一种表面修饰膜及其应用的制作方法

本技术涉及生物膜的，更具体地说，它涉及一种表面修饰膜及其应用。

背景技术：

1、滤膜是生物领域常用的一种材料，根据不同的功能需要，选择的膜会有所不同。对于膜的使用，常见的作用在于功能物质的分离提取，如蛋白、细胞、胞外分泌膜结构（囊泡等）等的分离和/或提取。其中的胞外分泌膜结构，例如囊泡、外泌体等，其膜上含有大量的跨膜蛋白、浮舰蛋白等重要的信息蛋白；膜结构内含有核酸、细胞程序性死亡相关蛋白等。因此，胞外分泌膜结构内携带有重要的信息。而许多胞外分泌膜结构参与代谢垃圾的运输，同时也在病理生理活动中发挥着重要的作用。

2、对于胞外分泌膜结构的获取方法，包括超速离心法、过滤离心法、免疫磁珠法、peg沉淀法和试剂盒等方法。其中超速离心法是最常用的获取方法，其提取过程比较费时，步骤复杂，获得的目标物数量较少，分离率不高。过滤离心法是利用过滤膜对胞外分泌膜结构进行离心分离，该方法获得的目标物存在纯度不高的问题。免疫磁珠法，获得的目标蛋白的含量是超速离心和过滤法的两倍，但其不能适用于所有胞外分泌膜结构的提取，效率低且价格昂贵。聚乙二醇（peg）沉淀法获得的胞外分泌膜结构，其纯度和回收率低，杂蛋白较多，颗粒大小不均一，产生难以去除的聚合物。目前市售外泌体提取试剂盒法主要基于聚乙二醇沉淀法进行胞外囊泡提取，最常用的试剂盒为exoquick、mircury和teir等。试剂盒法操作简便，但获取的胞外囊泡的杂质较多。综上所述，目前仍没有绝对的方法或试剂盒能满足所有要求，从各类样品中分离得到理想的胞外囊泡。而现有的生物膜也难以满足高效、低成本的分离提取需求。

技术实现思路

1、针对现有胞外分泌膜结构的提取工艺高成本、低效率及复杂性的问题，本技术主要提供一种表面修饰膜及其应用，其中的表面修饰膜具有高效率、低成本的提取胞外分泌膜结构的优点。

2、第一方面，本技术提供一种表面修饰膜，采用如下的技术方案：

3、一种表面修饰膜，所述表面修饰膜包括基底膜和负载在基底膜上的表面活性剂；所述表面活性剂选自阳离子表面活性剂和两性表面活性剂中的至少一种。

4、可选的，所述阳离子表面活性剂选自硬脂酰胺丙基二甲胺、脂肪酸钾皂、椰油酰基谷氨酸钠、山嵛酰胺丙基二甲胺、季铵盐型gemini表面活性剂、十二烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、聚氧化乙烯三甲基氯化铵、n-十四烷基-n-(2-羟乙基)-n,n-二甲基溴化铵、n-十四烷基-n,n-二(2-羟乙基)-n-甲基溴化铵、qascn、聚烷基三烷基氯化铵、3-氯-2-羟丙基三甲基氧化铵、n-十六烷基-n-(2-羟乙基)-n,n-二甲基溴化铵、n-十六烷基-n,n-二(2-羟乙基)-n-甲基溴化铵以及2,4,4-三氯-2-二羟基二苯醚中的一种或多种。

5、可选的，所述两性表面活性剂为甜菜碱型两性表面活性剂，所述甜菜碱型两性表面活性剂选自椰油酰胺丙基甜菜碱、十二烷基甜菜碱、辛癸酰胺丙基甜菜碱和月桂酰胺丙基羟磺酸甜菜碱中的至少一种。

6、可选的，所述表面活性剂为阳离子表面活性剂和两性表面活性剂，所述阳离子表面活性剂和两性表面活性剂的摩尔比为(0.01~1.64):3。

7、可选的，所述表面修饰膜上还负载有保护剂，所述保护剂选自生物碱、氨基酸和生物醇中的至少一种。

8、可选的，所述生物碱和表面活性剂的摩尔比为0.8~2.3:1。

9、可选的，所述氨基酸和表面活性剂的摩尔比为0.05~1.2:1。

10、可选的，所述生物醇和表面活性剂的摩尔比为0.24~1.5:1。

11、第二方面，本技术提供一种表面修饰膜的应用，采用如下的技术方案：

12、一种表面修饰膜的应用，所述应用包括在分离和/或提取胞外分泌膜结构的应用。

13、可选的，所述胞外分泌膜结构包括胞外囊泡。

14、第三方面，本技术提供一种胞外分泌膜结构的提取方法，采用如下的技术方案：

15、一种胞外分泌膜结构的提取方法，所述提取方法包括以下步骤：

16、s1、将生物样本预处理，去除大颗粒物质；

17、s2、将生物样本经预处理后，和装载液混合，随后离心并通过上述表面修饰膜，使得生物样本中的胞外分泌膜结构被捕捉在所述表面修饰膜上，所述表面修饰膜上负载有表面活性剂，所述表面活性剂选自季铵盐型阳离子表面活性剂和两性表面活性剂中的至少一种；

18、s3、用洗脱液洗脱表面修饰膜，得到胞外分泌膜结构收集液。

19、可选的，所述阳离子表面活性剂选自硬脂酰胺丙基二甲胺、脂肪酸钾皂、椰油酰基谷氨酸钠、山嵛酰胺丙基二甲胺、季铵盐型gemini表面活性剂、十二烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、聚氧化乙烯三甲基氯化铵、n-十四烷基-n-(2-羟乙基)-n,n-二甲基溴化铵、n-十四烷基-n,n-二(2-羟乙基)-n-甲基溴化铵、qascn、聚烷基三烷基氯化铵、3-氯-2-羟丙基三甲基氧化铵、n-十六烷基-n-(2-羟乙基)-n,n-二甲基溴化铵、n-十六烷基-n,n-二(2-羟乙基)-n-甲基溴化铵以及2,4,4-三氯-2-二羟基二苯醚中的一种或多种；其中，n取小于等于18的自然数。

20、可选的，所述季铵盐型gemini表面活性剂是对称性双子gemini表面活性剂或非对称性gemini表面活性剂。

21、可选的，所述两性表面活性剂为甜菜碱型两性表面活性剂，所述甜菜碱型两性表面活性剂选自椰油酰胺丙基甜菜碱、十二烷基甜菜碱、辛癸酰胺丙基甜菜碱和月桂酰胺丙基羟磺酸甜菜碱中的至少一种。

22、可选的，所述表面活性剂为季铵盐型阳离子表面活性剂和两性表面活性剂。

23、可选的，所述季铵盐型阳离子表面活性剂和两性表面活性剂的摩尔比为(0.01~1.64):3。

24、可选的，所述季铵盐型阳离子表面活性剂选自十二烷基三甲基溴化铵（dtab）、十六烷基三甲基溴化铵（ctab）、聚氧化乙烯三甲基氯化铵、n-十四烷基-n-(2-羟乙基)-n,n-二甲基溴化铵、n-十四烷基-n,n-二(2-羟乙基)-n-甲基溴化铵、聚烷基三烷基氯化铵、3-氯-2-羟丙基三甲基氧化铵、n-十六烷基-n-(2-羟乙基)-n,n-二甲基溴化铵、n-十六烷基-n,n-二(2-羟乙基)-n-甲基溴化铵以及2,4,4-三氯-2-二羟基二苯醚中的一种或多种时，所述季铵盐型阳离子表面活性剂和两性表面活性剂的摩尔比为(0.01~0.36):3。

25、可选的，所述季铵盐型阳离子表面活性剂为对称性双子gemini表面活性剂时，所述季铵盐型阳离子表面活性剂和两性表面活性剂的摩尔比为(0.23~0.45):3。

26、可选的，所述季铵盐型阳离子表面活性剂为非对称性双子gemini表面活性剂时，所述季铵盐型阳离子表面活性剂和两性表面活性剂的摩尔比为(0.56~1.26):3。

27、可选的，制备所述表面修饰膜时，和所述表面活性剂一起添加的还包括保护剂；所述保护剂选自生物碱、氨基酸和生物醇中的至少一种。

28、可选的，所述生物碱为甜菜碱。

29、可选的，所述生物碱和表面活性剂的摩尔比为0.8~2.3:1。

30、可选的，所述氨基酸为脯氨酸。

31、可选的，所述氨基酸和表面活性剂的摩尔比为0.05~1.2:1。

32、可选的，所述生物醇为甘露醇。

33、可选的，所述生物醇和表面活性剂的摩尔比为0.24~1.5:1。

34、通过在表面修饰膜上负载保护剂，能够降低胞外分泌膜结构在盐环境中被破坏的可能。其中，生物碱，尤其是甜菜碱能够抵抗盐胁迫，从而保护胞外分泌膜结构。其中的生物醇，尤其是甘露醇也在一定程度上保护胞外分泌膜结构不破裂。其中的氨基酸，尤其是脯氨酸，其通过清除自由基等方式保护胞外分泌膜结构。

35、而将生物碱、氨基酸和生物醇复合使用时，其对胞外分泌膜结构的保护效果更佳。

36、可选的，所述装载液包括以下浓度的组分：

37、87~113mm tris-丙烷缓冲液，130~165mm nacl，ph 6.23~6.78。

38、可选的，所述装载液还包括保护剂；所述保护剂选自生物碱、氨基酸和生物醇中的至少一种。

39、通过在装载液中添加保护剂，以保护胞外分泌膜结构不易在盐环境中被破坏。

40、可选的，所述装载液中若含有所述生物碱，所述生物碱和nacl的摩尔比为0.25~0.46:1；

41、所述装载液中若含有所述氨基酸，所述氨基酸和nacl的摩尔比为0.13~0.35:1；

42、所述装载液中若含有所述生物醇，所述生物醇和nacl的摩尔比为0.12~0.19:1。

43、可选的，所述洗脱液包括以下浓度的组分：

44、38~62mm tris-丙烷缓冲液，0.8~2.3m nacl，ph 6.13~6.52。

45、可选的，所述装载液还包括保护剂；所述保护剂选自生物碱、氨基酸和生物醇中的至少一种。

46、可选的，所述装载液中若含有所述生物碱，所述生物碱和nacl的摩尔比为0.02~0.16:1；

47、所述装载液中若含有所述氨基酸，所述氨基酸和nacl的摩尔比为0.005~0.1:1；

48、所述装载液中若含有所述生物醇，所述生物醇和nacl的摩尔比为0.005~0.1:1。

49、第四方面，本技术提供一种实施上述提取方法的试剂盒，采用如下的技术方案：

50、一种实施上述提取方法的试剂盒，所述试剂盒包括所述装载液、所述洗脱液和过滤装置，所述过滤装置中含有所述表面修饰膜。

51、综上所述，本技术具有以下有益效果：

52、1、本技术选用负载有适当表面活性剂的表面修饰膜，表面活性剂包括阳离子表面活性剂和两性表面活性剂中的至少一种，以此来实现对生物样本中胞外分泌膜结构的高效分离和提取。

53、2、本技术通过在表面修饰膜上添加保护剂，以进一步避免胞外分泌膜结构被破坏，从而保证得到胞外分泌膜结构的完整度，并进一步提高胞外分泌膜结构的获取浓度。