的尺寸大于凝胶的大孔的尺寸。复合材料的孔隙率可以通过用凝胶填充支持构件来调节，所述凝胶的孔隙率部分地或完全地取决于单体或聚合物、交联剂、反应溶剂和成孔剂(如果使用的话)的性质和量。复合材料的性质部分地(如果不是完全地)由凝胶的性质决定。最终结果是本发明提供了对复合材料的大孔尺寸、渗透性和表面积的控制。
[0100]
当存在时，复合材料中大孔的数量并不取决于支持材料中孔的数量。复合材料中大孔的数量可以远大于支持构件中孔的数量，因为大孔小于支持构件中的孔。如上所述，支持材料的孔尺寸对大孔凝胶的孔尺寸的影响通常可忽略。在支持构件的孔尺寸和孔尺寸分布有很大差异、以及在寻求具有非常小的孔尺寸和窄孔尺寸分布范围的大孔凝胶的那些情况下发现了例外。在这些情况下，支持构件的孔尺寸分布的大的变化微弱地反映在大孔凝胶的孔尺寸分布中。在某些实施方案中，具有略窄孔尺寸范围的支持构件可以用于这些情况中。
[0101]
在某些实施方案中，本发明涉及前述复合材料中的任何一种，其中所述复合材料是相对无毒的。
[0102]
复合材料的制备
[0103]
在某些实施方案中，本发明的复合材料可以通过单步法制备。在某些实施方案中，
这些方法可以使用水或其他环境友好型溶剂作为反应溶剂。在某些实施方案中，该方法可以是快速的，并且因此可以导致简单和/或快速的制造过程。在某些实施方案中，复合材料的制备可以是便宜的。
[0104]
在某些实施方案中，复合材料可以通过在一种或多种适合的溶剂中混合一种或多种单体、一种或多种交联剂、一种或多种引发剂以及任选存在的一种或多种成孔剂来制备。在某些实施方案中，所得混合物可以是均质的。在某些实施方案中，混合物可以是异质的。在某些实施方案中，然后可以将混合物引入适合的多孔支持件中，可以在所述多孔支持件中发生凝胶形成反应。
[0105]
在某些实施方案中，可以将成孔剂添加至反应物混合物，其中成孔剂可以被宽泛地描述为成孔添加剂。在某些实施方案中，成孔剂可以选自热力学差的溶剂和可提取聚合物(例如，聚(乙二醇))、表面活性剂和盐。
[0106]
在一些实施方案中，凝胶形成反应必须被引发。在某些实施方案中，凝胶形成反应可以通过任何已知的方法(例如，通过热活化或暴露于uv辐射)引发。在某些实施方案中，反应可以在光引发剂的存在下通过uv辐射引发。在某些实施方案中，光引发剂可以选自2-羟基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮(irgacure 2959)、4,4
’‑
偶氮二(4-氰戊酸)(acva)、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮(dmpa)、二苯甲酮、苯偶姻和苯偶姻醚(如苯偶姻乙醚和苯偶姻甲醚)、二烷氧基苯乙酮、羟烷基苯酮和α-羟甲基苯偶姻磺酸酯。热活化可能需要添加热引发剂。在某些实施方案中，热引发剂可以选自1,1
’‑
偶氮二(环己烷甲腈)(催化剂88)、偶氮二(异丁腈)(aibn)、过硫酸钾、过硫酸铵和过氧化苯甲酰。
[0107]
在某些实施方案中，凝胶形成反应可以通过uv辐射引发。在某些实施方案中，可以将光引发剂添加至凝胶形成反应的反应物，并且可以将含有单体、交联剂和光引发剂的混合物的支持构件暴露于波长为约250nm至约400nm的uv辐射几秒至几小时的时间段。在某些实施方案中，可以将含有单体、交联剂和光引发剂的混合物的支持构件暴露于约350nm下的uv辐射几秒至几小时的时间段。在某些实施方案中，可以将含有单体、交联剂和光引发剂的混合物的支持构件暴露于约350nm下的uv辐射约10分钟。在某些实施方案中，可见波长的光可以用于引发聚合。在某些实施方案中，支持构件在所使用的波长处必须具有低吸光度，使得能量可以通过支持构件传输。
[0108]
在某些实施方案中，进行聚合的速率可能对在大孔凝胶中获得的大孔的尺寸有影响。在某些实施方案中，当凝胶中的交联剂浓度增加至足够的浓度时，凝胶的成分开始聚集以产生高聚合物密度的区域和具有很少或没有聚合物的区域，后者区域在本说明书中被称为“大孔”。这种机制受聚合速率的影响。
[0109]
在某些实施方案中，一旦制备了复合材料，则它们可以用各种溶剂洗涤以去除任何未反应的组分和任何未锚定在支持件内的聚合物或低聚物。在某些实施方案中，适用于洗涤复合材料的溶剂包括水、酸性(例如，hcl)或碱性(例如，naoh)水溶液、水性盐溶液(例如，nacl)、丙酮、甲醇、乙醇、丙醇和dmf。
[0110]
用于将配体偶联至官能化的复合材料的示例性方法
[0111]
本文提供通过使包含配体的第一溶液流动横跨或流动通过官能化的复合材料来将配体偶联至官能化的复合材料的方法。
[0112]
在一个方面，本发明涉及用于将配体偶联至官能化的复合材料的方法，所述方法
包含以下步骤：
[0113]
a.提供官能化的复合材料，所述官能化的复合材料包含：
[0114]
i.支持构件，所述支持构件包含延伸通过所述支持构件的多个孔；以及
[0115]
ii.大孔交联凝胶，其中所述大孔交联凝胶包含由一种或多种可聚合单体与一种或多种交联剂的反应形成的聚合物；所述大孔交联凝胶包含多个侧挂反应性官能团；所述大孔交联凝胶位于所述支持构件的所述孔中；并且所述大孔交联凝胶的所述大孔小于所述支持构件的所述孔；以及
[0116]
b.使第一溶液以第一流速基本上流动通过或基本上流动横跨所述官能化的复合材料，其中所述第一溶液包含多个第一配体，使得在所述反应性官能团与所述第一配体之间形成多个共价键；
[0117]
其中所述官能化的复合材料被布置成共同延伸的片材的共面堆叠、管状配置或螺旋卷绕配置。
[0118]
在某些实施方案中，本发明涉及提供前述官能化的复合材料中的任何一种。
[0119]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第一溶液基本上流动横跨官能化的复合材料。在一些实施方案中，流体流动路径与官能化的复合材料的表面相切(图1a)。在一些实施方案中，切向流提供较低的压降和/或允许由多层复合材料组成的堆叠同时偶联。
[0120]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第一溶液基本上流动通过官能化的复合材料。在一些实施方案中，流体流动路径直接通过官能化的复合材料(图1b)。在一些实施方案中，随着复合材料层数的增加，直流提供增加的压降。在一些实施方案中，压降限制堆叠中的层数。在一些实施方案中，一个或多个夹层用于分配流量。在一些实施方案中，直流增加配体向多孔复合材料结构中的传质速率。
[0121]
在某些实施方案中，交联的大孔凝胶进一步用化学官能团或分子种接枝以提供官能化的复合材料。在某些实施方案中，交联聚合物可以通过聚合后改性被官能化以形成官能化的复合材料。在该两步法中，过量的侧挂反应性官能团在单独的接枝步骤期间被改性，例如，在硫醇-烯烃聚合期间产生的过量硫醇或烯烃基团。通过控制单体与交联剂的进料比，最终聚合物可以具有过剩的侧挂反应性官能团。
[0122]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中侧挂反应性官能团选自醛、胺、碳-碳双键、碳-碳三键、环氧化物、羟基、硫醇、酸酐、叠氮化物、反应性卤素、酰基氯、及其混合物。
[0123]
在所述方法的一些实施方案中，侧挂反应性官能团选自碳-碳双键、碳-碳三键和硫醇。在一些实施方案中，侧挂反应性官能团衍生自包含硫醇官能团的分子或包含不饱和碳-碳键的分子。在一些实施方案中，侧挂反应性官能团衍生自包含硫醇官能团的分子；并且所述包含硫醇官能团的分子选自3-巯基丙酸、1-巯基琥珀酸、包含半胱氨酸残基的多肽、包含半胱氨酸残基的蛋白质、包含半胱氨酸残基的重组蛋白、包含半胱氨酸残基的细菌免疫球蛋白-结合蛋白、包含半胱氨酸残基的重组融合蛋白、半胱胺、1-硫代己糖醇、聚(乙二醇)2-巯基乙醚乙酸、聚(乙二醇)甲醚硫醇、1-硫代甘油、2-萘硫醇、联苯-4-硫醇、3-氨基-1,2,4-三唑-5-硫醇、5-(三氟甲基)吡啶-2-硫醇、1-[2-(二甲基氨基)乙基]-1h-四唑-5-硫醇、1-丙硫醇、1-丁硫醇、1-戊硫醇、1-己硫醇、1-辛硫醇、8-氨基-1-辛硫醇盐酸盐、3,3,4,
4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-十三氟-1-辛硫醇、8-巯基-1-辛醇和γ-glu-cys。
[0124]
在一些实施方案中，包含硫醇官能团的分子选自包含半胱氨酸残基的多肽、包含半胱氨酸残基的蛋白质、包含半胱氨酸残基的重组蛋白、包含半胱氨酸残基的细菌免疫球蛋白-结合蛋白和包含半胱氨酸残基的重组融合蛋白。在一些实施方案中，包含硫醇官能团的分子是包含半胱氨酸残基的蛋白质。
[0125]
在一些实施方案中，侧挂反应性官能团衍生自包含不饱和碳-碳键的分子；并且所述包含不饱和碳-碳键的分子选自1-辛烯、1-己炔、4-溴-1-丁烯、烯丙基二苯基膦、烯丙胺、烯丙醇、3,4-二羟基-1-丁烯、7-辛烯-1,2-二醇、3-烯丙氧基-1,2-丙二醇、3-丁烯酸、3,4-脱氢-l-脯氨酸、月桂酸乙烯酯、1-乙烯基-2-吡咯烷酮、肉桂酸乙烯酯、酰胺或丙烯酸酯。
[0126]
在一些实施方案中，侧挂反应性官能团选自酰基氯、酰叠氮、醛、胺、酸酐、叠氮化物、碳酸酯、碳-碳双键、碳-碳三键、碳二亚胺、羧酸、二硫化物、环氧化物、氟苯、氟苯基酯、卤代乙酰基、羟基、亚氨酸酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、n-羟基琥珀酰亚胺酯、吡啶基二硫化物、反应性酯、反应性卤素、磺酰卤、硫醇和硫代硫酸酯。在一些实施方案中，侧挂反应性官能团选自醛、胺、环氧化物、羟基、酸酐、叠氮化物、反应性卤素和酰基氯。在一些实施方案中，侧挂反应性官能团选自醛、胺、环氧化物和羟基。在一些实施方案中，侧挂反应性官能团选自环氧化物、醛、羧酸、反应性卤素、反应性酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、磺酰卤、碳二亚胺、酰叠氮、氟苯、碳酸酯、n-羟基琥珀酰亚胺酯、亚氨酸酯和氟苯基酯。在一些实施方案中，侧挂反应性官能团选自环氧化物、醛、羧酸、反应性卤素、反应性酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、磺酰卤、碳二亚胺、酰叠氮、氟苯、碳酸酯、n-羟基琥珀酰亚胺酯、亚氨酸酯和氟苯基酯，并且与胺基反应。在一些实施方案中，侧挂反应性官能团选自环氧化物、硫醇、二硫化物、碳-碳双键、碳-碳三键、马来酰亚胺、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物、硫代硫酸酯和反应性卤素。在一些实施方案中，侧挂反应性官能团选自环氧化物、硫醇、二硫化物、碳-碳双键、碳-碳三键、马来酰亚胺、卤代乙酰基、吡啶基二硫化物、硫代硫酸酯和反应性卤素。
[0127]
在一些实施方案中，包含侧挂反应性官能团的一种或多种单体选自甲基丙烯酸缩水甘油酯、丙烯酰胺肟、丙烯酸酐、壬二酸酐、马来酸酐、酰肼、丙烯酰氯、2-溴乙基甲基丙烯酸酯和乙烯基甲基酮。
[0128]
在一些实施方案中，侧挂反应性官能团是醛。在一些实施方案中，包含侧挂反应性官能团的一种或多种单体是乙烯基甲基酮。
[0129]
在一些实施方案中，侧挂反应性官能团是胺。
[0130]
在一些实施方案中，侧挂反应性官能团是环氧化物。在一些实施方案中，包含侧挂反应性官能团的一种或多种单体是甲基丙烯酸缩水甘油酯。
[0131]
在一些实施方案中，侧挂反应性官能团是羟基。
[0132]
在一些实施方案中，第一配体包含第一官能团(functionality)。在一些实施方案中，第一配体还包含至少一个接枝端基；并且第一官能团选自阳离子官能团、阴离子官能团、疏水官能团、亲水官能团、亲硫官能团、氢键供给官能团、氢键接受官能团、π-π键供给官能团、π-π键接受官能团、金属螯合官能团、生物分子和生物离子。在一些实施方案中，第一官能团选自阳离子官能团、阴离子官能团、疏水官能团、亲水官能团、亲硫官能团、氢键供给官能团、氢键接受官能团、π-π键供给官能团和π-π键接受官能团。
[0133]
在一些实施方案中，通过并入官能单体来包括单独的官能团。在一些实施方案中，
每个官能团的相对量可以被容易地且轻易地调节以获得最优性能特性。
[0134]
在一些实施方案中，分子包含第一官能团，并且分子选自甲基丙烯酸2-(二乙基氨基)乙酯、甲基丙烯酸2-氨基乙酯、丙烯酸2-羧基乙酯、甲基丙烯酸2-(甲硫基)乙酯、丙烯酰胺、n-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺、丙烯酸丁酯或甲基丙烯酸丁酯、n,n-二乙基丙烯酰胺、n,n-二甲基丙烯酰胺、丙烯酸2-(n,n-二甲基氨基)乙酯或甲基丙烯酸2-(n,n-二甲基氨基)乙酯、n-[3-(n,n-二甲基氨基)丙基]甲基丙烯酰胺、n,n-二甲基丙烯酰胺、丙烯酸乙酯或甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸羟丙酯、丙烯酸缩水甘油酯或甲基丙烯酸缩水甘油酯、乙二醇苯基醚甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸酐、丙烯酸丙酯或甲基丙烯酸丙酯、n-异丙基丙烯酰胺、苯乙烯、4-乙烯基吡啶、乙烯基磺酸、n-乙烯基-2-吡咯烷酮(vp)、丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸、苯乙烯磺酸、藻酸、(3-丙烯酰胺基丙基)三甲基卤化铵、二烯丙基二甲基卤化铵、4-乙烯基-n-甲基卤化吡啶鎓、乙烯基苄基-n-三甲基卤化铵、甲基丙烯酰氧基乙基三甲基卤化铵、甲基丙烯酸3-磺基丙酯、丙烯酸2-(2-甲氧基)乙酯或甲基丙烯酸2-(2-甲氧基)乙酯、羟乙基丙烯酰胺、n-(3-甲氧基丙基丙烯酰胺)、n-[三(羟甲基)甲基]丙烯酰胺、n-苯基丙烯酰胺、n-叔丁基丙烯酰胺或双丙酮丙烯酰胺。
[0135]
在一些实施方案中，第一官能团是金属螯合官能团。在一些实施方案中，第一官能团包含选自以下的金属螯合官能团：八齿官能团、六齿官能团、四齿官能团、三齿官能团、二齿官能团、亚氨基二羧酸、亚氨基二乙酸和亚氨基二乙酸的盐。
[0136]
在一些实施方案中，金属螯合官能团与多个金属离子络合。在一些实施方案中，金属螯合官能团选自与选自过渡金属离子、镧系元素离子、贫金属离子和碱土金属离子的多个金属离子络合的亚氨基二羧酸、亚氨基二乙酸和亚氨基二乙酸的盐。在一些实施方案中，金属螯合官能团选自与选自镍、锆、镧、铈、锰、钛、钴、铁、铜、锌、银、镓、铂、钯、铅、汞、镉和金的多个金属离子络合的亚氨基二羧酸、亚氨基二乙酸和亚氨基二乙酸的盐。在一些实施方案中，金属螯合官能团是与多个金属离子络合的亚氨基二乙酸或亚氨基二乙酸的盐，其中金属离子是镍或锆。
[0137]
在一些实施方案中，第一官能团是生物分子或生物离子。在一些实施方案中，第一官能团包含选自以下的生物分子或生物离子官能团：白蛋白、溶菌酶、病毒、细胞、人和动物来源的γ-球蛋白、人和动物来源的免疫球蛋白、重组或天然来源的蛋白质包括，合成或天然来源的多肽、白细胞介素-2及其受体、酶、单克隆抗体、抗原、凝集素、细菌免疫球蛋白-结合蛋白、胰蛋白酶及其抑制剂、细胞色素c、肌球蛋白、重组人白细胞介素、重组融合蛋白、蛋白a、蛋白g、蛋白l、肽h、核酸衍生产物、合成或天然来源的dna、以及合成或天然来源的rna。在一些实施方案中，第一官能团包含选自以下的生物分子或生物离子官能团：人和动物来源的γ-球蛋白、人和动物来源的免疫球蛋白、重组或天然来源的蛋白质包括，合成或天然来源的多肽、单克隆抗体、细菌免疫球蛋白-结合蛋白、重组融合蛋白、蛋白a、蛋白g和蛋白l。在某些实施方案中，第一官能团包含选自以下的生物分子或生物离子官能团：多肽、蛋白质、重组蛋白、细菌免疫球蛋白-结合蛋白、重组融合蛋白、蛋白a、蛋白g、蛋白l和肽h。
[0138]
在一些实施方案中，第一官能团包含蛋白a。在一些实施方案中，第一官能团包含蛋白a，所述蛋白a包括选自以下的蛋白a衍生物和重组蛋白a：包含半胱氨酸残基的多肽、包含半胱氨酸残基的蛋白质、包含半胱氨酸残基的重组蛋白、包含半胱氨酸残基的细菌免疫球蛋白-结合蛋白、包含半胱氨酸残基的重组融合蛋白。在一些实施方案中，第一官能团包
含蛋白a，所述蛋白a选自蛋白质、肽或重组蛋白，其包含结合单克隆抗体(例如，igg抗体)的配体和可以与侧挂反应性官能团形成共价键的部分。在一些实施方案中，第一官能团包含蛋白a，所述蛋白a选自蛋白质、肽或重组蛋白，其包含与抗体的fc结构域结合的配体和可以与侧挂反应性官能团形成共价键的部分。在一些实施方案中，第一官能团包含蛋白a，所述蛋白a选自蛋白质、肽或重组蛋白，其包含与抗体的fab结构域结合的配体和可以与侧挂反应性官能团形成共价键的部分。
[0139]
在一些实施方案中，第一配体包含第一官能团和至少一个接枝端基，所述接枝端基选自醛、胺、碳-碳双键、碳-碳三键、环氧化物、羟基、硫醇、及其混合物。在一些实施方案中，至少一个接枝端基是醛。在一些实施方案中，至少一个接枝端基是胺。在一些实施方案中，至少一个接枝端基是碳-碳双键或碳-碳三键。在一些实施方案中，至少一个接枝端基是环氧化物。在一些实施方案中，至少一个接枝端基是羟基。在一些实施方案中，至少一个接枝端基是硫醇。
[0140]
在某些实施方案中，硫醇-烯接枝是用于将生物分子连接至膜的交联聚合物的有吸引力的选择。该反应快速，可以在水性介质中有效进行，在室温下良好地进行，并且可以使用波长相对长的光(365nm)来光引发，其对蛋白质生物活性具有非常有限的影响。此外，它可以允许受控的生物分子连接，这在保持生物分子的生物活性和3d结构方面可能是有利的。
[0141]
在某些实施方案中，可以将具有游离硫醇官能团的任何生物分子固定至本文所述的复合材料上。这对于制备用于生物分离的生物亲和膜或生物催化膜(通过固定一种或多种酶)可以是非常有用的。在某些实施方案中，复合材料可以被寡核苷酸探针官能化以用于dna检测。
[0142]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，所述方法还包含以下步骤：
[0143]
c.使第一洗涤溶液以第二流速基本上流动通过或基本上流动横跨复合材料，从而去除过量的第一配体。
[0144]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，所述方法还包含以下步骤：
[0145]
d.使淬灭溶液以第三流速基本上流动通过或基本上流动横跨复合材料，其中淬灭溶液包含反应性化合物以将任何残留的侧挂反应性官能团转化为非反应性基团；以及
[0146]
e.任选地，使第二洗涤溶液以第四流速基本上流动通过或基本上流动横跨复合材料，以去除任何残留的反应性化合物。
[0147]
在一些实施方案中，步骤b.的第一溶液再循环通过或横跨复合材料。
[0148]
在一些实施方案中，步骤d.的淬灭溶液再循环通过或横跨复合材料。
[0149]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，所述方法还包含以下步骤：
[0150]
c.任选地，使第一洗涤溶液以第二流速基本上流动通过或基本上流动横跨复合材料，以去除任何过量的第一配体；
[0151]
d.使第二溶液以第三流速基本上流动通过或基本上流动横跨官能化的复合材料，其中第二溶液包含多个包含至少三个反应性基团的第二配体和任选存在的包含至少两个
侧挂反应性官能团的可聚合单体，从而在反应性官能团与第二配体之间形成多个共价键，其中第二配体是交联剂。
[0152]
在一些实施方案中，第二配体以至少两部分添加。在一些实施方案中，包含至少两个侧挂反应性官能团的可聚合单体以至少两部分添加。
[0153]
在一些实施方案中，第二配体包含第二官能团。在一些实施方案中，第二配体还包含至少一个接枝端基；并且第二官能团选自阳离子官能团、阴离子官能团、疏水官能团、亲水官能团、亲硫官能团、氢键供给官能团、氢键接受官能团、π-π键供给官能团、π-π键接受官能团、金属螯合官能团、生物分子和生物离子。在一些实施方案中，第二官能团选自阳离子官能团、阴离子官能团、疏水官能团、亲水官能团、亲硫官能团、氢键供给官能团、氢键接受官能团、π-π键供给官能团和π-π键接受官能团。
[0154]
在一些实施方案中，第二配体包含生物分子或生物离子，所述生物分子或生物离子包含至少一个选自胺、羟基和硫醇官能团的接枝端基。在一些实施方案中，生物分子或生物离子选自：白蛋白、溶菌酶、病毒、细胞、人和动物来源的γ-球蛋白、人和动物来源的免疫球蛋白、重组或天然来源的蛋白质包括，合成或天然来源的多肽、白细胞介素-2及其受体、酶、单克隆抗体、抗原、凝集素、细菌免疫球蛋白-结合蛋白、胰蛋白酶及其抑制剂、细胞色素c、肌球蛋白、重组人白细胞介素、重组融合蛋白、蛋白a、蛋白g、蛋白l、肽h、核酸衍生产物、合成或天然来源的dna、以及合成或天然来源的rna。在一些实施方案中，生物分子或生物离子选自：人和动物来源的γ-球蛋白、人和动物来源的免疫球蛋白、重组或天然来源的蛋白质包括，合成或天然来源的多肽、单克隆抗体、抗原、细菌免疫球蛋白-结合蛋白、重组融合蛋白、蛋白a、蛋白g、蛋白l和肽h。在一些实施方案中，第二配体是多肽、蛋白质、重组蛋白、细菌免疫球蛋白-结合蛋白、重组融合蛋白、蛋白a、蛋白g、蛋白l和肽h。
[0155]
在一些实施方案中，第一配体和第二配体相同。在一些实施方案中，第一配体和第二配体不同。
[0156]
在一些实施方案中，包含至少两个侧挂反应性官能团的可聚合单体是聚(乙二醇)二乙烯基醚。
[0157]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，所述方法还包含以下步骤：
[0158]
e.使第二洗涤溶液以第四流速基本上流动通过或基本上流动横跨复合材料，以去除任何过量的第二配体和任选存在的任何过量的可聚合单体。
[0159]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，所述方法还包含以下步骤：
[0160]
f.使淬灭溶液以第五流速基本上流动通过或基本上流动横跨复合材料，其中淬灭溶液包含反应性化合物以将任何残留的侧挂反应性官能团转化为非反应性基团；以及
[0161]
g.任选地，使第三洗涤溶液以第六流速基本上流动通过或基本上流动横跨复合材料，以去除任何残留的反应性化合物。
[0162]
在一些实施方案中，本发明涉及用于将配体偶联至官能化的复合材料的方法，所述方法包含以下步骤：
[0163]
a.提供官能化的复合材料，所述官能化的复合材料包含：
[0164]
i.支持构件，所述支持构件包含延伸通过所述支持构件的多个孔；以及
[0165]
ii.大孔交联凝胶，其中所述大孔交联凝胶包含由一种或多种可聚合单体与一种或多种交联剂的反应形成的聚合物；所述大孔交联凝胶包含多个侧挂反应性官能团；所述大孔交联凝胶位于所述支持构件的所述孔中；并且所述大孔交联凝胶的所述大孔小于所述支持构件的所述孔；
[0166]
b.使第一溶液以第一流速基本上流动通过或基本上流动横跨所述官能化的复合材料，其中所述第一溶液包含多个第一配体，使得在所述反应性官能团与所述第一配体之间形成多个共价键；
[0167]
c.任选地，使第一洗涤溶液以第二流速基本上流动通过或基本上流动横跨所述复合材料，以去除任何过量的第一配体；
[0168]
d.使淬灭溶液以第三流速基本上流动通过或基本上流动横跨所述复合材料，其中所述淬灭溶液包含反应性化合物，以将任何残留的侧挂反应性官能团转化为非反应性基团；以及
[0169]
e.任选地，使第二洗涤溶液以第四流速基本上流动通过或基本上流动横跨所述复合材料，以去除任何残留的反应性化合物；
[0170]
其中所述官能化的复合材料被布置成共同延伸的片材的共面堆叠、管状配置或螺旋卷绕配置。
[0171]
在一些实施方案中，本发明涉及用于将配体偶联至官能化的复合材料的方法，所述方法包含以下步骤：
[0172]
a.提供官能化的复合材料，所述官能化的复合材料包含：
[0173]
i.支持构件，所述支持构件包含延伸通过所述支持构件的多个孔；以及
[0174]
ii.大孔交联凝胶，其中所述大孔交联凝胶包含由一种或多种可聚合单体与一种或多种交联剂的反应形成的聚合物；所述大孔交联凝胶包含多个侧挂反应性官能团；所述大孔交联凝胶位于所述支持构件的所述孔中；并且所述大孔交联凝胶的所述大孔小于所述支持构件的所述孔；
[0175]
b.使第一溶液以第一流速基本上流动通过或基本上流动横跨所述官能化的复合材料，其中所述第一溶液包含多个第一配体，使得在所述反应性官能团与所述第一配体之间形成多个共价键；
[0176]
c.任选地，使第一洗涤溶液以第二流速基本上流动通过或基本上流动横跨所述复合材料，以去除任何过量的第一配体；
[0177]
d.使第二溶液以第三流速基本上流动通过或基本上流动横跨所述官能化的复合材料，其中所述第二溶液包含多个包含至少三个反应性基团的第二配体和任选存在的包含至少两个侧挂反应性官能团的可聚合单体，从而在所述反应性官能团与所述第二配体之间形成多个共价键，其中所述第二配体是交联剂；
[0178]
e.任选地，使第二洗涤溶液以第四流速基本上流动通过或基本上流动横跨所述复合材料，以去除任何过量的第二配体和任选存在的任何过量的可聚合单体；
[0179]
f.使淬灭溶液以第五流速基本上流动通过或基本上流动横跨所述复合材料，其中所述淬灭溶液包含反应性化合物以将任何残留的侧挂反应性官能团转化为非反应性基团；以及
[0180]
g.任选地，使第三洗涤溶液以第六流速基本上流动通过或基本上流动横跨所述复
合材料，以去除任何残留的反应性化合物；
[0181]
其中所述官能化的复合材料被布置成共同延伸的片材的共面堆叠、管状配置或螺旋卷绕配置。
[0182]
在一些实施方案中，官能化的复合材料是润湿的膜。
[0183]
在一些实施方案中，将润湿的膜放置于附接至色谱系统的保持器(holder)中。在一些实施方案中，各种溶液和流体(例如，第一溶液、第一洗涤溶液、第二溶液、淬灭溶液、第二洗涤溶液和第三洗涤溶液)被泵送通过膜保持器。
[0184]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中官能化的复合材料被布置成共同延伸的片材的共面堆叠、管状配置或螺旋卷绕配置。
[0185]
膜堆叠
[0186]
在一些实施方案中，复合材料被布置成基本上共同延伸的片材的基本上共面的堆叠。在一些实施方案中，复合材料具有2至300个单独的支持构件。在一些实施方案中，复合材料具有5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、35、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295或300个单独的支持构件。在一些实施方案中，复合材料具有5至200个单独的支持构件。在一些实施方案中，复合材料具有5至100个单独的支持构件。
[0187]
在一些实施方案中，当复合材料被布置成基本上共同延伸的片材的基本上共面的堆叠时，一个或多个单独的支持构件被一个或多个夹层隔开。在一些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中复合材料层和夹层是复合材料和夹层的交替层(即，(复合材料-夹层)
x
或(夹层-复合材料)
x
)。在一些实施方案中，复合材料被1至250个单独的夹层分层。在一些实施方案中，复合材料具有1至100个单独的夹层。在一些实施方案中，复合材料具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和100个单独的夹层。在一些实施方案中，复合材料具有1至50个单独的夹层。在一些实施方案中，复合材料具有1至25个单独的夹层。
[0188]
在一些实施方案中，夹层是流量分配层。在一些实施方案中，夹层延伸超出复合材料层的边缘。在一些实施方案中，夹层允许流动通过膜，同时还提供跨堆叠的较低压降，因为溶液也可以围绕膜流动。
[0189]
在一些实施方案中，当复合材料被布置成基本上共同延伸的片材的基本上共面的堆叠时，一个或多个单独的支持构件和任选存在的一个或多个夹层被一个或多个流量分配层隔开。在一些实施方案中，一个或多个流量分配层允许在堆叠内均匀偶联。在一些实施方案中，与没有流量分配层的偶联相比，一个或多个流量分配层允许配体更均匀地偶联至整个堆叠中的复合材料。在一些实施方案中，复合材料具有1至250个单独的流量分配层。在一些实施方案中，复合材料具有1至100个单独的流量分配层。在一些实施方案中，复合材料具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、
或约0.95oz/yd2的纺粘聚丙烯。在某些实施方案中，夹层是织物单位重量为约0.86oz/yd2的纺粘聚丙烯。
[0203]
在某些实施方案中，夹层的厚度为约50μm至约300μm。在某些实施方案中，夹层的厚度为约50μm、约100μm、约150μm、约200μm、约250μm或约300μm。
[0204]
在某些实施方案中，夹层的体积孔隙率为约50％至约99％。在某些实施方案中，夹层的体积孔隙率为约70％至约95％。在某些实施方案中，夹层的体积孔隙率为约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％。在某些实施方案中，夹层的体积孔隙率为约80％至约90％。在某些实施方案中，夹层是基本上可压缩的。
[0205]
在一些实施方案中，一个或多个夹层与一个或多个流量分配层接触。
[0206]
螺旋卷绕配置的内芯
[0207]
在一些实施方案中，内芯是塑料。在一些实施方案中，内芯是聚丙烯或聚砜。
[0208]
在一些实施方案中，内芯是圆柱体。在某些实施方案中，内芯是在其两端处都被封盖或密封的圆柱体。
[0209]
在某些实施方案中，内芯是圆柱形管。在某些实施方案中，内芯是穿孔圆柱形管。在某些实施方案中，内芯是在其端部之一处被封盖或密封的穿孔圆柱形管。
[0210]
在一些实施方案中，内芯是围绕圆柱体卷缠的筛网。在某些实施方案中，筛网提供流体可以通过其流动的路径。
[0211]
在一些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，复合材料是膜。
[0212]
在一些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中交联凝胶是中性水凝胶、带电水凝胶、聚电解质凝胶、疏水性凝胶、中性凝胶或包含官能团的凝胶。
[0213]
在一些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中大孔交联凝胶包含平均尺寸为10nm至3000nm的大孔。
[0214]
在一些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中支持构件的孔的平均孔径为约0.1μm至约50μm。
[0215]
在一些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中流体流动路径基本上通过复合材料。
[0216]
在一些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中流体流动路径基本上横跨复合材料。
[0217]
制备示例性复合材料的方法
[0218]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中单体混合物中侧挂反应性官能团与接枝端基的比例为约1:10至约2:1，例如，约1:10、约1:9、约1:8、约1:7、约1:6、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、约1:1或约2:1。在一些实施方案中，炔基相当于两个烯基。
[0219]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第一单体以单体混合物的约5重量％至约25重量％的量存在于单体混合物中。在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第一单体以单体混合物的约5重量％至约20重量％的量存在于单体混合物中。
[0220]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第二单体以单体混合物的约0.1重量％至约20重量％的量存在于单体混合物中。
[0221]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第一交联剂以单体
混合物的约1重量％至约20重量％的量存在于单体混合物中。
[0222]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中光引发剂以单体混合物的约0.1重量％至约2重量％的量存在于单体混合物中。
[0223]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中光引发剂是苯偶姻或苯偶姻醚、二苯甲酮、二烷氧基苯乙酮、2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮、二苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)氧化膦、羟烷基苯酮、1-羟基-环己基-苯基-酮、4-(2-羟基乙氧基)苯基-(2-羟基-2-丙基)酮、1-[4-(2-羟基乙氧基)-苯基]-2-羟基-2-甲基-1-丙烷-1-酮、2-羟基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-2-甲基-1-丙酮、α-羟甲基苯偶姻磺酸酯、2-羟基-2-甲基苯丙酮、酰基次膦酸锂、或2-甲基-1-[4-(甲硫基)苯基]-2-(4-吗啉基)-1-丙酮、4,4
’‑
偶氮二(4-氰基戊酸)(acva)、或其混合物。
[0224]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第一溶剂包含n,n
’‑
二甲基乙酰胺(dmac)、(
±
)-1,3-丁二醇(budiol)、二(丙二醇)甲醚乙酸酯(dpma)、水、二(丙二醇)二甲醚(dpm)、二(丙二醇)丙醚(dpgpe)、二(丙二醇)甲醚(dpgme)、三(丙二醇)丁醚(tpgbe)、3-甲基-1,3-丁二醇、3,3-二甲基-1,2-丁二醇、3-甲氧基-1-丁醇、二甲亚砜(dmso)、乙二醇、二(乙二醇)、三(乙二醇)、四(乙二醇)、己二醇、十二烷基硫酸钠、或n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、或其混合物。
[0225]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中n,n
’‑
二甲基乙酰胺(dmac)以单体混合物的约0重量％至约70重量％的量存在于单体混合物中。在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中n,n
’‑
二甲基乙酰胺(dmac)以单体混合物的约0重量％至约50重量％的量存在于单体混合物中。在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中n,n
’‑
二甲基乙酰胺(dmac)以总溶剂的约0重量％至约70重量％的量存在于单体混合物中。在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中n,n
’‑
二甲基乙酰胺(dmac)以总溶剂的约0重量％至约50重量％的量存在于单体混合物中。
[0226]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中(
±
)-1,3-丁二醇(budiol)以单体混合物的约0重量％至约50重量％的量存在于单体混合物中。在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中(
±
)-1,3-丁二醇(budiol)以总溶剂的约0重量％至约50重量％的量存在于单体混合物中。
[0227]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中二(丙二醇)甲醚乙酸酯(dpma)以单体混合物的约0重量％至约60重量％的量存在于单体混合物中。在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中二(丙二醇)甲醚乙酸酯(dpma)以总溶剂的约0重量％至约60重量％的量存在于单体混合物中。
[0228]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中水以单体混合物的约0重量％至约50重量％的量存在于单体混合物中。在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中水以单体混合物的约0重量％至约30重量％的量存在于单体混合物中。在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中水以总溶剂的约0重量％至约30重量％的量存在于单体混合物中。
[0229]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中经覆盖的支持构件在约350nm下被辐照。
[0230]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中时间段为约1分钟、
约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约30分钟、约45分钟、或约1小时。
[0231]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中复合材料包含大孔。
[0232]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中大孔的平均孔径小于孔的平均孔径。
[0233]
孔尺寸测定
[0234]
sem和esem
[0235]
如上所述，在某些实施方案中，交联凝胶是大孔交联凝胶。大孔交联凝胶中大孔的平均直径可以通过多种方法之一来估算。可以采用的一种方法是扫描电子显微镜(sem)。sem是通常用于测定孔尺寸和孔隙率、特别是用于表征膜的确立已久的方法。参考marcel mulder的书籍basic principles of membrane technology(尤其是第iv章)。mulder提供用于表征膜的方法的综述。对于多孔膜，提到的第一种方法是电子显微镜。sem是一种用于表征微滤膜的非常简单且有用的技术。可以从顶层、截面和底层角度获得膜的清晰且简洁的图片。此外，孔隙率和孔尺寸分布可以从像片中估算。
[0236]
环境sem(esem)是一种通过允许样品室中的气体环境来允许对湿润样品进行无损成像的技术。环境二次检测器(environmental secondary detector)(esd)需要气体背景以运转，并且在约3托至约20托下操作。这些压力制约因素限制了改变样品室中湿度的能力。例如，在10托下，在特定温度下的相对湿度如下：
[0237]
10托下的相对湿度(％)t(℃)约80约16约70约18约60约20约40约24约20约40约10约50约2约70约1约100
[0238]
这是不同温度下样品室中相对湿度的有用指南。在某些实施方案中，成像期间样品室中的相对湿度为约1％至约99％。在某些实施方案中，成像期间样品室中的相对湿度为约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或约99％。在某些实施方案中，成像期间样品室中的相对湿度为约45％。
[0239]
在某些实施方案中，显微镜具有纳米分辨率和高达约100000
×
的放大率。
[0240]
在某些实施方案中，成像期间样品室中的温度为约1℃至约95℃。在某些实施方案中，成像期间样品室中的温度为约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约7℃、约8℃、约9℃、约10℃、约12℃、约14℃、约16℃、约18℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃、约60℃、约65℃、约70℃、约75℃、约80℃或约85℃。在某些实施方案中，成像期间样品室中的温度为约5℃。
[0241]
在某些实施方案中，成像期间样品室中的压力为约0.5托至约20托。在某些实施方
案中，成像期间样品室中的压力为约4托、约6托、约8托、约10托、约12托、约14托、约16托、约18托或约20托。在某些实施方案中，成像期间样品室中的压力为约3托。
[0242]
在某些实施方案中，从电子束源至样品的工作距离为约6mm至约15mm。在某些实施方案中，从电子束源至样品的工作距离为约6mm、约7mm、约8mm、约9mm、约10mm、约11mm、约12mm、约13mm、约14mm或约15mm。在某些实施方案中，从电子束源至样品的工作距离为约10mm。
[0243]
在某些实施方案中，电压为约1kv至约30kv。在某些实施方案中，电压为约2kv、约4kv、约6kv、约8kv、约10kv、约12kv、约14kv、约16kv、约18kv、约20kv、约22kv、约24kv、约26kv、约28kv或约30kv。在某些实施方案中，电压为约20kv。
[0244]
在某些实施方案中，平均孔径可以通过估算来自复合材料的顶部或底部的图像的代表性样品中的孔径来测量。本领域普通技术人员将认识到并且承认与获得润湿膜的esem图像相关的各种实验变量，并且将能够相应地设计实验。
[0245]
毛细流动测孔法
[0246]
毛细流动测孔法是一种用于测量多孔材料的一个或多个孔尺寸的分析技术。在该分析技术中，润湿液体用于填充测试样品的孔，并且非反应气体的压力用于从孔中置换液体。通过样品的气体压力和流速被准确地测量，并且孔径使用以下公式来确定：从孔中去除液体所需的气体压力通过以下公式而与孔的尺寸相关联：
[0247]
d＝4
×
γ
×
cosθ/p
[0248]
d＝孔径
[0249]
γ＝液体表面张力
[0250]
θ＝液体接触角
[0251]
p＝气体压差。
[0252]
该公式表明，从润湿样品中置换液体所需的压力与孔尺寸负相关。由于该技术涉及液体在压力下从测试样品的孔中的流动，因此它可用于表征“通孔(through pore)”(允许流体从样品的一侧流动至另一侧的互连孔)。其他孔类型(闭孔和盲孔)不可由该方法检测。
[0253]
当气体开始流动通过孔时，毛细流动测孔法检测到该孔的存在。这仅在气体压力高到足以从孔的最狭窄部分中置换液体时才发生。因此，使用该方法计算的孔径是最狭窄部分处的孔的直径，并且每个孔被检测为具有该狭窄直径的单个孔。最大孔径(被称为泡点)通过引发流动通过湿样品所需的最低气体压力来确定，并且平均孔径由平均流动压力来计算。此外，可以使用该技术确定狭窄孔径范围和孔径分布两者。
[0254]
该方法可以在浸入测试流体(例如，水、缓冲液、醇)中的小膜样品(例如，约2.5cm的直径)上进行。所施加的气体压力的范围可以选自约0psi至约500psi。
[0255]
测定孔径的其他方法
[0256]
mulder描述了表征多孔膜的平均孔尺寸的其他方法，包括原子力显微镜法(afm)(第164页)、渗透率计算(第169页)、气体吸附-解吸(第173页)、热测孔法(thermoporometry)(第176页)、渗透测孔法(permporometry)(第179页)和液体置换(第181页)。mulder和其中引用的参考文献特此通过引用并入。
[0257]
复合材料的示例性用途
[0258]
在某些实施方案中，本发明涉及一种方法，其中流体通过上述复合材料中的任何一种的交联凝胶。通过调适用于结合或分级分离的条件，可以获得良好的选择性。
[0259]
在某些实施方案中，本发明涉及一种方法，所述方法还包含以下步骤：
[0260]
f.使包含物质的第一流体以第五流速基本上流动通过或基本上流动横跨复合材料，从而将所述物质的一部分吸附或吸收至所述复合材料上。
[0261]
在某些实施方案中，本发明涉及一种方法，所述方法包含以下步骤：
[0262]
h.使包含物质的第一流体以第七流速基本上流动通过或基本上流动横跨复合材料，从而将所述物质的一部分吸附或吸收至所述复合材料上。
[0263]
在某些实施方案中，第一流体还包含片段化抗体、聚集抗体、宿主细胞蛋白、多核苷酸、内毒素或病毒。在一些实施方案中，第一流体是细胞悬浮液或聚集体悬浮液。
[0264]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第一流体的流体流动路径基本上通过复合材料的大孔。
[0265]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第一流体的流体流动路径基本上垂直于复合材料的大孔。
[0266]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中在第一流体基本上流动通过或基本上流动横跨复合材料之后，基本上全部的物质被吸附或吸收至所述复合材料上。
[0267]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，所述方法还包含以下步骤：
[0268]
g.使第二流体以第六流速与吸附或吸收至复合材料上的物质接触，从而从所述复合材料释放所述物质的一部分。
[0269]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，所述方法还包含以下步骤：
[0270]
i.使第二流体以第八流速与吸附或吸收至复合材料上的物质接触，从而从所述复合材料释放所述物质的一部分。
[0271]
在一些实施方案中，本发明涉及用于将配体偶联至官能化的复合材料的方法，所述方法包含以下步骤：
[0272]
a.提供官能化的复合材料，所述官能化的复合材料包含：
[0273]
i.支持构件，所述支持构件包含延伸通过所述支持构件的多个孔；以及
[0274]
ii.大孔交联凝胶，其中所述大孔交联凝胶包含由一种或多种可聚合单体与一种或多种交联剂的反应形成的聚合物；所述大孔交联凝胶包含多个侧挂反应性官能团；所述大孔交联凝胶位于所述支持构件的所述孔中；并且所述大孔交联凝胶的所述大孔小于所述支持构件的所述孔；
[0275]
b.使第一溶液以第一流速基本上流动通过或基本上流动横跨所述官能化的复合材料，其中所述第一溶液包含多个第一配体，使得在所述反应性官能团与所述第一配体之间形成多个共价键；
[0276]
c.任选地，使第一洗涤溶液以第二流速基本上流动通过或基本上流动横跨所述复合材料，以去除任何过量的第一配体；
[0277]
d.使淬灭溶液以第三流速基本上流动通过或基本上流动横跨所述复合材料，其中
所述淬灭溶液包含反应性化合物以将任何残留的侧挂反应性官能团转化为非反应性基团；
[0278]
e.任选地，使第二洗涤溶液以第四流速基本上流动通过或基本上流动横跨所述复合材料，以去除任何残留的反应性化合物；
[0279]
f.使包含物质的第一流体以第五流速基本上流动通过或基本上流动横跨所述复合材料，从而将所述物质的一部分吸附或吸收至所述复合材料上；以及
[0280]
g.使第二流体以第六流速与吸附或吸收至所述复合材料上的所述物质接触，从而从所述复合材料释放所述物质的一部分；
[0281]
其中所述官能化的复合材料被布置成共同延伸的片材的共面堆叠、管状配置或螺旋卷绕配置。
[0282]
在一些实施方案中，本发明涉及用于将配体偶联至官能化的复合材料的方法，所述方法包含以下步骤：
[0283]
a.提供官能化的复合材料，所述官能化的复合材料包含：
[0284]
i.支持构件，所述支持构件包含延伸通过所述支持构件的多个孔；以及
[0285]
ii.大孔交联凝胶，其中所述大孔交联凝胶包含由一种或多种可聚合单体与一种或多种交联剂的反应形成的聚合物；所述大孔交联凝胶包含多个侧挂反应性官能团；所述大孔交联凝胶位于所述支持构件的所述孔中；并且所述大孔交联凝胶的所述大孔小于所述支持构件的所述孔；
[0286]
b.使第一溶液以第一流速基本上流动通过或基本上流动横跨所述官能化的复合材料，其中所述第一溶液包含多个第一配体，使得在所述反应性官能团与所述第一配体之间形成多个共价键；
[0287]
c.任选地，使第一洗涤溶液以第二流速基本上流动通过或基本上流动横跨所述复合材料，以去除任何过量的第一配体；
[0288]
d.使第二溶液以第三流速基本上流动通过或基本上流动横跨所述官能化的复合材料，其中所述第二溶液包含多个包含至少三个反应性基团的第二配体和任选存在的包含至少两个侧挂反应性官能团的可聚合单体，从而在所述反应性官能团与所述第二配体之间形成多个共价键，其中所述第二配体是交联剂；
[0289]
e.任选地，使第二洗涤溶液以第四流速基本上流动通过或基本上流动横跨所述复合材料，以去除任何过量的第二配体和任选存在的任何过量的可聚合单体；
[0290]
f.使淬灭溶液以第五流速基本上流动通过或基本上流动横跨所述复合材料，其中所述淬灭溶液包含反应性化合物以将任何残留的侧挂反应性官能团转化为非反应性基团；以及
[0291]
g.任选地，使第三洗涤溶液以第六流速基本上流动通过或基本上流动横跨所述复合材料，以去除任何残留的反应性化合物；
[0292]
h.使包含物质的第一流体以第七流速基本上流动通过或基本上流动横跨所述复合材料，从而将所述物质的一部分吸附或吸收至所述复合材料上；以及
[0293]
i.使第二流体以第八流速与吸附或吸收至所述复合材料上的所述物质接触，从而从所述复合材料释放所述物质的一部分；
[0294]
其中所述官能化的复合材料被布置成共同延伸的片材的共面堆叠、管状配置或螺旋卷绕配置。
[0295]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第二流体的流体流动路径基本上通过复合材料的大孔。
[0296]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第二流体的流体流动路径基本上垂直于复合材料的大孔。
[0297]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中物质是生物分子、生物离子、病毒或病毒颗粒。
[0298]
在某些实施方案中，本发明涉及从溶液中分离生物分子或生物离子(如蛋白质或免疫球蛋白)的方法。在某些实施方案中，本发明涉及纯化生物分子或生物离子(如蛋白质或免疫球蛋白)的方法。在某些实施方案中，本发明涉及以高选择性纯化蛋白质或单克隆抗体的方法。在某些实施方案中，本发明涉及一种方法，其中生物分子或生物离子保留其三级结构或四级结构，这对于保持生物活性可能是重要的。
[0299]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中物质是选自以下的生物分子或生物离子：白蛋白、溶菌酶、病毒、细胞、人和动物来源的γ-球蛋白、人和动物来源的免疫球蛋白、higg、重组和天然来源的蛋白质、合成和天然来源的多肽、白细胞介素-2及其受体、酶、单克隆抗体、胰蛋白酶及其抑制剂、细胞色素c、肌红蛋白、肌球蛋白、α-糜蛋白酶原、重组人白细胞介素、重组融合蛋白、核酸衍生产物、合成和天然来源的dna、以及合成和天然来源的rna。
[0300]
在一些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中物质是选自以下的生物分子或生物离子：白蛋白、溶菌酶、病毒、细胞、人和动物来源的γ-球蛋白、人和动物来源的免疫球蛋白、higg、免疫球蛋白m、重组和天然来源的蛋白质(例如，重组人生长激素、重组人胰岛素、重组促卵泡激素、重组因子vii(抗血友病因子)、重组人红细胞生成素、重组粒细胞集落刺激因子、重组α-半乳糖苷酶a、重组艾杜糖苷酸酶、重组加硫酶、重组阿法链道酶、重组组织型纤溶酶原激活物、重组人干扰素、重组胰岛素样生长因子1和重组天冬酰胺酶)、合成和天然来源的多肽、白细胞介素-2及其受体、酶、单克隆抗体、胰蛋白酶及其抑制剂、细胞色素c、肌红蛋白、肌球蛋白、α-糜蛋白酶原、重组人白细胞介素、重组融合蛋白、因子viii、因子ix、抗凝血酶iii(antithrobin iii)、α-i-抗胰蛋白酶、核酸衍生产物、合成和天然来源的dna、以及合成和天然来源的rna。
[0301]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中生物分子或生物离子为溶菌酶、higg、肌红蛋白、人血清白蛋白、大豆胰蛋白酶抑制剂、转移酶、烯醇酶、卵白蛋白、核糖核酸酶、卵胰蛋白酶抑制剂、细胞色素c、膜联蛋白v或α-糜蛋白酶原。
[0302]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中物质是选自以下的生物分子或生物离子：人和动物来源的γ-球蛋白、人和动物来源的免疫球蛋白、重组或天然来源的蛋白质包括，合成或天然来源的多肽、单克隆抗体、抗原、细菌免疫球蛋白-结合蛋白、重组融合蛋白、蛋白a、蛋白g、蛋白l和肽h。
[0303]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中物质是选自以下的生物分子或生物离子：多肽、蛋白质、重组蛋白、细菌免疫球蛋白-结合蛋白、重组融合蛋白、蛋白a、蛋白g、蛋白l和肽h。
[0304]
在某些实施方案中，本发明涉及从与其相关的变体、杂质或污染物中回收抗体片段的方法。在某些实施方案中，生物分子或生物离子分离或纯化可以基本上发生在交联凝
胶中。在某些实施方案中，当交联凝胶具有大孔时，生物分子或生物离子分离或纯化可以基本上发生在交联凝胶的大孔中。
[0305]
在某些实施方案中，本发明涉及物质的可逆吸附的方法。在某些实施方案中，吸附的物质可以通过改变流动通过凝胶的液体来释放。在某些实施方案中，物质的吸收和释放可以通过交联凝胶的组成的变化来控制。
[0306]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第一流体是澄清的细胞培养上清液。
[0307]
在某些实施方案中，本发明涉及一种方法，其中物质可以从缓冲溶液施加至复合材料。在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第一流体是缓冲液。在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第一流体中缓冲液的浓度为约5mm、约10mm、约15mm、约20mm、约25mm、约30mm、约35mm、约40mm、约50mm、约60mm、约70mm、约75mm、约80mm、约85mm、约90mm、约95mm、约0.1m、约0.11m、约0.12m、约0.13m、约0.14m、约0.15m、约0.16m、约0.17m、约0.18m、约0.19m或约0.2m。
[0308]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第一流体的ph为约5、约5.5、约6、约6.5、约7、约7.5、约8、约8.5或约9。
[0309]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第一流体包含磷酸钠。
[0310]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第一流体包含盐。在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第一流体中盐的浓度为约50mm、约60mm、约70mm、约75mm、约80mm、约85mm、约90mm、约95mm、约0.1m、约0.11m、约0.12m、约0.13m、约0.14m、约0.15m、约0.16m、约0.17m、约0.18m、约0.19m、约0.2m、约0.25m或约0.3m。在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中盐是氯化钠。
[0311]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中物质是结合配偶体。在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中复合材料包含偶联配体，并且物质是配体的结合配偶体。
[0312]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第一流体中物质的浓度为约0.01mg/ml至约1000mg/ml。在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第一流体中物质的浓度为约0.2mg/ml至约10mg/ml。在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第一流体中物质的浓度为约0.2mg/ml、约0.3mg/ml、约0.4mg/ml、约0.5mg/ml、约0.6mg/ml、约0.7mg/ml、约0.8mg/ml、约0.9mg/l、约1mg/ml、约1.2mg/ml、约1.4mg/ml、约1.6mg/ml、约1.8mg/ml、约2mg/ml、约3mg/ml、约4mg/ml、约5mg/ml、约6mg/ml、约7mg/ml、约8mg/ml、约mg/ml或约10mg/ml。
[0313]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第一流速、第二流速、第三流速、第四流速、第五流速、第六流速、第七流速和第八流速各自独立地选自约1膜体积(mv)/min至约75mv/min。在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第一流速、第二流速、第三流速、第四流速、第五流速、第六流速、第七流速和第八流速各自独立地选自约3膜体积(mv)/min至约70mv/min。在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第一流速、第二流速、第三流速、第四流速、第五流速、第六流速、第七流速和第八流速各自独立地选自约5mv/min至约50mv/min。在某些实施方案中，本发明涉及前述
方法中的任何一种，其中第一流速、第二流速、第三流速、第四流速、第五流速、第六流速、第七流速和第八流速各自独立地选自约5mv/min、约6mv/min、约7mv/min、约8mv/min、约9mv/min、约10mv/min、约11mv/min、约12mv/min、约13mv/min、约14mv/min、约15mv/min、约16mv/min、约17mv/min、约18mv/min、约19mv/min、约20mv/min、约20mv/min、约21mv/min、约22mv/min、约23mv/min、约24mv/min、约25mv/min、约26mv/min、约27mv/min、约28mv/min、约29mv/min、约30mv/min、约30mv/min、约31mv/min、约32mv/min、约33mv/min、约34mv/min、约35mv/min、约36mv/min、约37mv/min、约38mv/min、约39mv/min、约40mv/min、约40mv/min、约41mv/min、约42mv/min、约43mv/min、约44mv/min、约45mv/min、约46mv/min、约47mv/min、约48mv/min、约49mv/min和约50mv/min。在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第一流速、第二流速、第三流速、第四流速、第五流速、第六流速、第七流速和第八流速各自独立地选自约10mv/min至约20mv/min。
[0314]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第一流速、第二流速、第三流速、第四流速、第五流速、第六流速、第七流速和第八流速各自独立地选自约0.5ml/min至约50l/min。在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第一流速、第二流速、第三流速、第四流速、第五流速、第六流速、第七流速和第八流速各自独立地选自约0.5ml/min至约25l/min。在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第一流速、第二流速、第三流速、第四流速、第五流速、第六流速、第七流速和第八流速各自独立地选自约0.5ml/min至约10l/min。在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第一流速、第二流速、第三流速、第四流速、第五流速、第六流速、第七流速和第八流速各自独立地选自约0.5ml/min至约1l/min。在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第一流速、第二流速、第三流速、第四流速、第五流速、第六流速、第七流速和第八流速各自独立地选自约0.5ml/min至约0.5l/min。在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第一流速、第二流速、第三流速、第四流速、第五流速、第六流速、第七流速和第八流速各自独立地选自约0.5ml/min至约100ml/min。在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第一流速、第二流速、第三流速、第四流速、第五流速、第六流速、第七流速和第八流速各自独立地选自约0.5ml/min至约10ml/min。在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第一流速、第二流速、第三流速、第四流速、第五流速、第六流速、第七流速和第八流速各自独立地选自约0.5ml/min至约2ml/min。在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第一流速、第二流速、第三流速、第四流速、第五流速、第六流速、第七流速和第八流速各自独立地选自约0.5ml/min、约0.6ml/min、约0.7ml/min、约0.8ml/min、约0.9ml/min、约1ml/min、约1.1ml/min、约1.2ml/min、约1.3ml/min、约1.4ml/min、约1.5ml/min、约1.6ml/min、约1.7ml/min和约1.8ml/min。
[0315]
在某些实施方案中，本发明涉及一种方法，其中物质可以使用不同浓度和ph的水性盐溶液来洗脱。在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第二流体是缓冲液。在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第二流体包含甘氨酸-hcl或柠檬酸钠。在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第二流体包含浓度为约5mm至约2m的甘氨酸-hcl或柠檬酸钠。在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第二流体包含约5mm、约10mm、约20mm、约30mm、约40mm、约50mm、约
60mm、约70mm、约80mm、约90mm、约100mm、约125mm、约150mm、约200mm、约300mm、或约400mm的甘氨酸-hcl或柠檬酸钠。
[0316]
在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第二流体的ph为约2至约8。在某些实施方案中，本发明涉及前述方法中的任何一种，其中第二流体的ph为约2、约2.2、约2.4、约2.6、约2.8、约3、约3.2、约3.4、约3.6、约3.8、约4、约4.2、约4.4、约4.6、约4.8、约5、约5.2、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4、约6.5、约6.6、约6.7、约6.8、约6.9、约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9和约8.0。
[0317]
在某些实施方案中，本发明涉及表现出高结合容量的方法。在一些实施方案中，与使用分批或死端缀合方法相比，当使用流通缀合方法时，复合材料的结合容量更高。在某些实施方案中，本发明涉及在10％贯流(breakthrough)下表现出约1mg/ml
膜
、约2mg/ml
膜
、约3mg/ml
膜
、约4mg/ml
膜
、约5mg/ml
膜
、约6mg/ml
膜
、约7mg/ml
膜
、约8mg/ml
膜
、约9mg/ml
膜
、约10mg/ml
膜
、约12mg/ml
膜
、约14mg/ml
膜
、约16mg/ml
膜
、约18mg/ml
膜
、约20mg/ml
膜
、约30mg/ml
膜
、约40mg/ml
膜
、约50mg/ml
膜
、约60mg/ml
膜
、约70mg/ml
膜
、约80mg/ml
膜
、约90mg/ml
膜
、约100mg/ml
膜
、约110mg/ml
膜
、约120mg/ml
膜
、约130mg/ml
膜
、约140mg/ml
膜
、约150mg/ml
膜
、约160mg/ml
膜
、约170mg/ml
膜
、约180mg/ml
膜
、约190mg/ml
膜
、约200mg/ml
膜
、约210mg/ml
膜
、约220mg/ml
膜
、约230mg/ml
膜
、约240mg/ml
膜
、约250mg/ml
膜
、约260mg/ml
膜
、约270mg/ml
膜
、约280mg/ml
膜
、约290mg/ml
膜
、约300mg/ml
膜
、约320mg/ml
膜
、约340mg/ml
膜
mg/ml
膜
、约360mg/ml
膜
、约380mg/ml
膜
或约400mg/ml
膜
的结合容量的方法。
[0318]
实施例
[0319]
以示例方式提供以下实施例。然而，将理解的是，每个实施例中给出的具体细节已经被选择用于说明目的，而不应当被解释为限制本公开的范围。通常，除非指出，否则实验在类似条件下进行。
[0320]
实施例1-通用材料和方法
[0321]
蛋白质
[0322]
重组蛋白a-cys(rprotein a-cys)获自biomedal s.l(seville,spain)。多克隆免疫γ-球蛋白igg获自equitech-bio inc.(kerrville,tx,usa)。
[0323]
膜制备
[0324]
方案a
[0325]
将一种或多种交联剂和单体(硫醇官能化的单体除外，其在浇注前10min添加)与光引发剂(irgacure 2959)一起添加至溶剂混合物，并且将混合物搅拌足够长的时间以溶解全部组分。将预先称重的7
”×
8”多孔支持基材片材(非织造聚丙烯网状物)放置在聚乙烯片材上，然后将～15g聚合物溶液倒入基材片材中。随后，用另外的聚乙烯片材覆盖浸渍的基材。用手以圆周运动轻轻按压片材，以去除过量的溶液和任何截留的气泡。聚合过程通过在封闭室中用uv光(～350nm)辐照夹在聚乙烯片材之间的聚合物溶液/基材10min来引发。然后，将所得的膜从聚乙烯片材之间取出，并且经受彻底洗涤循环，所述彻底洗涤循环涉及在搅动下在纯化(ro)水中的20-30分钟浸泡时间段(2-3次)。干净的膜通过在室温下自由地悬挂在空气中～16小时来干燥。
[0326]
方案b
[0327]
膜通过在uv引发的反应中使支持网状物材料内的丙烯酸酯和/或丙烯酰胺单体与交联剂聚合来制备。各种含有蛋白质结合基团的功能性膜(例如，离子交换、疏水性相互作用和亲水性相互作用)可以在单个聚合步骤中通过将适合的官能可聚合基团引入凝胶聚合溶液中来生产。经湿洗涤的膜也可以经受额外的热处理步骤，以调节其性能和性质。
[0328]
例如，含环氧基的膜可以用作反应介质平台，所述反应介质平台可以通过将各种配体(如蛋白a)共价锚定至表面上而转化为生物亲和膜。也可以缀合其他配体，以靶向其他生物分子或实体(如病毒)。
[0329]
复合膜的质量增加、润湿和渗透性
[0330]
测量经干燥的膜的重量，并且用于计算质量增加。膜的润湿还通过将50μl蒸馏水滴分配在膜表面上并且测量该滴被吸收在膜内所需的时间来确定。为了估算膜渗透性，每个膜的通量使用ro水(或乙酸盐缓冲液ph 5)和7.7-cm直径的膜样品、使用100kpa施加压力来测定。
[0331]
为了估算膜渗透性，测定ro水(或132mm乙酸盐缓冲液ph 5)作为流动相通过每个膜的通量。将膜在测试前预先浸泡在测试流体中至少10分钟，用～300ml测试液体冲洗，然后测定在100kpa施加压力下通过7.7cm直径(实际7.3cm可用直径)圆形膜试样的测试液体的量。通量被表示为每时间每表面积的液体的量(kg/m2h)。
[0332]
多孔结构成像
[0333]
为了探测凝胶结构和孔隙率，将环境扫描电子显微镜(esem)用于对湿状态下的膜进行成像。小的试样(～7
×
5mm)通过在蒸馏水中浸泡10-15分钟来润湿，然后使用esem仪器(fei quanta feg 250esem)进行检验。将样品放置在冷却台上以将温度调整至5℃，并且在低压水平(4.5-5.5托)和50-55％的相对湿度下检验图像。
[0334]
为了探测干燥状态下的膜结构，将tescan vega ii lsu扫描电子显微镜(sem)(tescan,pa,usa)用于在电压设置为10-20kv的情况下对经金涂覆的膜进行成像。
[0335]
孔尺寸测量
[0336]
膜孔尺寸(直径)使用由capwin软件(v.6)操作的cfp-1500-ae毛细流动孔隙度仪(porous materials inc.,ithaca,ny)来测量。
[0337]
将膜的小盘(2.5-cm直径)浸泡在润湿液体(porous materials inc.，表面张力＝15.9达因/cm)中10min，然后将其在两个预先润湿的滤纸圆片(whatman 5-70mm)之间轻轻挤压以去除过量的溶液，并且使用千分尺测定润湿膜的厚度。然后，将膜盘放置在2.5-cm不锈钢网状物支持盘上。将负载有测试膜的支持盘放置在指定的保持器中，其中膜面朝上。然后，将金属覆盖物轻轻放置在保持器上，并且测试在0-200psi的压力范围内进行。
[0338]
复合膜上的蛋白a配体密度
[0339]
为了测量经偶联的膜上的蛋白a配体密度，测定偶联反应后剩余的未偶联蛋白质的量，并且从总配体量中减去以得到偶联配体的量，然后将其除以膜体积(ml)以将密度表示成mg配体/每ml膜。
[0340]
为了测定溶液中的蛋白a量，制备一系列0.1m磷酸盐缓冲液(ph 7.2)中的蛋白质溶液，测量每种溶液在280nm处的吸光度，并且构建从中确定斜率的校准曲线。
[0341]
对于所选择的膜配方，切割4cm
×
7cm的试样并且测量其厚度，由其计算体积。如前
所述进行偶联反应，并且分别将20mg负载至每个膜偶联反应。当uv反应完成时，将反应溶液收集在管中，然后将3-5ml的0.1m磷酸盐缓冲液添加至反应袋，并且用于通过振荡20-25min来洗涤膜，然后将所得的溶液添加至收集管。
[0342]
将洗涤循环重复额外的两次，然后测量最终溶液吸光度，并且使用校准曲线斜率计算未偶联蛋白质的量。偶联配体量通过取总反应量与未偶联量之间的差值来确定。
[0343]
结合容量测量
[0344]
生物亲和性igg结合容量
[0345]
将25-mm直径的膜盘放置在25-mm natrix不锈钢(ss)保持器中。使20ml结合缓冲液(20mm磷酸钠，150mm nacl，ph 7.4)通过以达到平衡(～160-200床体积/min)。在结合步骤中，使结合缓冲液中的0.5mg/ml多克隆igg以1ml/min的流速通过，直至流出物的uv吸光度超过进料溶液的10％，并且然后使10-15ml缓冲液以2ml/min的流速通过以去除未结合的蛋白质。在洗脱步骤中，结合的igg通过使10-14ml洗脱缓冲液(0.1m甘氨酸-hcl或0.1m柠檬酸钠，两者均处于ph 3)以2ml/min的流速通过来洗脱。
[0346]
阳离子交换igg结合容量
[0347]
将25-mm膜盘放置在25-mm natrix-ss保持器中，并且使20ml结合缓冲液(132mm乙酸钠，ph 5.0)通过以达到平衡。然后使蛋白质溶液(结合缓冲液中的0.5mg/ml人多克隆igg(equitech-bio inc.))通过，直至流出物的uv吸光度超过进料溶液的10％，并且然后使10-15ml缓冲液通过池(cell)以洗涤未结合的蛋白质。在洗脱步骤中，结合的igg通过使10ml洗脱缓冲液(132mm乙酸钠，1m nacl，ph 5.0；或50mm tris，0.5m nacl，ph 8.5)通过来洗脱。
[0348]
疏水性相互作用模式igg结合容量
[0349]
将25-mm膜盘放置在25-mm natrix-ss保持器中，并且使20ml结合缓冲液(50mm磷酸钠，1m硫酸铵，ph 6.5)通过以达到平衡。然后，使蛋白质溶液(结合缓冲液中的0.5mg/ml人多克隆igg(equitech-bio inc.))通过，直至流出物的uv吸光度超过进料溶液的10％。随后，使15-20ml缓冲液通过池，以洗涤未结合的蛋白质。在洗脱步骤中，结合的igg通过使10ml洗脱缓冲液(50mm磷酸钠，ph 7.0)通过来洗脱。
[0350]
实施例2-示例性批量(bulk)偶联方案
[0351]
将蛋白a配体缀合至点击烯烃膜
[0352]
为了检验经由氢硫醇化(hydrothiolation)点击反应将生物分子(具有硫醇官能团)以化学方式结合至烯烃膜的可行性，将含有半胱氨酸残基的工程化蛋白a配体偶联至一个或多个烯烃膜(具有不同化学式)，并且检测固定化配体的生物活性。
[0353]
将蛋白a配体冻干粉(重组蛋白a-cys)溶解在pbs(20mm磷酸钠，0.15m nacl，ph 7.4)中，以制备50mg/ml的储备溶液。为了制备用于每个膜的偶联溶液，将0.4ml配体储备溶液转移至小自封塑料袋(5
×
8cm)中，向所述自封塑料袋中添加1.6ml的2m磷酸盐缓冲液(ph 7.2)，然后添加50μl的dmac中的引发剂(4,4
’‑
偶氮二(4-氰基戊酸)，acva)(150mg/ml)。将反应溶液充分混合。最终反应溶液的体积为～2.0ml，并且含有约20mg配体和约7.5mg引发剂。
[0354]
可替代地，将acva以5mg/ml的浓度溶解在反应缓冲液(2m磷酸盐，ph 7.2)中，以避免使用dmac。对于低盐实验，将引发剂以7.5mg/ml的浓度溶解在0.5m磷酸盐中。
[0355]
将4
×
7-cm膜试样(在水中预先润湿)添加至负载有偶联反应物的袋。将袋振荡一
分钟，然后用uv光(～365nm)辐照10分钟。在辐照完成后，倾析偶联溶液，然后添加15-20ml洗涤缓冲溶液(0.1m磷酸盐，ph 7.2)，并且将膜放置在振荡器上10-15分钟。洗涤循环重复三次，其后将膜：(i)转移至8ml海藻糖溶液(10重量％)中，振荡10-15分钟，并且在烘箱(50℃)中干燥20-30min；或者(ii)储存在0.1m磷酸盐缓冲液中。
[0356]
对于在添加剂存在下的偶联，将acva溶解在0.5m磷酸钾(ph 7.2)中，以制备浓度为7.5mg/ml的溶液。将蛋白a配体溶解在20mm磷酸钠缓冲液(ph 7.2)中，以制备50mg/ml储备溶液。在三个小袋(5
×
8cm)中的每个中，将0.25ml配体储备溶液与0.25ml引发剂溶液混合，并且添加50μl添加剂(将半胱胺-hcl添加至反应b袋，将1-巯基乙醇添加至反应c袋)。
[0357]
在充分混合反应溶液后，将25-mm直径的膜盘放置在每个袋中，并且将反应袋充分振荡，然后用uv光辐照10分钟。倾析反应溶液，然后使用0.1m磷酸钠缓冲液(ph 7.2)将膜试样洗涤三次并且振荡10-15分钟。如上所述，将复合膜试样储存在缓冲液(0.1m磷酸钠，ph 7.2)中，并且测试对igg蛋白的生物亲和性。
[0358]
实施例3-流通配体缀合效果
[0359]
将含有侧挂反应性官能团的润湿膜的样品盘放置在不锈钢保持器中，并且附接至akta色谱系统。将亲和配体溶液以限定的流速泵送通过膜保持器一规定的持续时间。随后，将洗涤溶液泵送通过保持器，随后泵送含有反应性化合物的淬灭溶液，所述反应性化合物将残留的膜侧挂基团转化为非反应性基团。最后，将洗涤溶液泵送通过保持器。停止泵，从akta移除保持器，并且拆卸保持器以取出缀合的膜。缀合的膜(蛋白a亲和配体)的人igg动态结合容量在10膜体积/分钟的流速下测量，并且与在分批非流通方法中缀合的膜进行比较(参见图3)。当使用流通缀合时，观察到膜动态结合容量始终较高。
[0360]
实施例4-经由流动通过没有周期性分流板的膜堆叠的蛋白a偶联
[0361]
将含有多孔玻璃料的头部(header)附接至内径为44mm的玻璃色谱柱(l实验室柱vl 44
×
250，目录号：96440250)的底部。然后，将直径为30mm且厚度为大约350微米的圆形膜(体积0.25ml)放置在柱内部的玻璃料上，使得其距柱壁为相等距离。该膜具有含有环氧基的表面。然后，将直径为44mm的聚丙烯筛网(1:2斜纹组织，500微米网孔)的圆形区段放置在柱中，并且降低以使得其平放在膜上方且接触柱的内壁。然后，将另一个30mm直径的膜放置在柱中，并且降低以使得其平放在筛网上方并且距柱壁为相等距离。重复在膜上方安放筛网且然后在筛网上方安放膜的过程，直至柱含有分层放置在99个筛网之间的100个膜(总体积25ml)。然后，将头部添加至柱的顶部，并且降低直至膜层和筛网层被压缩至9.5cm的高度。
[0362]
接着，将管添加至柱的底部处的入口，并且还将管添加至柱的顶部处的出口。入口管连通蠕动泵，从而使溶液能够受控流动通过柱。
[0363]
用ph为7.4的由20mm磷酸钠与150mm氯化钠组成的pbs缓冲液置换柱和管中的空气。将入口管放置入含有400ml pbs缓冲液的玻璃瓶中，并且将出口管引导至废料。然后启动泵，并且使200ml的pbs缓冲液以50ml/min的速率流动通过柱4min。停止泵，并且倒置柱。然后，交换入口管和出口管与柱的连接，使得入口再次位于柱的底部且出口位于柱的顶部。启动泵，并且使额外的200ml的pbs缓冲液以50ml/min的速率流动通过柱4min。
[0364]
停止泵，并且将入口管移动至含有500ml ph为9.0的由1.35m磷酸钾组成的偶联缓冲液的玻璃瓶中。出口管保持被引导至废料。启动泵，并且使200ml偶联缓冲液以50ml/min
的速率流动通过柱4min。停止泵，并且将出口管放置在与入口管相同的玻璃瓶中，其含有剩余的300ml偶联缓冲液。在入口管和出口管在同一瓶中的这种配置中，溶液可以多次再循环通过柱。使溶液再循环通过柱允许延长的反应时间，而不增加所需溶液的体积。
[0365]
将82.4ml在水中浓度为25.8g/l的pra配体储备溶液添加至含有剩余的300ml偶联缓冲液的玻璃瓶。启动泵，并且然后使pra溶液以50ml/min的流速再循环通过柱4小时。再循环通过柱的总pra溶液体积被计算为422.4ml，其由玻璃瓶中剩余的300ml偶联缓冲液、柱/管中剩余的40ml偶联缓冲液和添加的82.4ml pra储备溶液组成。考虑到将含有2.12g pra配体的82.4ml pra配体储备溶液稀释至422.4ml的体积，在系统中再循环的pra溶液被计算为具有5g/l的浓度。膜上的配体负载通过将2.12g pra配体的总质量除以总膜体积25ml来计算，以得到85g/l的配体负载。
[0366]
在4小时后，停止泵，将出口管引导至废料，并且将出口管引导至废料。将入口管放置入含有200ml pbs缓冲液的玻璃瓶中。启动泵，并且使pbs缓冲液以50ml/min的流速流动通过柱4min。
[0367]
然后停止泵，并且将入口管放置入含有800ml 1m乙醇胺的玻璃瓶中。出口管保持被引导至废料。启动泵，并且使200ml 1m乙醇胺以50ml/min的流速流动通过柱至废料4min。停止泵，并且将出口管引导至含有剩余的600ml 1m乙醇胺溶液的玻璃瓶中。然后启动泵，并且将剩余的600ml 1m乙醇胺溶液以50ml/min的流速再循环通过柱3小时。
[0368]
停止泵，并且将出口管引导至废料。将入口管放置入含有200ml pbs缓冲液的玻璃瓶中。启动泵，并且使pbs缓冲液以50ml/min的流速流动通过柱4min。
[0369]
停止泵，并且移除顶部柱头部。将膜取出，并且储存在pbs缓冲液中。测定堆叠内不同位置处的几个膜的通量和igg动态结合容量。位置#1最靠近柱入口，而位置#100最靠近柱出口。发现随着位置变化，膜通量没有显著偏差(表1)。发现位置60和位置80处的膜具有低得多的igg动态结合容量，从而表明柱中的流动分布不均匀。
[0370]
表1.基于膜在堆叠中的位置的膜通量和igg动态结合容量
[0371][0372]
实施例5-经由流动通过具有周期性分流板的膜堆叠的蛋白a偶联
[0373]
将含有多孔玻璃料的头部附接至内径为44mm的玻璃色谱柱(l实验室柱vl 44
×
250，目录号：96440250)的底部。然后，将由厚度为大约0.025英寸且直径为44mm的圆形不可渗透塑料片材(其在中心具有直径为6mm的孔洞)组成的流量分配层降低，
使得其平放在多孔玻璃料上方。然后，将直径为44mm的聚丙烯筛网(1:2斜纹组织，500微米网孔)的两个圆形区段放置在流量分配层上方。然后，将直径为30mm且厚度为大约350微米的圆形膜(体积0.25ml)放置在筛网上，使得其距柱壁为相等距离。该膜具有含有环氧基的表面。将聚丙烯筛网的另一个圆形区段降低，使得其平放在膜上方。将添加膜层、随后添加聚丙烯筛网层的过程再重复9次，直至柱具有图4中所示的以下组成。
[0374]
将如上所述的在柱中组装层的过程再重复9次，直至柱含有100个膜层(总体积25ml)、120个筛网层和10个流量分配层。然后，将额外的流量分配层添加至堆叠，并且将具有多孔玻璃料的头部添加至柱的顶部。降低头部，直至膜、筛网和流量分配层被压缩至10.5cm的高度。
[0375]
接着，将管添加至柱的底部处的入口，并且还将管添加至柱的顶部处的出口。入口管连通蠕动泵，从而使溶液能够受控流动通过柱。
[0376]
用ph为7.4的由20mm磷酸钠与150mm氯化钠组成的pbs缓冲液置换柱和管中的空气。将入口管放置入含有400ml pbs缓冲液的玻璃瓶中，并且将出口管引导至废料。然后启动泵，并且使200ml pbs缓冲液以50ml/min的速率流动通过柱4min。停止泵，并且倒置柱。然后，交换入口管和出口管与柱的连接，使得入口再次位于柱的底部且出口位于柱的顶部。启动泵，并且使额外的200ml pbs缓冲液以50ml/min的速率流动通过柱4min。
[0377]
停止泵，并且将入口管移动至含有500ml ph为9.0的由1.35m磷酸钾组成的偶联缓冲液的玻璃瓶中。出口管保持被引导至废料。启动泵，并且使200ml偶联缓冲液以50ml/min的速率流动通过柱4min。停止泵，并且将出口管放置在与入口管相同的玻璃瓶中，其含有剩余的300ml偶联缓冲液。在入口管和出口管在同一瓶中的这种配置中，溶液可以多次再循环通过柱。使溶液再循环通过柱允许延长的反应时间，而不增加所需溶液的体积。
[0378]
将82.4ml在水中浓度为25.8g/l的pra配体储备溶液添加至含有剩余的300ml偶联缓冲液的玻璃瓶。启动泵，并且然后使pra溶液以50ml/min的流速再循环通过柱4小时。再循环通过柱的总pra溶液体积被计算为422.4ml，其由玻璃瓶中剩余的300ml偶联缓冲液、柱/管中剩余的40ml偶联缓冲液和添加的82.4ml pra储备溶液组成。考虑到将含有2.12g pra配体的82.4ml pra配体储备溶液稀释至422.4ml的体积，在系统中再循环的pra溶液被计算为具有5g/l的浓度。膜上的配体负载通过将2.12g pra配体的总质量除以总膜体积25ml来计算，以得到85g/l的配体负载。
[0379]
在4小时后，停止泵，并且将出口管引导至废料。将入口管放置入含有200ml pbs缓冲液的玻璃瓶中。启动泵，并且使pbs缓冲液以50ml/min的流速流动通过柱4min。
[0380]
然后停止泵，并且将入口管放置入含有800ml 1m乙醇胺的玻璃瓶中。出口管保持被引导至废料。启动泵，并且使200ml 1m乙醇胺以50ml/min的流速流动通过柱至废料4min。停止泵，并且将出口管引导至含有剩余的600ml 1m乙醇胺溶液的玻璃瓶中。然后启动泵，并且将剩余的600ml 1m乙醇胺溶液以50ml/min的流速再循环通过柱3小时。
[0381]
停止泵，并且将出口管引导至废料。将入口管放置入含有200ml pbs缓冲液的玻璃瓶中。启动泵，并且使pbs缓冲液以50ml/min的流速流动通过柱4min。
[0382]
停止泵，并且移除顶部柱头部。将膜取出，并且储存在pbs缓冲液中。测定堆叠内不同位置处的几个膜的通量和igg动态结合容量。位置#1最靠近柱入口，而位置#100最靠近柱出口。发现随着位置变化，膜通量没有显著偏差(表2)。还发现igg动态结合容量没有显著偏
差，从而表明流动分布在整个柱中相对均匀。流量分配层的添加提供了堆叠中全部环氧化物膜与pra配体的均匀偶联(图5a和图5b)。
[0383]
表2.基于膜在堆叠中的位置的膜通量和igg动态结合容量
[0384][0385]
实施例6-经由切向流动通过螺旋卷绕的膜卷的蛋白a偶联
[0386]
将宽度为24.5cm、长度为62.5cm且厚度为0.035cm的矩形膜(总膜体积为53.6ml)与宽度为25.4cm的聚丙烯筛网(1:2斜纹组织，500微米网孔)的塑料矩形区段围绕直径为1.6cm且长度为25.4cm的圆柱形芯卷绕。将膜居中，使得膜的边缘与筛网的边缘之间存在0.45cm。将膜和筛网围绕芯卷缠，其中筛网接触芯。卷起膜和筛网，直至全部膜完全被筛网层覆盖。将筛网层继续围绕卷卷绕，直至卷的直径为32mm。然后，切断筛网层。然后，将卷滑动至内径为32mm的玻璃色谱柱(l实验室柱vl 32
×
250，目录号：96320250)中，使得卷的边缘距柱的两端为2.5cm。然后，将含有多孔玻璃料的头部附接至柱的底部和顶部。
[0387]
接着，将管添加至柱的底部处的入口，并且还将管添加至柱的顶部处的出口。入口管连通蠕动泵，从而使溶液能够受控流动通过柱。
[0388]
用ph为7.4的由20mm磷酸钠与150mm氯化钠组成的pbs缓冲液置换柱和管中的空气。将入口管放置入含有400ml pbs缓冲液的玻璃瓶中，并且将出口管引导至废料。然后启动泵，并且使200ml pbs缓冲液以40ml/min的速率流动通过柱5min。停止泵，并且倒置柱。然后，交换入口管和出口管与柱的连接，使得入口再次位于柱的底部且出口位于柱的顶部。启动泵，并且使额外的200ml pbs缓冲液以40ml/min的速率流动通过柱5min。
[0389]
停止泵，并且将入口管移动至含有1064ml ph为9.0的由1.35m磷酸钾组成的偶联缓冲液的玻璃瓶中。出口管保持被引导至废料。启动泵，并且使300ml偶联缓冲液以40ml/min的速率流动通过柱7.5min。停止泵，并且将出口管放置在与入口管相同的玻璃瓶中，其
含有剩余的764ml偶联缓冲液。在入口管和出口管在同一瓶中的这种配置中，溶液可以多次再循环通过柱。使溶液再循环通过柱允许延长的反应时间，而不增加所需溶液的体积。
[0390]
将205.6ml在水中浓度为25.8g/l的pra配体储备溶液添加至含有剩余的764ml偶联缓冲液的玻璃瓶。启动泵，并且然后使pra溶液以40ml/min的流速再循环通过柱4小时。再循环通过柱的总pra溶液体积被计算为1062.6ml，其由玻璃瓶中剩余的764ml偶联缓冲液、柱/管中剩余的93ml偶联缓冲液和添加的205.6ml pra储备溶液组成。考虑到将含有5.3g pra配体的205.6ml pra配体储备溶液稀释至1064ml的体积，在系统中再循环的pra溶液被计算为具有5g/l的浓度。膜上的配体负载通过将5.3g pra配体的总质量除以总膜体积53.6ml来计算，以得到99g/l的配体负载。
[0391]
在4小时后，停止泵，并且将出口管引导至废料。将入口管放置入含有200ml pbs缓冲液的玻璃瓶中。启动泵，并且使pbs缓冲液以40ml/min的流速流动通过柱5min。
[0392]
然后停止泵，并且将入口管放置入含有600ml 1m乙醇胺的玻璃瓶中。出口管保持被引导至废料。启动泵，并且使200ml 1m乙醇胺以20ml/min的流速流动通过柱至废料10min。停止泵，并且将出口管引导至含有剩余的400ml 1m乙醇胺溶液的玻璃瓶中。然后启动泵，并且将剩余的400ml1m乙醇胺溶液以20ml/min的流速再循环通过柱170分钟。
[0393]
停止泵，并且将出口管引导至废料。将入口管放置入含有400ml pbs缓冲液的玻璃瓶中。启动泵，并且使pbs缓冲液以40ml/min的流速流动通过柱10min。
[0394]
停止泵，并且移除顶部和底部柱头部。然后，将膜和筛网的经卷绕的卷从柱中取出。将膜展开，并且与筛网分离。然后，将直径为30mm的膜的圆形区段从矩形膜片材中取出。将膜的五个圆形区段从以下位置中的每个位置中取出(图6)：
[0395]
1.中心：位于矩形膜片材的整体中心。
[0396]
2.芯：位于偶联反应期间最靠近芯的矩形膜片材的边缘的中间。
[0397]
3.壳：位于偶联反应期间最靠近柱侧的矩形膜片材的边缘的中间。
[0398]
4.入口：位于偶联反应期间最靠近柱入口的矩形膜片材的边缘的中间。
[0399]
5.出口：位于偶联反应期间最靠近柱入口的矩形膜片材的边缘的中间。
[0400]
6.将从每个区段取出的五个膜组装成总可及膜体积为1.0ml的五个5层膜色谱装置。如表3中所示，五个色谱装置的压降和igg动态结合容量在10膜体积/分钟或10ml/min的流速下测定。发现1ml装置在全部五个不同位置处全部都具有非常相似的压降和igg动态结合容量。这些结果表明，环氧化物膜与pra配体的切向流偶联可以在其用聚丙烯筛网夹层时在整个膜上均匀地实现。
[0401]
表3.基于膜在螺旋卷绕的矩形片材中的位置的压降和igg动态结合容量
[0402][0403]
通过引用并入
[0404]
本文引用的全部美国专利和美国专利申请出版物均特此通过引用并入。
[0405]
等同物
[0406]
本领域技术人员将认识到或者能够仅使用常规实验确定本文描述的本发明的具体实施方案的许多等同物。此类等同物旨在被以下权利要求所涵盖。