一种以微流控双水相乳液为模板制备多孔海藻酸钙微球的方法

1.本发明涉及多孔海藻酸钙微球制备技术领域，具体涉及一种以微流控双水相乳液为模板制备多孔海藻酸钙微球的方法。


背景技术：

2.多孔微球是一类在球体表面或内部具有一定互相连通或独立封闭孔洞的微球。多孔微球互连相通的内孔与外孔导致它具有非常低的质量密度和巨大的比表面积，同时还具有可调的孔径与良好的流动性的优点，所以多孔微球在组织再生支架、靶向给药、药物筛选、细胞分离、固定化酶、高速层析色谱等领域取得丰富的应用成果。
3.乳液模板法是近年来蓬勃发展起来的一种制备多孔微球的方法。乳液模板法具有方便高效、高可调节性、成本低、条件温和等优点，因此受到广大科研工作者的青睐。乳液是一类由两种互不相容的液体在外力混合后形成的一相以小液滴的形式分散在在另一相中的热力学不稳定体系，以小液滴形式存在的一相称为内相或分散相，对应的另一相则称为外相或连续相。根据分散相与连续相的组成，乳液通常可分为水包油型(o/w)、油包水型(w/o)、水包油包水型(w/o/w)、油包水包油型(o/w/o)等多种类型。乳液模板法制备多孔结构包括两个基本步骤：第一步是制备互不混容的乳液，第二步是乳液连续相的固化，在此过程中分散相的作用类似于模板，它们在连续相固化后而被移除从而获得多孔结构。
4.近年来，常采用微流控技术结合乳液模板法来制备多孔海藻酸钙微球，然而，大多数微流控方法主要利用油水两相来产生油包水的海藻酸滴液进而产生微球，但是由于引入了油相和表面活性剂，会降低微球的生物相容性，另外，以针管滴注的方法产生的微球球形度不好，所以，如何制备生物相容性好，且微球直径和孔径灵活可控的多孔海藻酸钙微球是一个挑战。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种以微流控双水相乳液为模板制备多孔海藻酸钙微球的方法，以解决现有制备方法制备的多孔海藻酸钙微球生物相容性不高以及微球直径和孔径不好控制的问题。
6.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种以微流控双水相乳液为模板制备多孔海藻酸钙微球的方法，包括以下步骤：
7.以聚乙二醇(peg)水溶液为外水相，聚乙二醇/葡聚糖
‑
海藻酸钠(peg/dex
‑
alg)乳液为内水相，通过同轴毛细管装置在其锥尖处产生peg/dex
‑
alg乳液液滴，其中外水相为连续进样，内水相为周期性间歇进样，将peg/dex
‑
alg乳液液滴通入聚乙二醇
‑
氯化钙(peg
‑
cacl2)溶液中，进行离子交联，即制得多孔海藻酸钙微球。
8.本发明的有益效果为：微流控技术是指使用微管道，在微尺度空间对微流体进行操作的技术，通过微流控技术在微通道独立操作可高效生成单分散性良好的微米级微球，
外水相流动产生的剪切力作用和内水相间歇进样的双重作用下，内水相被剪切成peg/dex
‑
alg乳液液滴，将peg/dex
‑
alg乳液液滴通入peg
‑
cacl2溶液中进行离子交联，peg/dex
‑
alg乳液液滴中的peg液滴在发生离子交联产生的挤压力作用下被排出，即生成多孔海藻酸钙微球。
9.本发明采用了两种亲水的无毒无害、绿色环保且互不相容的高分子溶液，即dex溶液和peg溶液，以粘度较高的dex溶液为连续相，粘度较低的peg溶液为分散相，形成聚并速度慢、稳定时间较长的peg/dex双水相乳液，同时，由于乳液模板法制备多孔微球需要进行固化，所以在连续相dex溶液中引入一定浓度的海藻酸钠，海藻酸钠一方面可作为交联剂发生交联反应，固化生成海藻酸钙凝胶，另一方面，海藻酸钠溶解后具备一定的粘性，可以增大乳液粘度从而减缓乳液聚并速度，使双水相乳液更加稳定，更易控制多孔海藻酸钙微球的孔径大小，制备过程通过微流控技术在全水溶液中一步法制备完成，制备方法简单，制备的多孔海藻酸钙微球生物相容性高，在生物与医药及组织工程等领域有广泛的应用前景。
10.在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
11.进一步，外水相通过注射泵进样，进样速度为60
‑
70μl/min。
12.采用上述进一步技术方案的有益效果为：采用注射泵进样，进样连续且操作简便。
13.进一步，内水相通过空气泵周期间歇进样，进样压强为30
‑
110kpa，进样周期为开启空气泵0.1
‑
0.2s，关闭5
‑
6s。
14.采用上述进一步技术方案的有益效果为：通过改变内水相的进样压强，可以控制多孔海藻酸钙微球的直径尺寸。
15.进一步，将peg/dex
‑
alg乳液液滴通入peg
‑
cacl2溶液中，进行离子交联的时间为4
‑
8h。
16.进一步，peg水溶液、peg/dex
‑
alg乳液和peg
‑
cacl2溶液通过以下方法制得：
17.(1)将质量分数均为15
‑
18％的peg溶液和dex溶液等体积充分混合，静置分相后，抽取上相即得peg水溶液，抽取下相为dex水溶液。
18.(2)于步骤(1)所得的peg水溶液中加入cacl2，混匀后，制得peg
‑
cacl2溶液，其中，cacl2质量分数为9
‑
12％；
19.(3)于步骤(1)所得的dex水溶液中加入alg，混匀后，制得dex
‑
alg溶液，其中，alg的质量分数为0.8
‑
1.8％；
20.(4)量取体积比为1：3
‑
1：5的peg水溶液和dex
‑
alg溶液，乳化后得到分散相为peg，连续相为dex
‑
alg的peg/dex
‑
alg乳液。
21.进一步，步骤(1)中peg的分子量为7
‑
9kda，dex分子量为400
‑
600kda。
22.进一步，peg的分子量为8kda，dex分子量为500kda。
23.进一步，步骤(4)所述乳化过程中乳化频率为2000
‑
25000rpm/min，乳化时间为28
‑
32s。
24.采用上述进一步技术方案的有益效果为：通过改变peg/dex
‑
alg乳液成乳频率以及成乳所需的两种溶液的体积比，可以控制多孔海藻酸钙微球的孔径尺寸。
25.本发明还提供采用本发明方法制备得到的多孔海藻酸钙微球。
26.本发明还提供采用本发明方法制备多孔海藻酸钙微球的装置，其特征在于，包括内水相进料毛细管和套设在其外部的外水相进料毛细管，内水相进料毛细管一端是内水相
输入口，另一端为锥形输出口，外水相进料毛细管一端是外水相输入口，另一端连是外水相输出口，锥形输出口设置在外水相进料毛细管内靠近外水相输入口一端；内水相输入口通过软管连接到密闭玻璃瓶中，密闭玻璃瓶通过硬管连接空气泵，外水相输入口通过软管连接到注射器针头，注射器置于注射泵上，外水相输出口连接盛有peg
‑
cacl2溶液的容器。
27.进一步，内水相进料毛细管外径为970
‑
1050μm，内径为750
‑
850μm，锥形输出口内径为350
‑
400μm，外水相进料毛细管内径为1000
‑
1200μm。
28.本发明的有益效果为：用注射器吸取外水相水溶液，注射泵以一定的速度均匀推动注射器，外水相水溶液则通过外水相输入口，进入外水相进料毛细管和内水相进料毛细管之间的间隙中，空气泵产生的压缩的气体通过硬管输入到盛有内水相乳液的玻璃瓶中，继而压缩乳液通过软管输入到內水相输入口，进入内水相进料毛细管内，空气泵间歇输入的气压使得输入的内水相乳液也呈间歇输入状态，在外水相流体的剪切力和内水相间歇输入的气压作用下，内水相乳液在微流控装置中被分散成液滴形态的乳液，液滴滴入peg
‑
cacl2接收液中，离子交联后形成多孔海藻酸钙微球。
29.本发明装置结构简单、制作灵活方便，注射泵流速和空气泵气压易于调节、操作简单，可用于批量生产。
附图说明
30.图1为本发明微流控装置的3d示意图；
31.图2为本发明微流控装置的结构示意图；
32.图3为本发明微流控装置产生液滴状乳液的结构示意图；
33.图4为本发明微流控装置实物图；
34.图5为微流控技术制备多孔海藻酸钙微球的机理图；
35.图6为实施例1制备的多孔海藻酸钙凝胶微球全貌的4倍显微镜图；
36.图6a为实施例1制备的多孔海藻酸钙凝胶微球全貌的10倍显微镜图；
37.图7为实施例2制备的多孔海藻酸钙凝胶微球全貌的4倍显微镜图；
38.图7a为实施例2制备的多孔海藻酸钙凝胶微球全貌的10倍显微镜图；
39.图8为实施例3制备的多孔海藻酸钙凝胶微球全貌的4倍显微镜图；
40.图8a为实施例3制备的多孔海藻酸钙凝胶微球全貌的10倍显微镜图；
41.图9为本实施例1所制备的多孔海藻酸钙微球表面的全貌扫描电镜图；
42.图9a为本实施例1所制备的多孔海藻酸钙微球表面的全貌的扫描电镜图的局部放大图；
43.图10为内水相输入压强与多孔海藻酸钙微球直径的柱状图；
44.图11为实施例4制备的多孔海藻酸钙微球切开后截面的全貌扫描电镜图和局部放大图；
45.图12为实施例5制备的多孔海藻酸钙微球切开后截面的全貌扫描电镜图和局部放大图；
46.图13为实施例6制备的多孔海藻酸钙微球切开后截面的全貌扫描电镜图和局部放大图；
47.图14为实施例7制备的多孔海藻酸钙微球切开后截面的全貌扫描电镜图和局部放
大图；
48.图15为实施例4
‑
5所制备的多孔海藻酸钙微球的孔径大小与乳液成乳振荡频率的相关性分布图；
49.图16为实施例6
‑
7所制备的多孔海藻酸钙微球的孔径大小与乳液成乳溶液体积比的相关性分布图。
具体实施方式
50.以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
51.如图1
‑
5所示，本发明方法制备多孔海藻酸钙微球的装置，包括内水相进料毛细管100和套设在内水相进料毛细管100外部的外水相进料毛细管200，内水相进料毛细管100一端是内水相输入口101，另一端为锥形输出口102，外水相进料毛细管200一端是外水相输入口201，另一端连是外水相输出口202，锥形输出口102设置在外水相进料毛细管200内靠近外水相输入口201一端；内水相输入口101通过软管连接到密闭玻璃瓶中，密闭玻璃瓶通过硬管连接空气泵，外水相输入口201通过软管连接注射器针头，注射器置于注射泵上，外水相输出口202连接盛有peg
‑
cacl2溶液的容器。
52.本发明所用装置采用玻璃毛细管与不锈钢点胶机针头组合的构造，外水相进料毛细管200为长为6cm，外径为1500μm，内径为1000
‑
1200μm的毛细玻璃管，内水相进料毛细管100长为2.5cm，外径为970
‑
1050μm，内径为750
‑
850μm的毛细玻璃管，将内水相进料毛细管的一端经显微拉针仪拉制微处理，得到内径为350
‑
400μm的锥形输出口102，将点胶机针头底部切开两个能够分别穿过外水相进料毛细管和内水相进料毛细管的小孔，点胶机针头倒置在两个进料毛细管的间隙衔接处，按照图1所示的3d示意图组装并采用市售的ab胶密封固定在载玻片上，得到如图4所示的装置,装置的尺寸可根据实际情况做出适当调整。
53.实施例1：
54.一种以微流控双水相乳液为模板制备多孔海藻酸钙微球的方法，包括以下步骤：
55.(1)将等体积的质量分数均为16％的peg溶液和dex溶液在旋转培养器上充分混合，静置小6时分相后，抽取上相即得peg水溶液，抽取下相为dex水溶液，其中，peg分子量为8kda，dex分子量为500kda；
56.(2)于步骤(1)所得的peg水溶液中加入cacl2，混匀后，制得cacl2质量分数为10％的peg
‑
cacl2溶液；
57.(3)于步骤(1)所得的dex水溶液中加入alg，混匀后，制得alg质量分数为1％的dex
‑
alg溶液；
58.(4)量取体积比为1：3的peg水溶液和dex
‑
alg溶液，使用手提式高速分散器以2000rpm/min的振荡频率乳化30s，得到分散相为peg，连续相为dex
‑
alg的peg/dex
‑
alg乳液；
59.(5)用市售的10ml注射器吸取peg水溶液，套上内径为0.8mm的注射器针头，置于注射泵上，将直径为1mm的软管的一端连接注射器针头，另一端连接外水相输入口，再将peg/dex
‑
alg乳液装入空气泵的密闭玻璃瓶中，输出乳液的软管的直径为1mm，玻璃瓶与空气泵
连接的硬管直径为3mm，其中，内水相进料毛细管外径为970μm，内径为750μm，锥形管出口内径为350μm，外水相进料毛细管内径为1000μm；
60.(6)设置注射泵的进样速度为65μl/min，设置空气泵的进样压强为30kpa，间歇式进样周期为空气泵开启0.1s、关闭5.5s，即可在外水相进料毛细管内形成peg/dex
‑
alg乳液液滴，将其通入到peg
‑
cacl2接收液中，离子交联6h，即得多孔海藻酸钙微球。
61.实施例2：
62.一种以微流控双水相乳液为模板制备多孔海藻酸钙微球的方法，包括以下步骤：
63.(1)将等体积的质量分数均为16％的peg溶液和dex溶液在旋转培养器上充分混合，静置小6时分相后，抽取上相即得peg水溶液，抽取下相为dex水溶液，其中，peg分子量为8kda，dex分子量为500kda；
64.(2)于步骤(1)所得的peg水溶液中加入cacl2，混匀后，制得cacl2质量分数为10％的peg
‑
cacl2溶液；
65.(3)于步骤(1)所得的dex水溶液中加入alg，混匀后，制得alg质量分数为1％的dex
‑
alg溶液；
66.(4)量取体积比为1：3的peg水溶液和dex
‑
alg溶液，使用手提式高速分散器以2000rpm/min的振荡频率乳化30s，得到分散相为peg，连续相为dex
‑
alg的peg/dex
‑
alg乳液；
67.(5)用市售的10ml注射器吸取peg水溶液，套上内径为0.8mm的注射器针头，置于注射泵上，将直径为1mm的软管的一端连接注射器针头，另一端连接外水相输入口，再将peg/dex
‑
alg乳液装入空气泵的密闭玻璃瓶中，输出乳液的软管直径为1mm，玻璃瓶与空气泵连接的硬管直径为3mm，其中，内水相进料毛细管外径为970μm，内径为750μm，锥形管出口内径为350μm，外水相进料毛细管内径为1000μm；
68.(6)设置注射泵的进样速度为65μl/min，设置空气泵的进样压强为70kpa，间歇式进样周期为空气泵开启0.1s、关闭5.5s，即可在外水相进料毛细管内形成peg/dex
‑
alg乳液液滴，将其通入到peg
‑
cacl2接收液中，离子交联6h，即得多孔海藻酸钙微球。
69.实施例3：
70.一种以微流控双水相乳液为模板制备多孔海藻酸钙微球的方法，包括以下步骤：
71.(1)将等体积的质量分数均为16％的peg溶液和dex溶液在旋转培养器上充分混合，静置小6时分相后，抽取上相即得peg水溶液，抽取下相为dex水溶液，其中，peg分子量为8kda，dex分子量为500kda；
72.(2)于步骤(1)所得的peg水溶液中加入cacl2，混匀后，制得cacl2质量分数为10％的peg
‑
cacl2溶液；
73.(3)于步骤(1)所得的dex水溶液中加入alg，混匀后，制得alg质量分数为1％的dex
‑
alg溶液；
74.(4)量取体积比为1：3的peg水溶液和dex
‑
alg溶液，使用手提式高速分散器以2000rpm/min的振荡频率乳化30s，得到分散相为peg，连续相为dex
‑
alg的peg/dex
‑
alg乳液；
75.(5)用市售的10ml注射器吸取peg水溶液，套上内径为0.8mm的注射器针头，置于注射泵上，将直径为1mm的软管的一端连接注射器针头，另一端连接外水相输入口，再将peg/
dex
‑
alg乳液装入空气泵的密闭玻璃瓶中，输出乳液的软管直径为1mm，玻璃瓶与空气泵连接的硬管直径为3mm，其中，内水相进料毛细管外径为970μm，内径为750μm，锥形管出口内径为350μm，外水相进料毛细管内径为1000μm；
76.(6)设置注射泵的进样速度为65μl/min，设置空气泵的进样压强为110kpa，间歇式进样周期为开启0.1s、关闭5.5s，即可在外水相进料毛细管内形成peg/dex
‑
alg乳液液滴，将其通入到peg
‑
cacl2接收液中，离子交联6h，即得多孔海藻酸钙微球。
77.实施例4：
78.一种以微流控双水相乳液为模板制备多孔海藻酸钙微球的方法，包括以下步骤：
79.(1)将等体积的质量分数均为15％的peg溶液和dex溶液在旋转培养器上充分混合，静置小6时分相后，抽取上相即得peg水溶液，抽取下相为dex水溶液，其中，peg分子量为7kda，dex分子量为400kda；
80.(2)于步骤(1)所得的peg水溶液中加入cacl2，混匀后，制得cacl2质量分数为9％的peg
‑
cacl2溶液；
81.(3)于步骤(1)所得的dex水溶液中加入alg，混匀后，制得alg质量分数为0.8％的dex
‑
alg溶液；
82.(4)量取体积比为1：4的peg水溶液和dex
‑
alg溶液，使用手提式高速分散器以2000rpm/min的振荡频率乳化28s，得到分散相为peg，连续相为dex
‑
alg的peg/dex
‑
alg乳液；
83.(5)用市售的10ml注射器吸取peg水溶液，套上内径为0.8mm的注射器针头，置于注射泵上，将直径为1mm的软管的一端连接注射器针头，另一端连接外水相输入口，再将peg/dex
‑
alg乳液装入空气泵的密闭玻璃瓶中，输出乳液的软管直径为1mm，玻璃瓶与空气泵连接的硬管直径为3mm，其中，内水相进料毛细管外径为1000μm，内径为800μm，锥形管出口内径为370μm，外水相进料毛细管内径为1100μm；
84.(6)设置注射泵的进样速度为65μl/min，设置空气泵的进样压强为70kpa，间歇式进样周期为空气泵开启0.15s、关闭5s，即可在外水相进料毛细管内形成peg/dex
‑
alg乳液液滴，将其通入到peg
‑
cacl2接收液中，离子交联4h，即得多孔海藻酸钙微球。
85.实施例5：
86.一种以微流控双水相乳液为模板制备多孔海藻酸钙微球的方法，包括以下步骤：
87.(1)将等体积的质量分数均为15％的peg溶液和dex溶液在旋转培养器上充分混合，静置小6时分相后，抽取上相即得peg水溶液，抽取下相为dex水溶液，其中，peg分子量为7kda，dex分子量为400kda；
88.(2)于步骤(1)所得的peg水溶液中加入cacl2，混匀后，制得cacl2质量分数为9％的peg
‑
cacl2溶液；
89.(3)于步骤(1)所得的dex水溶液中加入alg，混匀后，制得alg质量分数为0.8％的dex
‑
alg溶液；
90.(4)量取体积比为1：4的peg水溶液和dex
‑
alg溶液，使用手提式高速分散器以25000rpm/min的振荡频率乳化28s，得到分散相为peg，连续相为dex
‑
alg的peg/dex
‑
alg乳液；
91.(5)用市售的10ml注射器吸取peg水溶液，套上内径为0.8mm的注射器针头，置于注
射泵上，将直径为1mm的软管的一端连接注射器针头，另一端连接外水相输入口，再将peg/dex
‑
alg乳液装入空气泵的密闭玻璃瓶中，输出乳液的软管直径为1mm，玻璃瓶与空气泵连接的硬管直径为3mm，其中，内水相进料毛细管外径为1000μm，内径为800μm，锥形管出口内径为370μm，外水相进料毛细管内径为1100μm；
92.(6)设置注射泵的进样速度为65μl/min，设置空气泵的进样压强为70kpa，间歇式进样周期为空气泵开启0.15s、关闭5s，即可在外水相进料毛细管内形成peg/dex
‑
alg乳液液滴，将其通入到peg
‑
cacl2接收液中，离子交联4h，即得多孔海藻酸钙微球。
93.实施例6：
94.一种以微流控双水相乳液为模板制备多孔海藻酸钙微球的方法，包括以下步骤：
95.(1)将等体积的质量分数均为18％的peg溶液和dex溶液在旋转培养器上充分混合，静置小6时分相后，抽取上相即得peg水溶液，抽取下相为dex水溶液，其中，peg分子量为9kda，dex分子量为600kda；
96.(2)于步骤(1)所得的peg水溶液中加入cacl2，混匀后，制得cacl2质量分数为12％的peg
‑
cacl2溶液；
97.(3)于步骤(1)所得的dex水溶液中加入alg，混匀后，制得alg质量分数为1.8％的dex
‑
alg溶液；
98.(4)量取体积比为1：3的peg水溶液和dex
‑
alg溶液，使用手提式高速分散器以2000rpm/min的振荡频率乳化32s，得到分散相为peg，连续相为dex
‑
alg的peg/dex
‑
alg乳液；
99.(5)用市售的10ml注射器吸取peg水溶液，套上内径为0.8mm的注射器针头，置于注射泵上，将直径为1mm的软管的一端连接注射器针头，另一端连接外水相输入口，再将peg/dex
‑
alg乳液装入空气泵的密闭玻璃瓶中，输出乳液的软管直径为1mm，玻璃瓶与空气泵连接的硬管直径为3mm，其中，内水相进料毛细管外径为1050μm，内径为850μm，锥形管出口内径为750μm，外水相进料毛细管内径为1200μm；
100.(6)设置注射泵的进样速度为70μl/min，设置空气泵的进样压强为70kpa，间歇式进样周期为空气泵开启0.15s、关闭5s，即可在外水相进料毛细管内形成peg/dex
‑
alg乳液液滴，将其通入到peg
‑
cacl2接收液中，离子交联8h，即得多孔海藻酸钙微球。
101.实施例7：
102.一种以微流控双水相乳液为模板制备多孔海藻酸钙微球的方法，包括以下步骤：
103.(1)将等体积的质量分数均为18％的peg溶液和dex溶液在旋转培养器上充分混合，静置小6时分相后，抽取上相即得peg水溶液，抽取下相为dex水溶液，其中，peg分子量为9kda，dex分子量为600kda；
104.(2)于步骤(1)所得的peg水溶液中加入cacl2，混匀后，制得cacl2质量分数为12％的peg
‑
cacl2溶液；
105.(3)于步骤(1)所得的dex水溶液中加入alg，混匀后，制得alg质量分数为1.8％的dex
‑
alg溶液；
106.(4)量取体积比为1：5的peg水溶液和dex
‑
alg溶液，使用手提式高速分散器以2000rpm/min的振荡频率乳化32s，得到分散相为peg，连续相为dex
‑
alg的peg/dex
‑
alg乳液；
107.(5)用市售的10ml注射器吸取peg水溶液，套上内径为0.8mm的注射器针头，置于注射泵上，将直径为1mm的软管的一端连接注射器针头，另一端连接外水相输入口，再将peg/dex
‑
alg乳液装入空气泵的密闭玻璃瓶中，输出乳液的软管直径为1mm，玻璃瓶与空气泵连接的硬管直径为3mm，其中，内水相进料毛细管外径为1050μm，内径为850μm，锥形管出口内径为750μm，外水相进料毛细管内径为1200μm；
108.(6)设置注射泵的进样速度为70μl/min，设置空气泵的进样压强为70kpa，间歇式进样周期为空气泵开启0.15s、关闭5s，即可在外水相进料毛细管内形成peg/dex
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alg乳液液滴，将其通入到peg
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cacl2接收液中，离子交联8h，即得多孔海藻酸钙微球。
109.结果检测：
110.具体检测方法为：将制备得到的多孔海藻酸钙微球在peg
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cacl2接收液中用显微镜进行观察并统计其直径；将制备得到的多孔海藻酸钙用去离子水清洗，直至除去内相peg和多余的dex，然后，将其放入培养皿中用液氮冷冻，再用有孔的保鲜膜封口，最后放入冷冻干燥器中，进行冷冻干燥，然后进行扫描电镜分析，观察其表面形貌，或者将冷冻干燥后的多孔海藻酸钙微球用刀片切开，进行扫描电镜分析，观察其截面形貌和内部结构。具体如下：
111.1、将实施例1
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3所制备的多孔海藻酸钙微球在peg
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cacl2接收液中用4倍显微镜及10倍显微镜观察，并用数码相机拍照，结果见图6
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8、6a
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8a，由图可知，peg
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cacl2溶液中分散有尺寸均一的多孔海藻酸钙微球，单分散性良好。
112.2、将实施例1所制备的多孔海藻酸钙微球清洗、干燥后，进行扫描电镜分析，观察其表面形貌，结果见图9和图9a，由图可知，其表面是具有较小孔径的相对光滑的表面，有典型的海藻酸钙水凝胶形貌。
113.3、分别对实施例1
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3所制备的多孔海藻酸钙微球在peg
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cacl2接收液中用显微镜观察，对其直径进行统计并求平均值，得到多孔海藻酸钙微球的平均直径，根据内水相输入的压强做图，结果见图10，由图可知，内水相输入压强为30kpa时，微球的平均直径为496μm，内水相输入压强为70kpa时，微球的平均直径为693μm，内水相输入压强为110kpa时，微球的平均直径为877μm。
114.4、将实施例4
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5所制备的多孔海藻酸钙微球清洗、干燥后，切开，进行扫描电镜分析，观察其截面，结果见图11
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12，由图可知，多孔海藻酸钙微球内部具有密集的多孔状结构。
115.5、将实施例6
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7所制备的多孔海藻酸钙微球清洗、干燥后，切开，进行扫描电镜分析，观察其截面，结果见图13
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14，由图可知，多孔海藻酸钙微球内部具有密集的多孔状结构。
116.6、将实施例4
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5所制备的多孔海藻酸钙微球清洗、干燥后，将其用刀片切开，然后进行扫描电镜分析，观察其内部结构，然后选取100个孔进行测量与记录，将记录的数据进行分析与统计，即可得到不同成乳频率制备的多孔海藻酸钙凝胶微球的孔径大小的频率分布图，以及不同成乳频率制备的多孔海藻酸钙凝胶微球的平均孔径的柱状图，结果见图15，由图可知，在内水相乳液振荡频率为25000rpm/min时，所制备的多孔海藻酸钙微球的平均孔径为15μm，在内水相乳液振荡频率为2000rpm/min时，所制备的多孔海藻酸钙微球的平均孔径为25μm。
117.7、将实施例6
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7所制备的多孔海藻酸钙微球清洗、干燥后，将其用刀片切开，然后进行扫描电镜分析，观察其内部结构，然后选取100个孔进行测量与记录，将记录的数据进行分析与统计，即可得到不同成乳溶液体积比制备的多孔海藻酸钙凝胶微球的孔径大小的频率分布图，以及不同成乳溶液体积比制备的多孔海藻酸钙凝胶微球的平均孔径的柱状图，结果见图16，由图可知，在成乳体积比为1：3时，所制备的多孔海藻酸钙微球的平均孔径24μm，在成乳体积比为1：5时，所制备的多孔海藻酸钙微球的平均孔径为17μm。
118.本发明方法所制备的多孔海藻酸钙微球，单分散性良好且具有连通性良好的多孔结构，平均孔径大小为20
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40μm，微球平均直径为400
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900μm。
119.以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。