用于检测核酸的装置、测定和方法与流程

用于检测核酸的装置、测定和方法
1.交叉引用
2.本技术要求2020年5月19日提交的美国临时申请号63/027,309、2020年11月13日提交的美国临时申请号63/113,799、2020年11月17日提交的美国临时申请号63/114,977和2021年4月28日提交的美国临时申请号63/181,131的权益，所述临时申请中的每一篇全文以引用方式并入本文。
3.关于联邦资助研究的声明
4.本发明是根据美国国防部美国国防高级研究计划局(darpa)授予的合同号n66001-21-c-4048在政府的支持下完成的。美国政府享有本发明的某些权利。


背景技术：

5.使用crispr/cas系统快速、灵敏且特异性地检测核酸需要简化的装置。尤其需要可服务于即时需求(pon)市场的装置。在这些情况下，可使用横向流动测定，其中所述横向流动测定在一个测定条中组合各种试剂和处理步骤。这继而提供了一种灵敏且快速的检测方式。


技术实现要素：

6.本文描述了用于检测靶核酸的方法、系统和装置。在第一方面，提供了一种装置。该装置包括：室，该室被构造成容纳包含一种或多种核酸的样品；可编程核酸酶检测试剂和报告物；锁定机构，该锁定机构联接到室并且具有锁定构型和解锁构型，其中锁定机构被构造成当处于锁定构型时在包括样品的样品收集器与室之间形成不透流体的密封；试剂释放机构，该试剂释放机构被构造成当锁定机构处于锁定构型时从其释放一种或多种试剂；以及检测试剂系统，该检测试剂系统被构造成当靶核酸存在于样品的一种或多种核酸中时检测靶核酸的存在，其中靶核酸的存在由靶核酸与可编程核酸酶检测试剂的可编程核酸酶反应并且随后切割和释放报告物的至少一部分时产生的信号指示，其中装置的至少一部分被构造成一旦锁定机构以锁定构型接合就被密封在外壳中。在一些实施方案中，与在装置的外壳外部运行检测反应相比，试剂释放机构被构造成防止扩增子污染至少2倍。在一些实施方案中，其中检测系统被构造成当装置的所述部分被密封在主体中时保持在该主体外部。在一些实施方案中，检测系统设置在横向流动测定条上或检测室内。
7.在另一方面，提供了一种用于检测靶核酸的装置，该装置包括：室，该室被构造成容纳通过样品收集设备提供的样品，其中样品收集设备包括在其远侧端部处的样品收集器和在其近侧端部处的互锁件；可编程核酸酶；以及检测系统，该检测系统被构造成当靶核酸存在于样品中时检测靶核酸的存在，其中靶核酸的存在由靶核酸与可编程核酸酶的反应并且随后切割和释放报告物的至少一部分时产生的信号指示，其中集成到外壳中的互锁件被构造成形成不透液体的密封，从而封闭样品收集器和试剂，该试剂包含可编程核酸酶和报告物，其中互锁件包括释放机构，该释放机构被构造成释放封闭在外壳内的试剂以便与外壳外部的检测相比，防止反应被扩增子污染至少2倍，并且其中装置的至少一部分被构造成
一旦互锁件被接合以形成不透流体的密封就被密封在外壳内。在一些实施方案中，“儿童安全锁”密封件在密封时形成在互锁件与外壳之间。在一些实施方案中，其中互锁件包括螺旋顶盖，该螺旋顶盖被构造成旋拧到装置的外表面上的对应螺纹上。在一些实施方案中，螺旋顶盖被构造成在第一位置处形成不透流体的密封，并且其中继续将螺旋顶盖旋拧到第二位置将刺穿设置在室内的一个或多个试剂泡罩包装，随即释放室内部的一种或多种试剂，其中室位于密封外壳内部。在一些实施方案中，封闭的试剂包含报告物。在一些实施方案中，报告物包含rna序列。在一些实施方案中，报告物悬浮或固定在室内。在一些实施方案中，报告物被可编程核酸酶切割。在一些实施方案中，靶核酸是靶脱氧核糖核酸，并且其中靶脱氧核糖核酸在3'端缺少鸟嘌呤。在一些实施方案中，靶核酸是靶脱氧核糖核酸，并且其中靶脱氧核糖核酸的区段中的末端3'核苷酸是a、c或t。在一些实施方案中，靶核酸是靶脱氧核糖核酸，并且其中靶脱氧核糖核酸是单链脱氧核糖核酸。在一些实施方案中，靶核酸是靶脱氧核糖核酸，并且其中靶脱氧核糖核酸是单链脱氧核糖核酸寡核苷酸。在一些实施方案中，靶核酸是靶脱氧核糖核酸，并且其中靶脱氧核糖核酸是基因组单链脱氧核糖核酸。在一些实施方案中，靶核酸是靶脱氧核糖核酸，并且其中靶脱氧核糖核酸具有18至100个核苷酸的长度。在一些实施方案中，靶核酸是靶脱氧核糖核酸，并且其中靶脱氧核糖核酸具有18至30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，靶核酸是靶脱氧核糖核酸，并且其中靶脱氧核糖核酸具有20个核苷酸的长度。在一些实施方案中，装置是电池供电的。在一些实施方案中，装置不是电池供电的。在一些实施方案中，装置包括化学加热元件。在一些实施方案中，装置包括样品垫区域、核酸扩增区域、缀合垫区域、检测区域、收集垫区域或它们的任何组合。在一些实施方案中，外壳封装一个或多个支持介质。在一些实施方案中，外壳由纸板、塑料、聚合物或为支持介质提供机械保护的材料制成。在一些实施方案中，支持介质被构造成以可检测的形式呈现信号。在一些实施方案中，支持介质是横向流动测定条。在一些实施方案中，可编程核酸酶选自由cas13、mad7、mad2、csm1、cas9、c2c4、c2c8、c2c5、c2c10、c2c9和casz组成的组。在一些实施方案中，可编程核酸酶是v型crispr-cas系统、vi型crispr cas系统或iii型crispr cas系统。在一些实施方案中，cas13是cas13a、cas13b、cas13c、cas13d或cas13e。在一些实施方案中，外壳包括过滤装置。在一些实施方案中，外壳包括被构造成在裂解步骤之后过滤样品的过滤装置。在一些实施方案中，外壳容纳扩增室。在一些实施方案中，扩增室包含扩增试剂。在一些实施方案中，扩增试剂被构造用于扩增靶核酸。在一些实施方案中，扩增包括等温扩增。在一些实施方案中，等温扩增包括lamp扩增。在一些实施方案中，等温扩增在62℃下进行。在一些实施方案中，等温扩增进行不超过5分钟。在一些实施方案中，装置在一个室中包含扩增试剂和detectr
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试剂。在此类实施方案中，装置可被构造用于一锅detectr
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反应，其中a)样品制备、扩增和检测，b)样品制备和检测，或者c)扩增和检测在装置的单个室内进行。在一些实施方案中，装置被构造用于两锅反应，其中扩增和检测在装置的单独区域中进行。在一些实施方案中，装置被构造用于一锅反应，其中扩增、逆转录、扩增和逆转录、或者扩增和体外转录与检测同时进行。在一些实施方案中，装置被构造用于两锅反应，其中逆转录、扩增和体外转录的任何组合作为第一反应在第一室中进行，然后在第二室中进行detectr
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测定。在一些实施方案中，在第二室中进行反应产物的检测。在其他实施方案中，在第三室中进行反应产物的检测。在其他实施方案中，扩增包括pcr扩增。在其他实施方案中，用于扩增的试剂包含重组酶、寡核苷酸引物、单链dna结合(ssb)蛋白、聚合酶
或它们的组合。在其他实施方案中，扩增进行不超过1分钟。在其他实施方案中，扩增在不超过20℃的温度下进行。在其他实施方案中，支持介质包括核酸扩增区域。在其他实施方案中，装置是横向流动装置。在其他实施方案中，横向流动装置能够在小于60分钟内提供结果。在其他实施方案中，扩增进行不超过5分钟。在其他实施方案中，外壳包括横向流动条。在其他实施方案中，横向流动条包括多个层。在其他实施方案中，横向流动条被构造成与样品制备装置连接。在其他实施方案中，支持介质是横向流动测定条。在其他实施方案中，外壳包括至少两个横向流动条，其中装置被构造用于靶核酸的多路复用检测。在其他实施方案中，一种或多种报告物存在于横向流动条上。在其他实施方案中，所述一种或多种报告物中的第一报告物是生物素-fam报告物，并且所述一种或多种报告物中的第二报告物是生物素-dig报告物。在其他实施方案中，装置被构造成用两种不同的可编程核酸酶和两种不同的单链报告物在样品中检测至少两种不同的单链靶核酸，其中样品与试剂接触足以反式切割所述至少两种不同的单链报告物的预定长度的时间。在其他实施方案中，装置被构造用于多路复用检测，其中在位于横向流动条的检测区域中的多个空间上分离的检测点处同时检测多个单独的靶核酸，另外其中每个检测点与单独的靶核酸互补。在其他实施方案中，一种或多种报告物中的不同报告物对应于两种或多种核酸中的不同靶核酸。在其他实施方案中，装置包括在单个外壳中的多个支持介质。在其他实施方案中，多个支持介质共享单个样品垫。在其他实施方案中，样品垫以包括分支或径向形式的各种构型连接到多个支持介质。在其他实施方案中，被外壳封闭的试剂包含多种指导核酸、多种可编程核酸酶和多种单链报告物，其中指导核酸中的一种、可编程核酸酶中的一种和单链报告物中的一种的组合检测一种靶核酸并且可在检测区域上提供检测点。在其他实施方案中，装置包括多个支持介质，另外其中每个支持介质包括多个检测点，该装置被构造成在单个反应中检测至少6、7、8、9或10种不同的靶核酸。
8.本文描述了用于检测靶核酸的试剂盒的各种实施方案。在一些实施方案中，试剂盒包括本文所述的任何装置、样品收集器以及其使用说明书。
9.本文描述了用于测定靶核酸的各种方法，所述方法包括：将包含靶核酸的样品插入装置的室中，该装置包括外壳和用于密封外壳的锁定机构；接合锁定机构以将室密封在外壳内；使用试剂释放机构释放至少一种试剂；以及检测靶核酸的存在或不存在。
10.本文描述了用于测定靶核酸的方法，所述方法包括：将包含靶核酸的样品插入位于装置的外壳中的室内，其中室包含可编程核酸酶；外壳包括锁定机构以在样品收集器与装置之间形成不透流体的密封；并且外壳包括试剂释放机构，与装置外部的检测相比，该试剂释放机构能够防止反应被扩增子污染2倍；以及检测系统，该检测系统被构造成检测由经由靶核酸与可编程核酸酶的反应和报告物的释放产生的信号指示的靶核酸的存在；接合锁定机构，由此将装置密封在主体中；使用试剂释放机构释放至少一种试剂；以及在检测系统上检测靶核酸的存在。在一些实施方案中，试剂是如本文所述的扩增试剂。在一些实施方案中，试剂是如本文所述的detectr
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试剂。在其他实施方案中，靶核酸来自处于疾病风险中的受试者，该受试者的样品中所含的靶核酸指示疾病。在其他实施方案中，靶核酸包含来自病毒或细菌或导致样品中的疾病的其他因子的核酸的一部分。在其他实施方案中，靶核酸指示癌症的存在。在其他实施方案中，样品包括血液、血清、血浆、唾液、尿液、粘膜样品、腹膜样品、脑脊液、胃分泌物、鼻分泌物、痰、咽分泌物、尿道或阴道分泌物、渗出物、流出物或组
织。在其他实施方案中，室包含报告物。在其他实施方案中，报告物包含rna序列。在其他实施方案中，其中报告物是rna报告物。在其他实施方案中，报告物悬浮或固定在室内。在其他实施方案中，报告物被可编程核酸酶切割。在其他实施方案中，室包含在3'端缺少鸟嘌呤的靶脱氧核糖核酸。在一些实施方案中，靶脱氧核糖核酸的区段中的末端3'核苷酸是a、c或t。在一些实施方案中，靶脱氧核糖核酸是单链脱氧核糖核酸。在一些实施方案中，靶脱氧核糖核酸是单链脱氧核糖核酸寡核苷酸。在一些实施方案中，靶脱氧核糖核酸是基因组单链脱氧核糖核酸。在一些实施方案中，靶脱氧核糖核酸具有18至100个核苷酸的长度。在一些实施方案中，靶脱氧核糖核酸具有18至30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，靶脱氧核糖核酸具有20个核苷酸的长度。在一些实施方案中，装置是电池供电的。在一些实施方案中，装置不是电池供电的。在一些实施方案中，装置包括化学加热元件。在一些实施方案中，检测系统包括被构造成以可检测的形式呈现可确定日期的信号的支持介质。在一些实施方案中，支持介质是横向流动测定条。在一些实施方案中，可编程核酸酶选自由cas13、mad7、mad2、csm1、cas9、c2c4、c2c8、c2c5、c2c10、c2c9和casz组成的组。在一些实施方案中，可编程核酸酶是v型crispr-cas系统、vi型crispr cas系统或iii型crispr cas系统。在一些实施方案中，cas13是cas13a、cas13b、cas13c、cas13d或cas13e。
11.本文描述了用于防止污染并利用旋通测定的基于可编程核酸酶的检测的各种方法，所述方法包括：提供外壳，该外壳被构造成容纳包含基于可编程核酸酶的检测试剂、扩增试剂和样品的内容物，其中检测试剂通过过滤器与包含扩增试剂和样品的混合物物理分离；加热外壳，直到样品的至少一部分被扩增试剂扩增；在样品的所述部分扩增后，将外壳离心；加热外壳，直到样品与基于可编程核酸酶的检测试剂反应；以及使外壳的内容物可视化。在一些实施方案中，扩增是等温扩增。在一些实施方案中，将容纳用于扩增的内容物的外壳加热到约37至67摄氏度。在一些实施方案中，离心的持续时间为约10至30秒。在一些实施方案中，用于检测的内容物的孵育发生在约37摄氏度下。在一些实施方案中，使内容物可视化包括使从内容物发射的荧光可视化。在一些实施方案中，可视化包括通过眼睛查看、通过装置成像或它们的任何组合。
12.本文描述了用于防止污染并利用旋通测定的基于可编程核酸酶的检测的各种装置，所述装置包括：外壳，该外壳包含基于可编程核酸酶的检测试剂、扩增试剂和样品，其中检测试剂通过过滤器与包含扩增试剂和样品的混合物物理分离，其中过滤器被构造成保持检测试剂与混合物之间的分离，直到外壳被离心，从而允许样品被扩增试剂扩增；其中过滤器被构造成在将外壳离心时促进检测试剂转移到混合物中；并且其中外壳被构造成允许由混合物产生的一个或多个信号可视化。在一些实施方案中，外壳包含被构造成允许荧光穿过其中的透明或半透明材料。在一些实施方案中，外壳包含被构造成允许可见光穿过其中的透明或半透明材料。
13.本文描述了用于检测靶核酸的系统、装置和方法。本文描述了一种用于检测靶核酸的系统，该系统包括试剂室；设置在所述试剂室内的可编程核酸酶，所述可编程核酸酶包含与所述靶核酸或其部分互补的指导核酸，其中所述可编程核酸酶被构造成通过所述指导核酸与所述靶核酸的结合而被激活；设置在所述反应室内的报告物，其中所述报告物包含可切割核酸和检测部分，其中所述可切割核酸被所激活的可编程核酸酶切割从所述可切割核酸释放所述检测部分；以及检测区域，其中所述检测区域包含设置在其上并且被构造成
捕获所释放的检测部分的固定捕获探针，其中所述检测部分的释放在对应于所述固定捕获探针的位置处直接地或间接地产生可检测信号。在一些实施方案中，指导核酸包含与靶核酸或其部分反向互补的至少10个核苷酸。在一些实施方案中，横向流动测定条包括检测区域。在一些实施方案中，系统还包含扩增试剂。在一些实施方案中，扩增试剂位于试剂室内。在一些实施方案中，扩增试剂是lamp试剂。在一些实施方案中，横向流动测定条还包括样品垫。在一些实施方案中，样品垫是试剂室。在一些实施方案中，横向流动测定条包含流动捕获探针。在一些实施方案中，流动捕获探针是抗生物素官能化金纳米颗粒。在一些实施方案中，横向流动测定条还包括缀合垫，其中样品垫与缀合垫流体连通。在一些实施方案中，样品垫位于缀合垫与检测区域之间。在一些实施方案中，缀合垫包含流动捕获探针。在一些实施方案中，流动捕获探针包含抗体。在一些实施方案中，其中样品垫和/或缀合垫与检测区域流体连通。在一些实施方案中，横向流动测定条还包括吸收垫。在一些实施方案中，样品垫、缀合垫和/或检测区域与吸收垫流体连通。在一些实施方案中，吸收垫被构造成通过毛细管作用抽吸样品穿过横向流动测定条，其中样品包含靶核酸。在一些实施方案中，通过外部压力驱动样品通过横向流动测定条，其中样品包含靶核酸。在一些实施方案中，外部压力由与横向流动测定条流体连通的泵施加。在一些实施方案中，泵是手动驱动的注射器或自动注射泵。在一些实施方案中，固定捕获探针包含抗体。在一些实施方案中，抗体选自由核酸捕获序列、抗fitc、抗dig、抗tamra、抗cy5和抗af594组成的组。在一些实施方案中，检测部分包含化学官能团。在一些实施方案中，化学官能团是生物素。在一些实施方案中，检测部分包含标记物。在一些实施方案中，标记物选自由与核酸捕获序列互补的核酸序列、fitc、dig、tamra、cy5
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和af594
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组成的组。在一些实施方案中，可编程核酸酶探针还包含cas酶。在一些实施方案中，cas酶选自由cas 12、cas 13、cas 14和casphi组成的组。在一些实施方案中，系统还包含多种可编程核酸酶和多种不同的指导核酸，其中所述多种可编程核酸酶中的每种可编程核酸酶包含所述多种不同的指导核酸中的指导核酸。在一些实施方案中，每种指导核酸与对应的靶核酸互补。在一些实施方案中，系统还包含多种报告物。在一些实施方案中，系统还包含多种标记物，其中所述多种报告物中的每种报告物包含检测部分和所述多种标记物中的标记物。在一些实施方案中，系统还包含多种不同的固定捕获探针，其中所述多种标记物中的每种标记物与所述多种不同的固定捕获探针中的对应固定捕获探针互补。在一些实施方案中，外壳包括样品入口、试剂室和横向流动条。在一些实施方案中，系统还包括位于试剂室与检测区域之间的扩增室。在一些实施方案中，信号是视觉信号。在一些实施方案中，检测区域包括一个或多个检测点。在一些实施方案中，所述一个或多个检测点中的每个检测点包含多个固定捕获探针中的对应固定捕获探针。在一些实施方案中，检测点选自由线、圆形、椭圆形、矩形、三角形和加号组成的形状组。在一些实施方案中，试剂室包括表面。在一些实施方案中，可编程核酸酶和/或报告物被固定到表面上。在一些实施方案中，可编程核酸酶和/或报告物通过共价力、非共价力或静电力固定到表面上。在一些实施方案中，可编程核酸酶探针和/或报告物通过接头固定到表面上。在一些实施方案中，可编程核酸酶的cas酶通过接头固定到试剂室的表面上。在一些实施方案中，接头连接到可编程核酸酶的指导核酸。在一些实施方案中，系统还包括对照点。在一些实施方案中，检测点位于试剂室与对照点之间。在一些实施方案中，对照点位于试剂室与检测点之间。在一些实施方案中，可检测信号是视觉可检测的信号。在一些实施方案中，可编程核酸
酶被构造成以顺式切割构型或反式切割构型切割可切割核酸。在一些实施方案中，系统还包含多种可编程核酸酶探针，其中所述多种可编程核酸酶探针中的每种可编程核酸酶探针与靶核酸的多个对应区段互补。在一些实施方案中，靶核酸的每个对应区段是非重叠的、部分重叠的或完全重叠的。
14.本文描述了用于检测靶核酸的横向流动测定条系统，该系统包括：样品垫，该样品垫包括：设置在样品垫上的可编程核酸酶，该可编程核酸酶包含与靶核酸或其部分互补的指导核酸，其中可编程核酸酶被构造成通过指导核酸与靶核酸的结合而被激活，报告物，其中报告物包含可切割核酸和检测部分，其中可切割核酸被所激活的可编程核酸酶切割从可切割核酸释放检测部分；以及与样品垫流体联接的检测区域，其中检测区域包含设置在其上并且被构造成捕获所释放的检测部分的固定捕获探针，其中检测部分的释放在对应于固定捕获探针的位置处直接地或间接地产生可检测信号。在一些实施方案中，其中指导核酸包含与靶核酸或其部分反向互补的至少10个核苷酸。在一些实施方案中，系统还包含扩增试剂。在一些实施方案中，扩增试剂位于试剂室内。在一些实施方案中，扩增试剂是lamp试剂。在一些实施方案中，横向流动测定条包含流动捕获探针。在一些实施方案中，横向流动测定条还包括缀合垫，其中样品垫与缀合垫流体连通，其中样品垫位于缀合垫与检测区域之间。在一些实施方案中，缀合垫包含流动捕获抗体。在一些实施方案中，样品垫和/或缀合垫与检测区域流体连通。在一些实施方案中，横向流动测定条还包括吸收垫。在一些实施方案中，样品垫、缀合垫和/或检测区域与吸收垫流体连通。在一些实施方案中，吸收垫被构造成通过毛细管作用抽吸样品穿过横向流动测定条，其中样品包含靶核酸。在一些实施方案中，通过外部压力驱动样品通过横向流动测定条，其中样品包含靶核酸。在一些实施方案中，外部压力由与横向流动测定条流体连通的泵施加。在一些实施方案中，泵是手动驱动的注射器或自动注射泵。在一些实施方案中，流动捕获探针是抗生物素官能化金纳米颗粒。在一些实施方案中，固定捕获探针包含抗体。在一些实施方案中，抗体选自由核酸捕获序列、抗fitc、抗dig、抗tamra、抗cy5和抗af594组成的组。在一些实施方案中，检测部分包含化学官能团。在一些实施方案中，化学官能团是生物素。在一些实施方案中，检测部分包含标记物。在一些实施方案中，标记物选自由与核酸捕获序列互补的核酸序列、fitc、dig、tamra、cy5
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组成的组。在一些实施方案中，可编程核酸酶探针还包含cas酶。在一些实施方案中，cas酶选自由cas 12、cas 13、cas 14和casphi组成的组。在一些实施方案中，样品包含多种靶核酸。在一些实施方案中，系统还包含多种可编程核酸酶和多种不同的指导核酸，其中所述多种可编程核酸酶中的每种可编程核酸酶包含所述多种不同的指导核酸中的指导核酸。在一些实施方案中，每种指导核酸与对应的靶核酸互补。在一些实施方案中，系统还包含多种报告物。在一些实施方案中，系统还包含多种标记物，其中所述多种报告物中的每种报告物包含检测部分和所述多种标记物中的标记物。在一些实施方案中，系统还包含多种不同的固定捕获探针，其中所述多种标记物中的每种标记物与所述多种不同的固定捕获探针中的固定捕获探针互补。在一些实施方案中，外壳包括样品入口和横向流动条。在一些实施方案中，系统还包括位于试剂室与检测区域之间的扩增室。在一些实施方案中，信号是视觉信号。在一些实施方案中，检测区域包括一个或多个检测点。在一些实施方案中，所述一个或多个检测点中的每个检测点包含多个固定捕获探针中的对应固定捕获探针。在一些实施方案中，其中所述一个或多个检测点中的每个检测点选自由线、圆形、椭圆形、矩
形、三角形和加号组成的形状组。在一些实施方案中，可编程核酸酶和/或报告物被固定到样品垫上。在一些实施方案中，可编程核酸酶和/或报告物通过共价力、非共价力或静电力固定到样品垫上。在一些实施方案中，固定到样品垫上的可编程核酸酶和/或报告物通过接头固定。在一些实施方案中，可编程核酸酶的cas酶通过接头固定到样品垫上。在一些实施方案中，接头连接到可编程核酸酶的指导核酸。在一些实施方案中，系统还包括对照点。在一些实施方案中，检测点位于试剂室与对照点之间。在一些实施方案中，对照点位于试剂室与检测点之间。在一些实施方案中，可检测信号是视觉可检测的信号。在一些实施方案中，可编程核酸酶被构造成以顺式切割构型或反式切割构型切割可切割核酸。在一些实施方案中，系统还包含多种可编程核酸酶探针，其中所述多种可编程核酸酶探针中的每种可编程核酸酶探针与靶核酸的多个对应区段互补。在一些实施方案中，靶核酸的每个对应区段是非重叠的、部分重叠的或完全重叠的。
15.本文描述了用于检测靶核酸的横向流动测定条系统，该系统包括：样品垫，该样品垫包括：设置在样品垫上的可编程核酸酶，该可编程核酸酶包含：1)cas 13酶或cas 14酶，以及2)与靶核酸或其部分互补的指导核酸，其中可编程核酸酶被构造成通过指导核酸与靶核酸的结合而被激活，以及报告物，其中报告物包含可切割核酸和检测部分，其中可切割核酸被所激活的可编程核酸酶切割从可切割核酸释放检测部分；以及与样品垫流体联接的检测区域，其中检测区域包含设置在其上并且被构造成捕获所释放的检测部分的固定捕获探针，其中检测部分的释放在对应于固定捕获探针的位置处直接地或间接地产生可检测信号。在一些实施方案中，指导核酸包含与靶核酸或其部分反向互补的至少10个核苷酸。在一些实施方案中，系统还包括横向流动测定条，该横向流动测定条包括检测区域。在一些实施方案中，系统还包含扩增试剂。在一些实施方案中，扩增试剂位于试剂室内。在一些实施方案中，扩增试剂是lamp试剂。在一些实施方案中，横向流动测定条还包括样品垫。在一些实施方案中，样品垫是试剂室。在一些实施方案中，横向流动测定条包含流动捕获探针。在一些实施方案中，流动捕获探针是抗生物素官能化金纳米颗粒。在一些实施方案中，横向流动测定条还包括缀合垫，其中样品垫与缀合垫流体连通。在一些实施方案中，样品垫位于缀合垫与检测区域之间。在一些实施方案中，缀合垫包含流动捕获探针。在一些实施方案中，流动捕获探针包含抗体。在一些实施方案中，样品垫和/或缀合垫与检测区域流体连通。在一些实施方案中，横向流动测定条还包括吸收垫。在一些实施方案中，样品垫、缀合垫和/或检测区域与吸收垫流体连通。在一些实施方案中，吸收垫被构造成通过毛细管作用抽吸样品穿过横向流动测定条，其中样品包含靶核酸。在一些实施方案中，通过外部压力驱动样品通过横向流动测定条，其中样品包含靶核酸。在一些实施方案中，外部压力由与横向流动测定条流体连通的泵施加。在一些实施方案中，泵是手动驱动的注射器或自动注射泵。在一些实施方案中，固定捕获探针包含抗体。在一些实施方案中，抗体选自由核酸捕获序列、抗fitc、抗dig、抗tamra、抗cy5和抗af594组成的组。在一些实施方案中，检测部分包含化学官能团。在一些实施方案中，化学官能团是生物素。在一些实施方案中，检测部分包含标记物。在一些实施方案中，标记物选自由与核酸捕获序列互补的核酸序列、fitc、dig、tamra、cy5
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组成的组。在一些实施方案中，可编程核酸酶探针还包含cas酶。在一些实施方案中，cas酶是cas 12或casphi。在一些实施方案中，系统还包含多种可编程核酸酶和多种不同的指导核酸，其中所述多种可编程核酸酶中的每种可编程核酸酶包含所述多种不同的指导核
酸中的指导核酸。在一些实施方案中，每种指导核酸与对应的靶核酸互补。在一些实施方案中，系统还包含多种报告物。在一些实施方案中，系统还包含多种标记物，其中所述多种报告物中的每种报告物包含检测部分和所述多种标记物中的标记物。在一些实施方案中，系统还包含多种不同的固定捕获探针，其中所述多种标记物中的每种标记物与所述多种不同的固定捕获探针中的对应固定捕获探针互补。在一些实施方案中，外壳包括样品入口、试剂室和横向流动条。在一些实施方案中，系统还包括位于试剂室与检测区域之间的扩增室。在一些实施方案中，信号是视觉信号。在一些实施方案中，检测区域包括一个或多个检测点。在一些实施方案中，所述一个或多个检测点中的每个检测点包含多个固定捕获探针中的对应固定捕获探针。在一些实施方案中，检测点选自由线、圆形、椭圆形、矩形、三角形和加号组成的形状组。在一些实施方案中，试剂室包括表面。在一些实施方案中，可编程核酸酶和/或报告物被固定到表面上。在一些实施方案中，可编程核酸酶和/或报告物通过共价力、非共价力或静电力固定到表面上。在一些实施方案中，可编程核酸酶探针和/或报告物通过接头固定到表面上。在一些实施方案中，可编程核酸酶的cas酶通过接头固定到试剂室的表面上。在一些实施方案中，接头连接到可编程核酸酶的指导核酸。在一些实施方案中，系统还包括对照点。在一些实施方案中，检测点位于试剂室与对照点之间。在一些实施方案中，对照点位于试剂室与检测点之间。在一些实施方案中，可检测信号是视觉可检测的信号。在一些实施方案中，可编程核酸酶被构造成以顺式切割构型或反式切割构型切割可切割核酸。在一些实施方案中，系统还包含多种可编程核酸酶探针，其中所述多种可编程核酸酶探针中的每种可编程核酸酶探针与靶核酸的多个对应区段互补。在一些实施方案中，靶核酸的每个对应区段是非重叠的、部分重叠的或完全重叠的。
16.本文描述了一种用于检测靶核酸的系统，该系统包括：试剂室；设置在所述试剂室内的可编程核酸酶，所述可编程核酸酶包含1)cas14酶或cas 13酶，以及2)与所述靶核酸或其部分互补的指导核酸，其中所述可编程核酸酶被构造成通过所述指导核酸与所述靶核酸的结合而被激活；设置在所述试剂室内的报告物，其中所述报告物包含可切割核酸和检测部分，其中所述可切割核酸被所激活的可编程核酸酶切割从所述可切割核酸释放所述检测部分；以及包括检测区域的横向流动测定条，其中所述检测区域包含设置在其上并且被构造成捕获所释放的检测部分的固定捕获探针，其中所述检测部分的释放在对应于所述固定捕获探针的位置处直接地或间接地产生可检测信号。在一些实施方案中，当阀打开时，试剂室流体连接到检测室。在一些实施方案中，指导核酸包含与靶核酸或其部分反向互补的至少10个核苷酸。在一些实施方案中，系统还包括横向流动测定条，该横向流动测定条包括检测区域。在一些实施方案中，系统还包含扩增试剂。在一些实施方案中，扩增试剂位于试剂室内。在一些实施方案中，扩增试剂是lamp试剂。在一些实施方案中，横向流动测定条还包括样品垫。在一些实施方案中，样品垫是试剂室。在一些实施方案中，横向流动测定条包含流动捕获探针。在一些实施方案中，流动捕获探针是抗生物素官能化金纳米颗粒。在一些实施方案中，横向流动测定条还包括缀合垫，其中样品垫与缀合垫流体连通。在一些实施方案中，样品垫位于缀合垫与检测区域之间。在一些实施方案中，缀合垫包含流动捕获探针。在一些实施方案中，流动捕获探针包含抗体。在一些实施方案中，样品垫和/或缀合垫与检测区域流体连通。在一些实施方案中，横向流动测定条还包括吸收垫。在一些实施方案中，样品垫、缀合垫和/或检测区域与吸收垫流体连通。在一些实施方案中，吸收垫被构造成通过
毛细管作用抽吸样品穿过横向流动测定条，其中样品包含靶核酸。在一些实施方案中，通过外部压力驱动样品通过横向流动测定条，其中样品包含靶核酸。在一些实施方案中，外部压力由与横向流动测定条流体连通的泵施加。在一些实施方案中，泵是手动驱动的注射器或自动注射泵。在一些实施方案中，固定捕获探针包含抗体。在一些实施方案中，抗体选自由核酸捕获序列、抗fitc、抗dig、抗tamra、抗cy5和抗af594组成的组。在一些实施方案中，检测部分包含化学官能团。在一些实施方案中，化学官能团是生物素。在一些实施方案中，检测部分包含标记物。在一些实施方案中，标记物选自由与核酸捕获序列互补的核酸序列、fitc、dig、tamra、cy5
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和af594
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组成的组。在一些实施方案中，可编程核酸酶探针还包含cas酶。在一些实施方案中，cas酶选自由cas 12、cas 13、cas 14和casphi组成的组。在一些实施方案中，系统还包含多种可编程核酸酶和多种不同的指导核酸，其中所述多种可编程核酸酶中的每种可编程核酸酶包含所述多种不同的指导核酸中的指导核酸。在一些实施方案中，每种指导核酸与对应的靶核酸互补。在一些实施方案中，系统还包含多种报告物。在一些实施方案中，还包含多种标记物，其中所述多种报告物中的每种报告物包含检测部分和所述多种标记物中的标记物。在一些实施方案中，系统还包含多种不同的固定捕获探针，其中所述多种标记物中的每种标记物与所述多种不同的固定捕获探针中的对应固定捕获探针互补。在一些实施方案中，其中外壳包括样品入口、试剂室和横向流动条。在一些实施方案中，系统还包括位于试剂室与检测区域之间的扩增室。在一些实施方案中，信号是视觉信号。在一些实施方案中，检测区域包括一个或多个检测点。在一些实施方案中，所述一个或多个检测点中的每个检测点包含多个固定捕获探针中的对应固定捕获探针。在一些实施方案中，检测点选自由线、圆形、椭圆形、矩形、三角形和加号组成的形状组。在一些实施方案中，试剂室包括表面。在一些实施方案中，其中可编程核酸酶和/或报告物被固定到表面上。在一些实施方案中，可编程核酸酶和/或报告物通过共价力、非共价力或静电力固定到表面上。在一些实施方案中，可编程核酸酶探针和/或报告物通过接头固定到表面上。在一些实施方案中，可编程核酸酶的cas酶通过接头固定到试剂室的表面上。在一些实施方案中，接头连接到可编程核酸酶的指导核酸。在一些实施方案中，系统还包括对照点。在一些实施方案中，检测点位于试剂室与对照点之间。在一些实施方案中，对照点位于试剂室与检测点之间。在一些实施方案中，可检测信号是视觉可检测的信号。在一些实施方案中，可编程核酸酶被构造成以顺式切割构型或反式切割构型切割可切割核酸。在一些实施方案中，系统还包含多种可编程核酸酶探针，其中所述多种可编程核酸酶探针中的每种可编程核酸酶探针与靶核酸的多个对应区段互补。在一些实施方案中，靶核酸的每个对应区段是非重叠的、部分重叠的或完全重叠的。
17.本文描述了一种用于检测靶核酸的方法，该方法包括以下步骤：提供系统，该系统包括：试剂室；设置在试剂室内的可编程核酸酶，该可编程核酸酶包含与靶核酸或其部分互补的指导核酸，其中可编程核酸酶被构造成通过指导核酸与靶核酸的结合而被激活；设置在反应室内的报告物，其中报告物包含可切割核酸和检测部分，其中可切割核酸被所激活的可编程核酸酶切割从可切割核酸释放检测部分，以及包括检测区域的横向流动测定条，其中检测区域包含设置在其上并且被构造成捕获所释放的检测部分的固定捕获探针，其中检测部分的释放在对应于固定捕获探针使样品与试剂室接触的位置处直接地或间接地产生可检测信号；以及经由在固定捕获探针的位置处产生的可检测信号来鉴定样品中靶核酸
的存在。在一些实施方案中，方法还包括扩增包含靶核酸的样品。在一些实施方案中，指导核酸包含与靶核酸或其部分反向互补的至少10个核苷酸。在一些实施方案中，方法还包括横向流动测定条，该横向流动测定条包括检测区域。在一些实施方案中，方法还包括扩增试剂。在一些实施方案中，扩增试剂位于试剂室内。在一些实施方案中，其中扩增试剂是lamp试剂。在一些实施方案中，横向流动测定条还包括样品垫。在一些实施方案中，样品垫是试剂室。在一些实施方案中，横向流动测定条包含流动捕获探针。在一些实施方案中，流动捕获探针是抗生物素官能化金纳米颗粒。在一些实施方案中，横向流动测定条还包括缀合垫，其中样品垫与缀合垫流体连通。在一些实施方案中，样品垫位于缀合垫与检测区域之间。在一些实施方案中，缀合垫包含流动捕获探针。在一些实施方案中，流动捕获探针包含抗体。在一些实施方案中，样品垫和/或缀合垫与检测区域流体连通。在一些实施方案中，横向流动测定条还包括吸收垫。在一些实施方案中，样品垫、缀合垫和/或检测区域与吸收垫流体连通。在一些实施方案中，吸收垫被构造成通过毛细管作用抽吸样品穿过横向流动测定条，其中样品包含靶核酸。在一些实施方案中，通过外部压力驱动样品通过横向流动测定条，其中样品包含靶核酸。在一些实施方案中，外部压力由与横向流动测定条流体连通的泵施加。在一些实施方案中，泵是手动驱动的注射器或自动注射泵。在一些实施方案中，固定捕获探针包含抗体。在一些实施方案中，抗体选自由核酸捕获序列、抗fitc、抗dig、抗tamra、抗cy5和抗af594组成的组。在一些实施方案中，检测部分包含化学官能团。在一些实施方案中，化学官能团是生物素。在一些实施方案中，检测部分包含标记物。在一些实施方案中，标记物选自由与核酸捕获序列互补的核酸序列、fitc、dig、tamra、cy5
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和af594
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组成的组。在一些实施方案中，可编程核酸酶探针还包含cas酶。在一些实施方案中，cas酶选自由cas 12、cas 13、cas 14和casphi组成的组。在一些实施方案中，方法还包括多种可编程核酸酶和多种不同的指导核酸，其中所述多种可编程核酸酶中的每种可编程核酸酶包含所述多种不同的指导核酸中的指导核酸。在一些实施方案中，每种指导核酸与对应的靶核酸互补。在一些实施方案中，方法还包括多种报告物。在一些实施方案中，方法还包括多种标记物，其中所述多种报告物中的每种报告物包含检测部分和所述多种标记物中的标记物。在一些实施方案中，还包括多种不同的固定捕获探针，其中所述多种标记物中的每种标记物与所述多种不同的固定捕获探针中的对应固定捕获探针互补。在一些实施方案中，外壳包括样品入口、试剂室和横向流动条。在一些实施方案中，方法还包括位于试剂室与检测区域之间的扩增室。在一些实施方案中，信号是视觉信号。在一些实施方案中，检测区域包括一个或多个检测点。在一些实施方案中，所述一个或多个检测点中的每个检测点包含多个固定捕获探针中的对应固定捕获探针。在一些实施方案中，检测点选自由线、圆形、椭圆形、矩形、三角形和加号组成的形状组。在一些实施方案中，试剂室包括表面。在一些实施方案中，可编程核酸酶和/或报告物被固定到表面上。在一些实施方案中，可编程核酸酶和/或报告物通过共价力、非共价力或静电力固定到表面上。在一些实施方案中，可编程核酸酶探针和/或报告物通过接头固定到表面上。在一些实施方案中，可编程核酸酶的cas酶通过接头固定到试剂室的表面上。在一些实施方案中，接头连接到可编程核酸酶的指导核酸。在一些实施方案中，还包括对照点。在一些实施方案中，检测点位于试剂室与对照点之间。在一些实施方案中，对照点位于试剂室与检测点之间。在一些实施方案中，可检测信号是视觉可检测的信号。在一些实施方案中，可编程核酸酶被构造成以顺式切割构型或反式切割构型切割可切
割核酸。在一些实施方案中，方法还包括多种可编程核酸酶探针，其中所述多种可编程核酸酶探针中的每种可编程核酸酶探针与靶核酸的多个对应区段互补。在一些实施方案中，靶核酸的每个对应区段是非重叠的、部分重叠的或完全重叠的。
18.本文描述了一种用于检测靶核酸的装置，该装置包括：试剂室，该试剂室包含：设置在试剂室内的可编程核酸酶，该可编程核酸酶包含与靶核酸或其部分互补的指导核酸，其中可编程核酸酶被构造成通过指导核酸与靶核酸的结合而被激活，以及设置在反应室内的报告物，其中报告物包含可切割核酸和检测部分，其中可切割核酸被所激活的可编程核酸酶切割从可切割核酸释放检测部分；与所述试剂室流体连通的检测区域，其中所述检测区域包含设置在其上并且被构造成捕获所释放的检测部分的固定捕获探针，其中所述检测部分的释放在对应于所述固定捕获探针的位置处直接地或间接地产生可检测信号；以及壳体，该壳体容纳试剂室和检测区域。在一些实施方案中，还包括位于试剂室与检测区域之间的阀，其中处于打开位置的阀允许流体穿过其中从试剂室到达检测区域。在一些实施方案中，检测区域位于横向流动测定条上，该横向流动测定条位于壳体内。在一些实施方案中，装置还包括位于横向流动测定条上并且位于试剂室与检测区域之间的样品垫。在一些实施方案中，装置还包括位于试剂室与检测区域之间的扩增室。在一些实施方案中，可编程核酸酶还包含cas13酶或cas14酶。在一些实施方案中，指导核酸包含与靶核酸或其部分反向互补的至少10个核苷酸。在一些实施方案中，还包括横向流动测定条，该横向流动测定条包括检测区域。在一些实施方案中，装置还包含扩增试剂。在一些实施方案中，扩增试剂位于试剂室内。在一些实施方案中，扩增试剂是lamp试剂。在一些实施方案中，横向流动测定条还包括样品垫。在一些实施方案中，样品垫是试剂室。在一些实施方案中，横向流动测定条包含流动捕获探针。在一些实施方案中，流动捕获探针是抗生物素官能化金纳米颗粒。在一些实施方案中，横向流动测定条还包括缀合垫，其中样品垫与缀合垫流体连通。在一些实施方案中，样品垫位于缀合垫与检测区域之间。在一些实施方案中，缀合垫包含流动捕获探针。在一些实施方案中，流动捕获探针包含抗体。在一些实施方案中，样品垫和/或缀合垫与检测区域流体连通。在一些实施方案中，横向流动测定条还包括吸收垫。在一些实施方案中，样品垫、缀合垫和/或检测区域与吸收垫流体连通。在一些实施方案中，吸收垫被构造成通过毛细管作用抽吸样品穿过横向流动测定条，其中样品包含靶核酸。在一些实施方案中，通过外部压力驱动样品通过横向流动测定条，其中样品包含靶核酸。在一些实施方案中，外部压力由与横向流动测定条流体连通的泵施加。在一些实施方案中，泵是手动驱动的注射器或自动注射泵。在一些实施方案中，固定捕获探针包含抗体。在一些实施方案中，抗体选自由核酸捕获序列、抗fitc、抗dig、抗tamra、抗cy5和抗af594组成的组。在一些实施方案中，检测部分包含化学官能团。在一些实施方案中，化学官能团是生物素。在一些实施方案中，检测部分包含标记物。在一些实施方案中，标记物选自由与核酸捕获序列互补的核酸序列、fitc、dig、tamra、cy5
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组成的组。在一些实施方案中，可编程核酸酶探针还包含cas酶。在一些实施方案中，cas酶选自由cas12、cas 13、cas 14和casphi组成的组。在一些实施方案中，装置还包含多种可编程核酸酶和多种不同的指导核酸，其中所述多种可编程核酸酶中的每种可编程核酸酶包含所述多种不同的指导核酸中的指导核酸。在一些实施方案中，每种指导核酸与对应的靶核酸互补。在一些实施方案中，装置还包含多种报告物。在一些实施方案中，装置还包含多种标记物，其中所述多种报告物中的每种报告物包含检测
部分和所述多种标记物中的标记物。在一些实施方案中，装置还包含多种不同的固定捕获探针，其中所述多种标记物中的每种标记物与所述多种不同的固定捕获探针中的对应固定捕获探针互补。在一些实施方案中，外壳包括样品入口、试剂室和横向流动条。在一些实施方案中，装置还包括位于试剂室与检测区域之间的扩增室。在一些实施方案中，信号是视觉信号。在一些实施方案中，检测区域包括一个或多个检测点。在一些实施方案中，所述一个或多个检测点中的每个检测点包含多个固定捕获探针中的对应固定捕获探针。在一些实施方案中，检测点选自由线、圆形、椭圆形、矩形、三角形和加号组成的形状组。在一些实施方案中，试剂室包括表面。在一些实施方案中，可编程核酸酶和/或报告物被固定到表面上。在一些实施方案中，可编程核酸酶和/或报告物通过共价力、非共价力或静电力固定到表面上。在一些实施方案中，可编程核酸酶探针和/或报告物通过接头固定到表面上。在一些实施方案中，可编程核酸酶的cas酶通过接头固定到试剂室的表面上。在一些实施方案中，接头连接到可编程核酸酶的指导核酸。在一些实施方案中，包括对照点。在一些实施方案中，检测点位于试剂室与对照点之间。在一些实施方案中，对照点位于试剂室与检测点之间。在一些实施方案中，可检测信号是视觉可检测的信号。在一些实施方案中，可编程核酸酶被构造成以顺式切割构型或反式切割构型切割可切割核酸。在一些实施方案中，装置还包含多种可编程核酸酶探针，其中所述多种可编程核酸酶探针中的每种可编程核酸酶探针与靶核酸的多个对应区段互补。在一些实施方案中，靶核酸的每个对应区段是非重叠的、部分重叠的或完全重叠的。
19.本文描述了一种用于检测靶核酸的方法，该方法包括以下步骤：提供装置，该装置包括：试剂室，该试剂室包含：设置在试剂室内的可编程核酸酶，该可编程核酸酶包含与靶核酸或其部分互补的指导核酸，其中可编程核酸酶被构造成通过指导核酸与靶核酸的结合而被激活，以及报告分子，该报告分子包含可切割核酸和检测部分，其中可切割核酸被所激活的可编程核酸酶切割从可切割核酸释放检测部分；与试剂室流体连通的检测区域，其中检测区域包含固定捕获探针以捕获所释放的检测部分，其中检测部分的释放在对应于固定捕获探针的位置处直接地或间接地产生可检测信号，壳体，该壳体包括试剂室和检测区域，将样品引入试剂室中，从而使检测部分能够经由核酸的切割而释放以产生检测部分溶液；使所述检测部分溶液与所述检测区域接触；以及经由在对应于固定捕获探针的位置处产生的可检测信号来鉴定样品中靶核酸的存在。如权利要求1所述的系统，其中所述指导核酸包含与所述靶核酸或其部分反向互补的至少10个核苷酸。在一些实施方案中，方法还包括横向流动测定条，该横向流动测定条包括检测区域。在一些实施方案中，方法还包括扩增试剂。在一些实施方案中，扩增试剂位于试剂室内。在一些实施方案中，扩增试剂是lamp试剂。在一些实施方案中，横向流动测定条还包括样品垫。在一些实施方案中，样品垫是试剂室。在一些实施方案中，横向流动测定条包含流动捕获探针。在一些实施方案中，流动捕获探针是抗生物素官能化金纳米颗粒。在一些实施方案中，横向流动测定条还包括缀合垫，其中样品垫与缀合垫流体连通。在一些实施方案中，样品垫位于缀合垫与检测区域之间。在一些实施方案中，缀合垫包含流动捕获探针。在一些实施方案中，流动捕获探针包含抗体。在一些实施方案中，样品垫和/或缀合垫与检测区域流体连通。在一些实施方案中，横向流动测定条还包括吸收垫。在一些实施方案中，样品垫、缀合垫和/或检测区域与吸收垫流体连通。在一些实施方案中，吸收垫被构造成通过毛细管作用抽吸样品穿过横向流动测定条，其中样
品包含靶核酸。在一些实施方案中，通过外部压力驱动样品通过横向流动测定条，其中样品包含靶核酸。在一些实施方案中，外部压力由与横向流动测定条流体连通的泵施加。在一些实施方案中，泵是手动驱动的注射器或自动注射泵。在一些实施方案中，固定捕获探针包含抗体。在一些实施方案中，抗体选自由核酸捕获序列、抗fitc、抗dig、抗tamra、抗cy5和抗af594组成的组。在一些实施方案中，检测部分包含化学官能团。在一些实施方案中，化学官能团是生物素。在一些实施方案中，检测部分包含标记物。在一些实施方案中，标记物选自由与核酸捕获序列互补的核酸序列、fitc、dig、tamra、cy5
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组成的组。在一些实施方案中，可编程核酸酶探针还包含cas酶。在一些实施方案中，cas酶选自由cas 12、cas 13、cas 14和casphi组成的组。在一些实施方案中，方法还包括多种可编程核酸酶和多种不同的指导核酸，其中所述多种可编程核酸酶中的每种可编程核酸酶包含所述多种不同的指导核酸中的指导核酸。在一些实施方案中，每种指导核酸与对应的靶核酸互补。在一些实施方案中，方法还包括多种报告物。在一些实施方案中，方法还包括多种标记物，其中所述多种报告物中的每种报告物包含检测部分和所述多种标记物中的标记物。在一些实施方案中，方法还包括多种不同的固定捕获探针，其中所述多种标记物中的每种标记物与所述多种不同的固定捕获探针中的对应固定捕获探针互补在一些实施方案中，外壳包括样品入口、试剂室和横向流动条。在一些实施方案中，方法还包括位于试剂室与检测区域之间的扩增室。在一些实施方案中，信号是视觉信号。在一些实施方案中，检测区域包括一个或多个检测点。在一些实施方案中，所述一个或多个检测点中的每个检测点包含多个固定捕获探针中的对应固定捕获探针。在一些实施方案中，检测点选自由线、圆形、椭圆形、矩形、三角形和加号组成的形状组。在一些实施方案中，试剂室包括表面。在一些实施方案中，可编程核酸酶和/或报告物被固定到表面上。在一些实施方案中，可编程核酸酶和/或报告物通过共价力、非共价力或静电力固定到表面上。在一些实施方案中，可编程核酸酶探针和/或报告物通过接头固定到表面上。在一些实施方案中，可编程核酸酶的cas酶通过接头固定到试剂室的表面上。在一些实施方案中，接头连接到可编程核酸酶的指导核酸。在一些实施方案中，方法还包括对照点。在一些实施方案中，检测点位于试剂室与对照点之间。在一些实施方案中，对照点位于试剂室与检测点之间。在一些实施方案中，可检测信号是视觉可检测的信号。在一些实施方案中，可编程核酸酶被构造成以顺式切割构型或反式切割构型切割可切割核酸。在一些实施方案中，方法还包括多种可编程核酸酶探针，其中所述多种可编程核酸酶探针中的每种可编程核酸酶探针与靶核酸的多个对应区段互补。在一些实施方案中，靶核酸的每个对应区段是非重叠的、部分重叠的或完全重叠的。
20.以引用的方式并入
21.本说明书中提及的所有公布、专利和专利申请以引用的方式并入本文，就如每个单独的公布、专利或专利申请被具体地和单独地指出以引用的方式并入的程度一样。
附图说明
22.在所附权利要求中具体阐述了本发明的新颖特征。通过参考以下阐述说明性实施方案的详细描述和附图将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在这些说明性实施方案中利用了本发明的原理，在附图中：
23.图1示出了本公开的简化横向流动装置的工作流程，包括样品制备、任选的靶核酸
扩增、用可编程核酸酶、指导核酸和报告物进行的基于crispr的检测、以及定性结果。所有所述方法可在本文所公开的单个简化横向流动装置中进行。
24.图2示出了本公开的简化横向流动装置的示例。
25.图3示出了本公开的样品制备装置的各个部件。
26.图4示出了使用样品处理装置的样品工作流程。
27.图5示出了具有典型报告物的milenia商业条的布局。
28.图6示出了具有扩增子的milenia hybriddetect 1条的布局。
29.图7示出了具有标准cas报告物的milenia hybriddetect 1条的布局。
30.图8示出了经修饰的cas报告物，其包含与fam分子(804)结合的生物素-dt(808)的dna接头。
31.图9示出了具有如图8所述的经修饰的cas报告物的milenia hybriddetect条的布局。
32.图10示出了单个靶标测定形式(左侧)和多路复用测定形式(右侧)的示例。
33.图11示出了使用前的测定(上图)、具有阳性结果的测定(中间左图)、具有阴性结果的测定(中间右图)和失败测试(下图)的另一变型。
34.图12示出了栓系横向流动cas报告物的一种设计。
35.图13示出了使用利用磁珠的栓系报告物的crispr诊断的工作流程。
36.图14示出了在到达反应室之前通过链霉抗生物素蛋白-生物素过滤的酶-报告系统的示意图。
37.图15示出了用于在即时需求crispr装置上进行样品制备的样品输入模块的示意图。
38.图16示出了即时需求crispr装置上的扩增和detectr
tm
通道的示意图。
39.图17示出了即时需求crispr装置上的工艺流程的详细步骤。
40.图18示出了装置的工作流程。在步骤1中，将包含管a(核酸扩增反应)和b(crispr酶试剂)的反应盒插入包括穿刺和混合室、横向流动盒和横向流动芯的装置中。在步骤2中，关闭并锁定装置。这使反应盒向下移动并从穿刺和混合室移动到突起部上。在步骤3中，管a和b的内容物在被刺穿后混合在一起。混合的试剂流到装置的底部，在此它们被芯吸到横向流动盒中。
41.图19示出了使用现有ustar横向流动盒硬件的示例性装置形式。(a)用crispr酶试剂替换追踪缓冲液球(管b)的内容物，并将rt-lamp核酸扩增反应用于(管a)。(b)关闭的反应盒靠近ustar横向流动装置。(c)当装置关闭时管a和管b被刺穿之前的反应盒的侧视图。(d)装置运行后横向流动的示例性读出。
42.图20示出了使用旋通测定形式的crispr诊断的工作流程。整个过程是密封的，并且不需要打开扩增管，这降低了污染的可能性。
43.图21示出了即时需求(pon)5重呼吸面板的测定设计。
44.图22示出了根据一个实施方案的pon一次性装置。
45.图23示出了如本文所述的多路复用横向流动条的实施方案。
46.图24示出了具有如本文所述的多路复用“热点”的工作流程的实施方案。
47.图25示出了如本文所述的hrp纸基检测的实施方案。
48.图26示出了如本文所述的基于hrp的多路复用横向流动测定的实施方案。
49.图27示出了如本文所述的基于hrp的多路复用横向流动测定的多路复用cas13固定方法的实施方案。
50.图28示出了基于dna酶和detectr
tm
的测定的结果，两次重复运行相隔一周。
51.图29示出了如本文所述的多种cas-复合物探针指导池化以为横向流动测定增强信号检测的用途。
52.图30描绘了detectr
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测定的结果，其显示与使用单独grna形式的基于detectr
tm
cas12a的测定相比，使用池化指导(池化grna)形式的基于cas12a的gf184靶标的检测增强。
53.图31描绘了detectr
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测定的结果，其显示与使用单独指导形式的基于cas13a的测定相比，使用池化指导形式的基于cas13a的sc2靶标检测的灵敏度提高。
54.图32示出了对应于用于计数阳性液滴的数量的每个室的图像，其显示与含有单独形式的指导rna的cas13a-detectr
tm
测定样品相比，含有池化的指导rna的cas13a-detectr
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测定样品在每个起始靶rna拷贝中产生更多的含有扩增产物的晶体。
55.图33示出了扩增后信号强度的测量显示，与含有单独形式的指导rna的cas13a-detectr
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测定样品相比，含有池化的指导rna的cas13a-detectr
tm
测定样品在每个起始靶模板rna拷贝中产生更多的信号强度。
56.图34示出了扩增后信号强度的测量显示，与含有单独形式的指导rna的cas13a-detectr
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测定样品相比，含有池化的指导rna的cas13a-detectr
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测定样品在每个起始靶模板rna拷贝中产生更多的信号强度。图34还示出了通过计数阳性液滴的数量进行的相对定量显示，与含有单独形式的指导rna的cas13a-detectr
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测定样品相比，含有池化的指导rna的cas13a-detectr
tm
测定样品在每个起始靶模板rna拷贝中产生更多的含有扩增产物的晶体。
57.图35示出了与含有单独形式的单个指导物r4684、r4667或r4785(rnasep指导物)的cas13a detectr
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样品相比，含有池化的指导物(r4637、r4638、r4667、r4676、r4684、r4689、r4691)的cas13a detectr
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测定样品在每个起始靶标拷贝中没有表现出更高的靶标检测灵敏度。
具体实施方式
58.本公开提供了用于快速实验室测试的各种简化横向流动装置，其可通过使用可编程核酸酶快速评估样品中是否存在靶核酸，所述可编程核酸酶可与装置的官能化表面相互作用以产生可检测信号。
59.本公开提供了用于分析包含待检测的感兴趣核酸的样品的简化横向流动装置。该装置可被构造成进行样品制备。该装置可被构造成任选地进行靶核酸序列的扩增。该装置可被构造成确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列。该装置可被构造成接收样品，进行样品制备，扩增靶核酸序列，并且确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列。该装置可被构造成接收样品，进行样品制备，并且确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列。
60.有利地，该装置可被构造成使样品的污染最小化。在一些情况下，该装置被构造成接收或摄取样品。样品摄取可通过将含有样品的拭子插入装置中来实现。该装置可被构造
成使得拭子一旦插入就不能被移除。这可以防止样品的回流或泄漏以及随后的交叉污染。
61.本文所公开的横向流动测定和试剂可用作本文所公开的任何疾病的伴随诊断，或者可用于试剂盒、即时护理诊断或非处方药诊断。该系统可作为即时护理诊断或实验室测试用于检测靶核酸，从而检测从中采集样品的受试者的状况。该系统可用于各种场所或地点，诸如实验室、医院、医生办公室/实验室(pol)、诊所、远程场所或家中。有时，本公开提供了用于消费者基因用途或非处方用途的各种简化横向流动装置。
62.本文描述了用于检测样品中靶核酸的存在的横向流动装置和方法。用于检测样品中靶核酸的存在的装置和方法可用于快速实验室测试中以检测感兴趣的靶核酸。具体地，本文提供了横向流动装置，其中快速实验室测试可以在简化的单个系统中进行。靶核酸可以是来自病毒或细菌或导致样品中的疾病的其他因子的核酸的一部分。靶核酸可以是来自样品中任何生物体的rna或dna的一部分。在一些实施方案中，本文所公开的可编程核酸酶被rna或dna激活以引发rna报告物的反式切割活性。在一些情况下，本文所公开的可编程核酸酶与靶rna结合以引发rna报告物的反式切割。在一些情况下，本文所公开的可编程核酸酶与靶dna结合以引发rna报告物的反式切割。在一些实施方案中，cas13与靶ssdna结合以引发rna检测核酸的反式切割。在一些实施方案中，cas14与靶dsdna或ssdna结合以引发dna检测核酸的切割。在一些实施方案中，dna检测核酸被称为报告物的可切割核酸。
63.样品中靶核酸的检测可指示样品中疾病的存在，并且可提供采取行动以减少疾病向受疾病影响的环境中或携带疾病的个体附近的个体传播的信息。样品中靶核酸的检测可指示疾病突变的存在，诸如为一种或多种致病菌提供抗生素抗性的单核苷酸多态性(snp)。
64.可编程核酸酶促进靶核酸的检测。可编程核酸酶可在指导核酸与靶核酸结合后被激活，其中激活的可编程核酸酶可切割靶核酸并且可具有反式切割活性，其也可称为“侧接”或“反式侧接”切割。反式切割活性可以是激活的可编程核酸酶对附近单链核酸的非特异性切割，诸如具有检测部分的报告物的反式切割。一旦报告物被激活的可编程核酸酶切割，检测部分就从报告物释放并产生固定在支持介质上的可检测信号。检测部分通常是荧光团、染料、多肽或核酸中的至少一种。有时检测部分与待固定的支持介质上的捕获分子结合。可检测信号可在支持介质上显现，以评估与病症或状态诸如疾病相关的靶核酸的存在或水平。可编程核酸酶可以是具有反式切割活性的crispr-cas(成簇的规则间隔的短回文重复-crispr相关的)核蛋白复合物，其可以通过指导核酸与靶核酸的结合来激活。
65.可以测试来自个体的生物样品或环境样品以确定个体是否患有传染病。来自导致所检测的疾病的病原体的至少一种靶核酸还可指示该病原体是野生型的或包含赋予对治疗诸如抗生素治疗的抗性的突变。将来自个体或来自环境的样品应用于本文所述的试剂。样品与试剂之间的反应可以在试剂盒中提供的试剂室中或在试剂盒中提供的支持介质上进行。如果样品中存在靶核酸，则靶核酸与指导核酸结合以激活可编程核酸酶。激活的可编程核酸酶切割报告物并产生可在支持介质上显现的可检测信号。如果靶核酸在样品中不存在或低于检测阈值，则指导核酸保持未结合，可编程核酸酶保持失活，而报告物保持未切割。
66.如果样品对靶核酸呈阳性，也可以显现可检测信号的测试标记。检测区域中的结果可通过眼睛或使用移动装置来可视化。在一些情况下，个人可使用移动装置的相机和移动应用程序的图形用户界面(gui)打开移动应用程序以读取具有相机的移动装置上的测试
结果，并拍摄支持介质的图像，包括壳体上的检测区域、条形码、参考色标和基准标记。移动应用程序可识别测试，可视化图像中的检测区域，并且/或者分析以确定导致疾病的靶核酸的存在或不存在或水平。在一些实施方案中，移动应用程序可与远程装置通信(例如，经由基于云的加密通信系统)，以将图像传送到远程医师或基于云的分析工具以分析靶核酸的存在、不存在或水平。移动应用程序可以将测试的结果呈现给个人，将测试结果存储在移动应用程序中，或者与远程装置通信并传送测试结果的数据。
67.本文所述的此类简化横向流动装置可允许在偏远地区或资源匮乏的环境中检测靶核酸，进而检测与靶核酸相关的病毒感染，而无需专门的设备。此外，本文所述的此类简化横向流动装置和方法可允许在保健诊所或医生办公室中检测靶核酸，进而检测与靶核酸相关的病原体和疾病，而无需专门的设备。在一些情况下，这为用户提供了即时护理测试，以轻松地在家中或在医疗保健提供者的办公室中快速地测试疾病或感染。由于多种原因，在一小时内，例如在15至60分钟内提供结果的测定对于在家测试是特别理想的。当在前48小时内施用时，抗病毒剂可以是最有效的，因此可能需要快速且准确的结果以改善抗病毒剂的功效。类似地，在家快速测试可通过减少不必要的抗生素使用(例如，在诊断测试指示病毒感染而不是细菌感染的情况下)并且/或者确保患者在服用抗生素的整个疗程中的顺应性，甚至在症状解决之后，来改善抗生素管理。因此，本文所公开的能够在一小时内提供结果的简化横向流动装置可允许在最佳时间提供抗病毒疗法。另外，本文提供的能够提供快速诊断和结果的简化横向流动装置可以帮助将患者留在或送到家中，改进全面的疾病监测，并且/或者防止感染传播。在其他情况下，这提供了一种测试，其可以在实验室中用于检测来自受试者的样品中的感兴趣的核酸。具体地，本文提供了简化横向流动装置，其中快速实验室测试可以在单个系统中进行。在一些情况下，这对于检测发展中国家的疾病以及作为全球医疗保健工具来检测疾病的传播或治疗效果或提供病毒感染的早期检测可能很有价值。
68.用于检测靶核酸的简化横向流动装置
69.本公开提供了一种用于检测靶核酸的简化横向流动装置。装置的示意图示于图2中。由简化横向流动装置进行的工作流程示于图1中。该装置可被构造成确定来自样品的核酸是否包含多种靶核酸序列中的一种或多种。任选地，该装置可被构造成扩增多种靶核酸序列中的一种或多种。简化横向流动装置执行包括从装置上的样品中纯化核酸的样品制备步骤。样品制备可包括去除不是核酸的物质(例如，脂质、多肽)。样品制备可包括核酸片段化。样品制备可包括细胞裂解。裂解可包括化学裂解。裂解可包括物理裂解。裂解可包括渗透裂解。裂解也可通过将样品暴露于热来进行。
70.简化横向流动装置选择性地执行装置上的扩增。扩增可包括等温扩增。等温扩增可以是环介导等温扩增(lamp)。等温扩增可以在62℃下进行。等温扩增可进行至少2分钟。等温扩增可进行不超过5分钟。扩增反应的温度和检测反应的时间可以在本文所公开的简化横向流动装置内控制或调节。
71.简化横向流动装置可执行装置上的检测。检测可包括确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列，并且可包括检测靶核酸序列。检测可包括使用可编程核酸酶(例如，本文所公开的任何cas蛋白)。检测可包括使用指导核酸。在一些情况下，检测可包括使用报告物。检测可包括detectr
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反应。检测可包括在简化横向流动装置内使用横向流动条。横向流动
条的区域可被构造成当来自样品的核酸包含靶核酸序列时改变颜色。
72.使用本文所公开的简化横向流动装置确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少5000个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少10至50个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少50至100个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少100至150个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少150至200个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少200至250个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少250至300个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少300至350个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少350至400个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少400至450个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少450至500个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少500至550个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少550至600个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少600至650个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少650至700个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少700至750个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少750至800个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少800至850个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少850至900个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少900至950个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少950至1000个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少1000至1500个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少1500至2000个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少2000至2500个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少2500至3000个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少3000至3500个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少3500至4000个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少4000至4500个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少4500至5000个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少50至200个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少50至2000个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少1000至3000个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在至少2000至5000个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在
不超过5000个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在不超过4500个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在不超过4000个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在不超过3500个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在不超过3000个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在不超过2500个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在不超过2000个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在不超过1500个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在不超过1000个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在不超过500个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在不超过100个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在不超过50个拷贝的靶核酸序列。确定来自样品的核酸是否包含靶核酸序列可能需要样品中存在不超过10个拷贝的靶核酸序列。
73.与本文所公开的简化横向流动装置一致的样品可包括生物样品、环境样品和/或农业样品等。样品可包括血浆、唾液、组织、细胞、细胞裂解物、蛋白质、病毒、脂质、代谢物或它们的任何组合。生物样品可包含细胞。样品可包含多种核酸。
74.与本文所公开的简化横向流动装置一致的装置包括单次使用的装置。在一些方面，该装置是电池供电的或以其他方式供电的(例如，经由电插座)。在一些方面中，该装置不需要电池电力。在一些方面，该装置包括化学加热元件。在一些方面，化学加热元件包含氧化镁或铁丸，其允许自由电的横向流动装置。
75.此外，本文所公开的简化横向流动装置可进行“一锅”或“两锅”反应。在一锅反应中，a)样品制备、扩增和检测，b)样品制备和检测，或者c)扩增和检测在装置内的相同区域中进行。在两锅反应中，扩增和检测在装置内的单独区域中进行。在两锅反应中，样品制备、扩增和检测或它们的组合在装置内的单独区域中进行。
76.本文公开了用于检测生物样品中感兴趣的靶核酸的横向流动装置。本文详细描述的横向流动装置可用于监测样品中靶核酸与可编程核酸酶的反应，从而允许检测所述靶核酸。本文所公开的所有样品和试剂与本文所公开的横向流动装置相容。任何可编程核酸酶诸如本文所述的任何cas核酸酶与下文公开的横向流动装置相容。本文所公开的支持介质和壳体也适合与本文所公开的横向流动装置结合使用。如本公开通篇所述，多路复用检测可在本文所公开的横向流动装置内进行。本文所公开的用于检测和可视化的组合物和方法也适于在本文所述的横向流动装置内使用。
77.在本文所述的横向流动装置中，可监测任何可编程核酸酶(例如，crispr-cas)反应。例如，本文所公开的任何可编程核酸酶可用于切割报告物以产生检测信号。在一些情况下，可编程核酸酶是cas13。有时cas13是cas13a、cas13b、cas13c、cas13d或cas13e。在一些情况下，可编程核酸酶是mad7或mad2。在一些情况下，可编程核酸酶是cas12。有时cas12是cas12a、cas12b、cas12c、cas12d或cas12e。在一些情况下，可编程核酸酶是csm1、cas9、c2c4、c2c8、c2c5、c2c10、c2c9或casz。有时，csm1称为smcms1、micms1、obcms1或sucms1。有时cas13a也称为c2c2。有时casz也称为cas14a、cas14b、cas14c、cas14d、cas14e、cas14f、
cas14g或cas14h。有时，可编程核酸酶是v型crispr-cas系统。在一些情况下，可编程核酸酶是vi型crispr-cas系统。有时，可编程核酸酶是iii型crispr-cas系统。在一些情况下，可编程核酸酶来自以下中的至少一种：沙氏纤毛菌(leptotrichia shahii，lsh)、斯氏李斯特氏菌(listeria seeligeri，lse)、口腔纤毛菌(leptotrichia buccalis，lbu)、瓦氏纤毛菌(leptotrichia wadeu，lwa)、荚膜红细菌(rhodobacter capsulatus，rca)、解半纤植雪菌(herbinix hemicellulosilytica，hhe)、产丙酸栖沼泽杆菌(paludibacter propionicigenes，ppr)、毛螺菌科细菌(lachnospiraceae bacterium，lba)、直肠[真杆菌]([eubacterium]rectale，ere)、纽克利斯李斯特氏菌(listeria newyorkensis，lny)、嗜氨梭状芽胞杆菌(clostridium aminophilum，cam)、普雷沃氏菌属(prevotella sp.，psm)，咬嗜二氧化碳噬细胞菌(capnocytophaga canimorsus，cca)、毛螺菌科细菌(lachnospiraceae bacterium，lba)、动物溃疡伯杰氏菌(bergeyella zoohelcum，bzo)、中间普雷沃氏菌(prevotella intermedia，pin)、颊普雷沃氏菌(prevotella buccae，pbu)、另枝菌属(alistipes sp.，asp)、鸭疫里默氏杆菌(riemerella anatipestifer，ran)、橙黄普雷沃氏菌(prevotella aurantiaca，pau)、解糖普雷沃氏菌(prevotella saccharolytica，psa)、中间普雷沃氏菌(prevotella intermedia，pin2)、犬咬嗜二氧化碳噬细胞菌(capnocytophaga canimorsus，cca)、咽喉卟啉单胞菌(porphyromonas gulae，pgu)、普雷沃氏菌属(prevotella sp.，psp)、牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis，pig)、中间普雷沃氏菌(prevotella intermedia，pin3)、意大利肠球菌(enterococcus italicus，ei)、唾液乳杆菌(lactobacillus salivarius，ls)或嗜热栖热菌(thermus thermophilus，tt)。有时cas13是lbucas13a、lwacas13a、lbacas13a、hhecas13a、pprcas13a、erecas13a、camcas13a或lshcas13a中的至少一种。
[0078]
本文所公开的横向流动装置与一锅反应和两锅反应相容。在一锅反应中，扩增、逆转录、扩增和逆转录或扩增和体外转录以及检测可以在横向流动装置中同时进行。换句话说，在一锅反应中，逆转录、扩增和体外转录的任何组合可以在与检测相同的反应中进行。在两锅反应中，逆转录、扩增和体外转录的任何组合可以在第一反应中进行，然后在第二反应中检测。一锅反应或两锅反应可以在本文所公开的横向流动装置中进行。
[0079]
本文所公开的横向流动装置可包括过滤装置。在一些实施方案中，横向流动装置位于装置的外壳内。在一些实施方案中，外壳包括被构造成在裂解步骤之后过滤样品的过滤装置。在一些实施方案中，用于样品制备的过滤装置类似于注射器，或者包括与注射器类似的功能元件，例如，如图3和图4所示。例如，用于样品制备的过滤装置可包括用于收集液体样品的窄尖端。液体样品可包括血液、唾液、尿液或任何其他生物流体。液体样品还可包括液体组织匀浆。用于收集液体样品的尖端可以由玻璃、金属、塑料或其他生物相容性材料制成。尖端可以用玻璃毛细管代替，该玻璃毛细管可充当计量装置，用于计量添加到横向流动装置下游的生物样品的量。对于一些样品，例如血液，毛细管可以是样品制备所需的唯一流体装置。用于样品制备的过滤装置的另一个功能元件可包括可以承载从nl到ml数量级的体积的通道，该通道含有与该过程下游的可编程核酸酶反应相容的裂解缓冲液。通道可以由金属、塑料或其他生物相容性材料制成。通道可以足够大以容纳整个粪便、口腔或其他生物样品采集拭子。过滤装置还可包含试剂溶液，该溶液将裂解每种类型样品中的细胞并释放核酸，使得可编程核酸酶可接近它们。溶液的活性成分可以是离液剂、洗涤剂、盐，并且可
具有高渗透压、离子强度和/或ph。在一些实施方案中，ph值低。离液剂或促溶剂是破坏大分子诸如蛋白质、dna或rna中三维结构的物质。碱性缓冲液也可用于具有硬壳的细胞，特别是用于环境样品。洗涤剂诸如十二烷基硫酸钠(sds)和十六烷基三甲基溴化铵(ctab)也可用于化学裂解缓冲液。作为前面提到的化学诱导的细胞裂解的补充或替代，还可以通过物理、机械、热或酶的方式进行细胞裂解。根据样品的类型，基于注射器的装置可包括更复杂的结构，诸如纳米级倒钩、纳米线、在该装置的单独室中的超声处理能力、集成激光器、集成加热器，例如珀尔帖型加热器，或薄膜平面加热器，和/或用于电裂解的微毛细管探针。本文所述的任何样品可用于该工作流程中。例如，样品可包括从被测试感兴趣病症的受试者收集的液体样品。
[0080]
在一些实施方案中，横向流动条可以另外与样品制备装置连接，如图3所示。图3示出了本公开中的一些实施方案的样品制备装置的各个部件。图3a示出了单室样品提取装置，其具有(a)插入件，该插入件保持样品收集装置并调节样品提取与将样品分配到另一反应或检测装置之间的步骤，(b)单个室，该单个室包含提取缓冲液。图3b示出了其中分配室填充有在分配核酸时进一步纯化核酸的材料的实施方案，其中：(a)插入件保持样品收集装置并调节样品提取和核酸扩增的“阶段”。每组凹口(红色、蓝色和绿色)与前一组偏移90
°
，(b)反应模块包括由允许发生独立反应的底物隔开的多个室。(例如，i.核酸分离室，ii.核酸扩增室，以及iii.detectr反应室或分配室)。每个室具有凹口(黑色)，这些凹口防止插入件在没有刻意转动90
°
的情况下进入下一个室。前两个室可以由在提取与扩增反应之间除去抑制剂的材料隔开。图3c示出了反应/分配室的另外的实施方案，其具有：(a)单个分配室可以仅释放提取的样品或提取/扩增或提取/扩增/detectr反应，(b)双分配室可以释放提取/多重扩增产物，以及(c)四重分配室将允许多重扩增和单个detectr或四个单扩增反应。在一些实施方案中，基于注射器的样品制备装置被设置成仅用一个横向流动测定条读出，如图3a、图3b和图3c(a)所示。在一些实施方案中，基于注射器的样品制备装置被设置成用多于一个横向流动测定条读出，如图3c(b)和图3c(c)所示。在此类实施方案中，通过允许每个样品读出多于一种靶核酸来实现样品多路复用，其中每个不同的横向流动测定条可以检测对应不同的一种靶核酸，如本文所述。在一些实施方案中，如本文所述，可以在单个横向流动测定条上检测多于一种靶核酸。
[0081]
图4示出了使用如本文所述的样品处理装置的样品工作流程。样品收集装置连接到样品处理装置(a)的插入部分。将插入件放入装置室中并按压，直到第一次停止(顶部上的下凸片与底部上的上凸片相遇)(b)。该步骤允许样品与核酸提取试剂接触。在适当的时间量之后，将插入件转动90
°
(c)并且按压(d)到下一组凹口。这些动作将样品转移到扩增室中。样品收集装置不再与样品或扩增产物接触。在适当的孵育之后，将插入件旋转90
°
(e)并且按压(f)到下一组凹口。这些措施将样品释放到detectr(绿色反应)中。将插入件再次转动90
°
(g)并按压(h)以分配反应。
[0082]
本文描述了用于横向流动测定条上的detectr
tm
测定以进行读出的各种方法、装置和系统。在一些实施方案中，在横向流动测定条上读出detectr
tm
测定，如图5所示。图5示出了具有典型报告物的milenia
tm
市售条的布局。该示意图示出了不依赖于分析物的通用检棒，其在右侧具有样品施加区域，紧接着往左是芯吸区域，再往左是包含生物素配体的区域，再往左是用抗兔抗体点样的区域。将样品和分析物特异性溶液与带有生物素或fitc的
分析物检测物一起孵育。在条上运行样品。阳性结果显示两个条带，最左边的条带来自对照条带并且是由于抗fitc抗体包被的金纳米颗粒与抗兔抗体的结合。右边的条带来自测试条带本身并且是由于生物素配体与带有生物素的分析物检测物的结合，其中检测物与分析物复合，并且其中分析物进一步与另一个带有fitc的检测物复合，然后fitc与抗fitc抗体包被的金颗粒结合。在阴性结果中，在对照线处仅看到一个条带。在此类实施方案中，工作流程包括四个步骤：(1)将样品施加到横向流动测定条上；(2)添加样品和分析物特异性溶液；(3)孵育；以及(4)读出结果。
[0083]
图6示出了具有pcr扩增子(606)的milenia hybriddetect 1条的布局，包括使用fam和生物素引物(604,608)。该示意图在上图右端示出了使用fam和生物素引物的pcr扩增子。就阳性结果而言，条显示两个条带，该pcr扩增子与固定在测试线处的部分结合，并且fam分子(显示为起点)与抗fam抗体包被的颗粒结合。测试线的左侧是流动对照线，其含有与抗fam抗体包被的纳米颗粒结合的抗兔抗体。就阴性结果而言，条显示一个条带，即，仅结合抗fam抗体包被的纳米颗粒，所述纳米颗粒与固定在测试条上的抗兔抗体结合。显示了示出阳性结果化学反应(602)和阴性结果化学反应(603)的milenia hybriddetect 1条带。当样品含有包含fam(604)和生物素(608)的pcr扩增子(606)时，出现阳性结果。放置在样品垫(618)上的样品被朝向测试线(601)和流动对照线抽吸。位于测试线(601)上的充当捕获探针的链霉抗生物素蛋白(614)捕获pcr扩增子(606)的生物素(608)端，所述pcr扩增子继而被也称为缀合物颗粒的流动捕获探针(610)捕获，该流动捕获探针包含金纳米颗粒和抗fam抗体。未捕获pcr扩增子(606)的任何流动捕获探针(610)被进一步沿横向流动测定条向下抽吸，然后在流动对照线处被抗兔抗体(616)捕获。当存在的pcr扩增子不足以产生可见信号时，出现阴性结果。当样品未包含足够的pcr扩增子(606)时，即使生物素(608)和fam(604)也不会在测试线处出现可见信号。这是因为恰好位于样品垫下游的流动捕获探针(610)没有任何生物素标记的pcr产物与生物素结合，因此未被生物素官能化。这继而不允许流动捕获探针在测试线(601)处与链霉抗生物素蛋白(614)结合。在不存在金纳米颗粒的情况下，测试线不表现出颜色变化。
[0084]
在一些实施方案中，milenia hybriddetect 1strip
tm
与标准cas报告物一起使用，其中可切割核酸(706)位于fam(704)与生物素(708)之间，如图7所示。在顶部示出阳性结果，其中cas蛋白切割标准报告物，并且仅看到一个条带，这是由于抗fam抗体包被的纳米颗粒与点在条上的抗兔抗体的结合。在底部示出阴性结果，其中完整报告物与固定在条上的部分结合，并且所有抗fam抗体包被的纳米颗粒在对照线处与完整cas报告物上的fam分子结合。用靶核酸和用仅水对照运行样品的结果显示，即使用仅水对照，在测试线处也会出现假阳性条带。
[0085]
在一些实施方案中，本公开的装置包括如图9所示的室(906)和横向流动条(902)。图8至图9示出了横向流动条(902)和对应的合适报告物的特别有利的布局。图8示出了经修饰的cas报告物，其包含与fam分子(显示为绿星形)结合的生物素-dt(显示为粉红色六边形)的dna接头。整个经修饰的cas报告物与磁珠或反应室的表面缀合，该反应室位于条的上游。这在示意图中示出为经修饰的cas报告物固定到detectr室/珠的底物上。在被cas(显示为黄色吃豆人)切割期间，生物素-fam分子从dna接头释放。与其他测定形式不同，该特定测定形式包括反应室的整个cas切割反应。在该测定形式中，测试线是实际测试线，并且对照
线是真实对照线。图9示出了具有经修饰的cas酶和报告物的milenia hybriddetect条的布局。在上图中，示出了阳性结果，其中在cas反应室中，cas蛋白切割经修饰的cas报告物的dna接头区段。生物素-dt/fam分子被释放并沿测试条向下流动，从而与包被在测试线上的链霉抗生物素蛋白结合。抗fam抗体包被的金纳米颗粒在测试线处与生物素-dt/fam报告物结合。另外，抗fam抗体包被的金纳米颗粒与包被在流动对照线处的抗兔抗体结合。在下图中，示出了阴性结果，其中仅抗fam抗体包被的金纳米颗粒与包被在流动对照线处的抗兔抗体结合。这种特定的布局通过在阳性结果的情况下产生更高的信号来改善测试结果，同时也最大限度地减少假阳性。在该测定布局中，报告物包含连接在核酸的一端处的生物素和荧光团(例如，fam)。核酸可以直接与生物素分子缀合，然后与荧光团缀合，或者直接与荧光团缀合，然后与生物素缀合。可以使用其他亲和分子，包括本文所述的那些来代替生物素。本文所公开的任何荧光团也可用于报告物。报告物可以悬浮在溶液中或固定在cas室的表面上。替代地，报告物可以固定在反应室中的珠诸如磁珠上，其中它们通过放置在室下方的磁体保持在适当位置。当报告物被激活的可编程核酸酶切割时，切割的生物素-荧光团在包含链霉抗生物素蛋白(或另一种捕获分子)的第一线处积聚。用抗荧光团抗体包被位于样品垫上并使用追踪缓冲液流动到条上的金纳米颗粒，从而允许金纳米颗粒在第一线结合和积聚。纳米颗粒另外积聚在用针对包被在金纳米颗粒上的抗体(例如兔，抗fam)的抗体(例如，抗兔)包被的第二线上。就阴性结果而言，报告物不被切割并且不在横向流动条上流动。因此，纳米颗粒仅结合并积聚在第二线处。可通过具有两种报告物(例如，生物素-fam报告物和生物素-dig报告物)来进行横向流动条上的多路复用检测。抗fam和抗dig抗体包被在横向流动条的两个不同的区域上。抗生物素抗体或链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白包被在金纳米颗粒上。通过首先从报告物的核酸产生生物素-dntp，然后缀合荧光团，将荧光团直接与亲和分子(例如，生物素)缀合。在一些实施方案中，横向流动条包括多个层。在此类实施方案中，所述多个层包括样品垫层、检测层和芯吸层。
[0086]
在一些实施方案中，上述横向流动条可以另外与样品制备装置连接。
[0087]
在此描述了用于使用如本文所述的简化横向流动条进行多路复用detectr
tm
测定读出的各种方法。图10示出了单个靶测定形式的实施方案(左侧)和多路复用测定形式的实施方案(右侧)。顶行示出了使用前的横向流动测定条。中间行和底行分别示出了阳性结果和阴性结果。在一些实施方案中，横向流动测定条具有多于一个检测点、线或区。在图10的顶行左侧，示出了具有两条检测线的横向流动测定条，一条检测线用于靶标a，一条检测线用于靶标b。
[0088]
图11示出了使用前的detectr
tm
测定(上图)、具有阳性结果的测定(中间左图)、具有阴性结果的测定(中间右图)和失败测试(下图)的另一个实施方案。在一些实施方案中，样品垫包含抗生物素官能化金纳米颗粒，其中金纳米颗粒用抗生物素抗体标记。在一些实施方案中，横向流动测定条包括对照线，该对照线还包含链霉抗生物素蛋白捕获探针。在一些实施方案中，横向流动测定条包括测试线，该测试线还包含抗igg抗体(兔)。在一些实施方案中，溶液包含detectr
tm
测定试剂，该测定试剂还包含cas酶，其中cas酶在靶核酸(未示出)被指导核酸(未示出)结合时切割报告物。在一些实施方案中，将包含切割的报告物、未切割的报告物或它们的组合的反应后的detectr
tm
溶液暴露于横向流动测定条的样品垫。在一些实施方案中，阳性结果由测试线和对照线处的抗生物素金纳米颗粒的可见散射信号指
示，如图11的中间左图所示。在一些实施方案中，阴性结果由当不存在报告物的切割时，当不存在靶核酸时抗生物素标记的金纳米颗粒的可见散射信号指示，如图11的中间右图所示。
[0089]
本文描述了用于detectr
tm
测定的各种方法、装置、组合物和系统。图12示出了用于横向流动应用的栓系报告物的一种设计。在一些实施方案中，包含可切割核酸序列的报告物在5'端用fam和生物素标记并且在3'端用胺基官能化，如图12左图所示。在一些实施方案中，胺官能化的3'端与胺反应性磁珠缀合，如图12中间图所示。替代地，在一些实施方案中，包含可切割核酸序列的报告物在5'端用fam和生物素标记并且在3'端用硫醇基官能化，如图12左图所示。在一些实施方案中，硫醇官能化的3'端与反应室的硫醇反应性表面缀合，如图12中间图所示。在一些实施方案中，包含fam和生物素的经切割的报告物片段在被如本文所述的活性cas酶切割后释放到溶液中。在一些实施方案中，使用溶液中的磁珠进行detectr
tm
测定以实现简化横向流动测定。图13示出了这种工作流程的一个实施方案。在一些实施方案中，溶液(1300)包含还含有fam和生物素的经切割的报告物片段以及固定到磁珠上的其他报告物片段，如图13所示。在一些实施方案中，将溶液(1300)置于磁场中，使磁性颗粒被收集成固定小球(1301)，如图13的步骤a所示。在一些实施方案中，然后通过移液管收集包含fam和生物素标记的报告物片段的上清液(1302)，如图13的步骤b所示。在一些实施方案中，然后将上清液施加到横向流动测定条的样品垫上，如图13的步骤c所示。然后如本文所述读出结果。
[0090]
本文描述了各种实施方案，其中经酶修饰的报告物(1400)用于detectr
tm
测定，其中链霉抗生物素蛋白-生物素结合用于在到达反应室之前滤出切割的报告物，如图14所示。报告物(1400)包含酶(1401)、可切割核酸序列(1402)和生物素(1403)。图14的顶行示出了当溶液中存在靶核酸时的detectr
tm
方法。图14的底行示出了当溶液中不存在靶核酸时的detectr
tm
方法。在一些实施方案中，当溶液中存在靶核酸时，可编程核酸酶(1407)被激活并切割报告物(1400)。在这样的实施方案中，用生物素标记的切割的报告物片段(1408)被固定到捕获室或纸条(1405)上的链霉抗生物素蛋白(1409)捕获。当溶液中存在靶核酸时，酶(1401)在暴露于具有酶底物的检测室(1406)时产生信号发射部分(1410)。在一些实施方案中，酶(1401)是如本文所述的辣根过氧化物酶(hrp)。
[0091]
试剂和信号检测
[0092]
许多试剂与本文所公开的横向流动装置和方法一致。这些试剂包含缓冲液(例如，裂解缓冲液)、可编程核酸酶、报告物和指导核酸。本文所述的用于检测疾病的试剂包含靶向指示疾病的靶核酸区段的指导核酸。指导核酸与单链靶核酸结合，该单链靶核酸包含如本文所述的来自病毒或细菌或导致疾病的其他因子的核酸的一部分。指导核酸可以与单链靶核酸结合，该靶核酸包含如本文所述的来自细菌或导致疾病的其他因子的核酸的一部分，并且任选地还包含突变，诸如单核苷酸多态性(snp)，该突变可以赋予对治疗诸如抗生素治疗的抗性。指导核酸与靶核酸互补。通常，指导核酸与靶核酸特异性结合。靶核酸可以是rna、dna或合成核酸。
[0093]
本文公开了测定如本文所述的靶核酸的方法。例如，一种测定样品中的靶核酸的方法包括使样品与复合物接触，该复合物包含：a)指导核酸，该指导核酸包含与靶核酸的区段反向互补的区段，以及b)可编程核酸酶，该可编程核酸酶在形成包含与靶核酸的区段结
合的指导核酸的区段的激活复合物时表现出不依赖于序列的切割；以及测定指示蛋白质-核酸群体中至少一些蛋白质-核酸的切割的信号，其中该信号指示样品中靶核酸的存在，并且其中该信号的不存在指示样品中靶核酸的不存在。又如，一种测定样品中的靶核酸的方法例如包括：a)使样品与包含指导核酸和可编程核酸酶的复合物接触，所述指导核酸包含与靶核酸的区段反向互补的区段，所述可编程核酸酶在形成包含与靶核酸的区段结合的指导核酸的区段的复合物时表现出不依赖于序列的切割；b)使复合物与反应底物接触；c)使反应底物和与切割的反应底物有差别地反应的试剂接触；以及d)测定指示反应底物发生切割的信号，其中该信号指示样品中靶核酸的存在，并且其中该信号的不存在指示样品中靶核酸的不存在。所述方法可以在本文所公开的简化横向流动装置中进行。通常，反应底物是酶-核酸，并且试剂是对应于酶的酶底物。有时，反应底物是酶底物-核酸，并且试剂是对应于酶底物的酶。
[0094]
可编程核酸酶可包括当与指导核酸和靶核酸复合时能够被激活的可编程核酸酶。可编程核酸酶可以在指导核酸与靶核酸结合后被激活，其中激活的可编程核酸酶可切割靶核酸并且可具有反式切割活性。反式切割活性可以是激活的可编程核酸酶对附近单链核酸的非特异性切割，诸如具有检测部分的报告物的反式切割。一旦报告物被激活的可编程核酸酶切割，检测部分可从报告物释放并且可产生信号。信号可以是光信号(例如，荧光信号、比色信号等)或压电信号。通常，信号在报告物切割之前存在并且在报告物切割时改变。有时，信号在报告物切割之前不存在，而在报告物切割时存在。可以从位于支持介质上的检测区域或检测点检测可检测信号。在一些实施方案中，可检测信号由检测部分产生。在一些实施方案中，可检测信号指示检测部分在检测区或检测点处的结合。可编程核酸酶可以是具有反式切割活性的crispr-cas(成簇的规则间隔的短回文重复-crispr相关的)核蛋白复合物，其可以通过指导核酸与靶核酸的结合来激活。crispr-cas核蛋白复合物可包含与指导核酸复合的cas蛋白(也称为cas核酸酶)，其也可称为crispr酶。指导核酸可以是crispr rna(crrna)。有时，指导核酸包含crrna和反式激活crrna(tracrrna)。
[0095]
用于检测经修饰的靶核酸的crispr/cas系统可包含crispr rna(crrna)、反式激活crrna(tracrrna)、cas蛋白和报告物。
[0096]
a.可编程核酸酶
[0097]
本文描述了包含当与指导核酸和靶核酸区段复合时能够被激活的可编程核酸酶的试剂。当与指导核酸和靶序列复合时，可编程核酸酶能够被激活。可编程核酸酶可在指导核酸与其靶核酸结合时被激活，并且可在其环境中非特异性地降解非靶核酸。可编程核酸酶一旦被激活就具有反式切割活性。可编程核酸酶可以是cas蛋白(也可互换地称为cas核酸酶)。crrna和cas蛋白可形成crispr酶。
[0098]
几种可编程核酸酶与本公开的方法和装置一致。例如，crispr/cas酶是本文所公开的方法和系统中使用的可编程核酸酶。crispr/cas酶可包括任何已知类别和类型的crispr/cas酶。本文所公开的可编程核酸酶包括1类crispr/cas酶，诸如i型、iv型或iii型crispr/cas酶。本文所公开的可编程核酸酶还包括2类crispr/cas酶，诸如ii型、v型和vi型crispr/cas酶。包含在本文所公开的装置及其使用方法中的可编程核酸酶包括v型或vi型crispr/cas酶。
[0099]
在一些实施方案中，v型crispr/cas酶是可编程cas12核酸酶。v型crispr/cas酶
(例如，cas12或cas14)缺乏hnh结构域。在一些实施方案中，crispr/cas酶是可编程casphi。本公开的cas12核酸酶经由单个催化ruvc结构域切割核酸。ruvc结构域位于蛋白质的核酸酶或“nuc”叶内，cas12核酸酶还包含识别或“rec”叶。rec和nuc叶通过桥螺旋连接，并且cas12蛋白另外包含用于原型间隔区相邻基序(pam)识别的两个结构域，称为pam相互作用(pi)结构域和楔形(wed)结构域。(murugan等人，mol cell.2017年10月5日；68(1):15
–
25)。可编程cas12核酸酶可以是cas12a(也称为cpf1)蛋白、cas12b蛋白、cas12c蛋白、cas12d蛋白或cas12e蛋白。在一些情况下，合适的cas12蛋白包含与seq id no:27
–
seq id no:37中任一者具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0100]
表1-cas12蛋白序列
[0101]
[0102]
[0103]
[0104]
[0105]
[0106]
[0107]
[0108][0109]
替代地或组合地(例如，在多路复用过程中)，v型crispr/cas酶是可编程cas14核酸酶。本公开的cas14蛋白包括3个部分ruvc结构域(ruvc-i、ruvc-ii和ruvc-iii，在本文中也称为亚结构域)，其相对于cas14蛋白的一级氨基酸序列是不连续的，但一旦蛋白质产生并折叠就形成ruvc结构域。天然存在的cas14蛋白起催化靶核酸中特定序列切割的内切核酸酶的作用。可编程cas14核酸酶可以是cas14a蛋白、cas14b蛋白、cas14c蛋白、cas14d蛋白、cas14e蛋白、cas14f蛋白、cas14g蛋白、cas14h蛋白或cas14u蛋白。在一些情况下，合适的cas14蛋白包含与seq id no:38
–
seq id no:129中任一者具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
[0110]
表2-cas14蛋白序列
[0111]
[0112]
[0113]
[0114]
[0115]
[0116]
[0117]
[0118]
[0119]
[0120]
[0121]
[0122]
[0123]
[0124]
[0125]
[0126]
[0127]
[0128]
[0129]
[0130]
[0131]
[0132]
[0133]
[0134][0135]
在一些实施方案中，vi型crispr/cas酶是可编程cas13核酸酶。cas13蛋白的一般结构包括一个n-末端结构域和由两个螺旋结构域隔开的两个hepn(高等真核生物和原核生物核苷酸结合)结构域(liu等人，cell，2017年1月12日；168(l-2):121-134.el2)。hepn结构域各自包含ar-x
4-h基序。cas13蛋白共有的特征包括在指导核酸的crrna与靶核酸结合时，该蛋白经历构象变化以将hepn结构域聚集在一起并形成催化活性rna酶。(tambe等人，cell rep.2018年7月24日；24(4):1025-1036.)。因此，两个可激活的hepn结构域是本公开的可编程cas13核酸酶的特征。然而，同样与本公开一致的可编程cas13核酸酶包括在hepn结构域中包含增强cas13蛋白切割效率的突变或使hepn结构域催化失活的突变的cas13核酸酶。与本公开一致的可编程cas13核酸酶还包括包含催化组分的cas13核酸酶。
[0136]
可编程cas13核酸酶可以是cas13a蛋白(也称为“c2c2”)、cas13b蛋白、cas13c蛋白、cas13d蛋白或cas13e蛋白。示例性c2c2蛋白如seq id no:130-seq id no:137所示。在一些情况下，主题c2c2蛋白包含与seq id no:130-seq id no:137中任一者所示的氨基酸序列具有80％或更大(例如，85％或更大、90％或更大、95％或更大、98％或更大、99％或更大、99.5％或更大、或100％)氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，合适的c2c2多肽包含与seq id no:130所示的斯氏李斯特氏菌c2c2氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，合适的c2c2多肽包含与seq id no:131所示的口腔纤毛菌c2c2氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，合适的c2c2多肽包含与seq id no:133所示的荚膜红细菌c2c2氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，合适的c2c2多肽包含与seq id no:134所示的鸡肉杆菌(carnobacterium gallinarum)c2c2氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，合适的c2c2多肽包含与seq id no:135所示的解半纤植雪菌c2c2氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列
同一性的氨基酸序列。在一些情况下，c2c2蛋白包含与seq id no:131所示的口腔纤毛菌(lbu)c2c2氨基酸序列具有80％或更大氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，c2c2蛋白是口腔纤毛菌(lbu)c2c2蛋白(例如，参见seq id no:131)。在一些情况下，c2c2蛋白包含seq id no:130-131和seq id no:133-137中任一者所示的氨基酸序列。在一些情况下，本公开的方法中使用的c2c2蛋白不是沙氏纤毛菌(lsh)c2c2蛋白。在一些情况下，本公开的方法中使用的c2c2蛋白不是与seq id no:132所示的lsh c2c2多肽具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％氨基酸序列同一性的c2c2多肽。其他cas13蛋白序列如seq id no:130
–
seq id no:147所示。
[0137]
表3-cas13蛋白序列
[0138]
[0139]
[0140]
[0141]
[0142]
[0143]
[0144]
[0145]
[0146]
[0147]
[0148]
[0149][0150]
可编程核酸酶可以是cas13。有时cas13可以是cas13a、cas13b、cas13c、cas13d或cas13e。在一些情况下，可编程核酸酶可以是mad7或mad2。在一些情况下，可编程核酸酶可以是cas12。有时cas12可以是cas12a、cas12b、cas12c、cas12d或cas12e。在一些情况下，可编程核酸酶可以是csm1、cas9、c2c4、c2c8、c2c5、c2c10、c2c9或casz。有时，csm1可以称为smcms1、micms1、obcms1或sucms1。有时cas13a也可以称为c2c2。有时casz也可以称为cas14a、cas14b、cas14c、cas14d、cas14e、cas14f、cas14g或cas14h。有时，可编程核酸酶可以是v型crispr-cas系统。在一些情况下，可编程核酸酶可以是vi型crispr-cas系统。有时，可编程核酸酶可以是iii型crispr-cas系统。在一些情况下，可编程核酸酶可以来自以下中的至少一种：沙氏纤毛菌(lsh)、斯氏李斯特氏菌(lse)、口腔纤毛菌(lbu)、瓦氏纤毛菌(lwa)、荚膜红细菌(rca)、解半纤植雪菌(hhe)、产丙酸栖沼泽杆菌(ppr)、毛螺菌科细菌(lba)、直肠[真杆菌](ere)、纽克利斯李斯特氏菌(lny)、嗜氨梭状芽胞杆菌(cam)、普雷沃氏菌属(psm)，咬嗜二氧化碳噬细胞菌(cca)、毛螺菌科细菌(lba)、动物溃疡伯杰氏菌(bzo)、中间普雷沃氏菌(pin)、颊普雷沃氏菌(pbu)、另枝菌属(asp)、鸭疫里默氏杆菌(ran)、橙黄普雷沃氏菌(pau)、解糖普雷沃氏菌(psa)、中间普雷沃氏菌(pin2)、犬咬嗜二氧化碳噬细胞菌(cca)、咽喉卟啉单胞菌(pgu)、普雷沃氏菌属(psp)、牙龈卟啉单胞菌(pig)、中间普雷沃氏菌(pin3)、意大利肠球菌(ei)、唾液乳杆菌(ls)或嗜热栖热菌(tt)。有时cas13是lbucas13a、lwacas13a、lbacas13a、hhecas13a、pprcas13a、erecas13a、camcas13a
或lshcas13a中的至少一种。当crrna与靶核酸复合时，可以激活crispr酶的反式切割活性。当包含tracrrna和crrna的指导核酸与靶核酸复合时，可以激活crispr酶的反式切割活性。在一些实施方案中，靶核酸是rna。
[0151]
在一些实施方案中，可编程核酸酶包含cas12，其中cas12酶结合并切割双链dna和单链dna。在一些实施方案中，可编程核酸酶包含cas13，其中cas13酶结合并切割单链rna。在一些实施方案中，可编程核酸酶包含cas14，其中cas14酶结合并切割双链dna和单链dna。
[0152]
b.指导核酸
[0153]
指导核酸可包含与靶核酸的序列反向互补的序列。指导核酸可包含crrna。有时，指导核酸包含crrna和tracrrna。指导核酸可以与靶核酸特异性结合。在一些情况下，指导核酸不是天然存在的，而是通过人工组合另外分离的序列区段而制备的。通常，人工组合是通过化学合成、通过基因工程技术或通过人工操作分离的核酸区段来进行的。可以设计和制备靶核酸以提供所需的功能。在一些情况下，指导核酸的靶向区域的长度是20个核苷酸。指导核酸的靶向区域可以具有至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长度的长度。在一些情况下，指导核酸的靶向区域的长度是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些情况下，指导核酸的靶向区域的长度是正好或约12个核苷酸(nt)至约80个nt、约12个nt至约50个nt、约12个nt至约45个nt、约12个nt至约40个nt、约12个nt至约35个nt、约12个nt至约30个nt、约12个nt至约25个nt、约12个nt至约20个nt、约12个nt至约19个nt、约19个nt至约20个nt、约19个nt至约25个nt、约19个nt至约30个nt、约19个nt至约35个nt、约19个nt至约40个nt、约19个nt至约45个nt、约19个nt至约50个nt、约19个nt至约60个nt、约20个nt至约25个nt、约20个nt至约30个nt、约20个nt至约35个nt、约20个nt至约40个nt、约20个nt至约45个nt、约20个nt至约50个nt、或约20个nt至约60个nt。应当理解，多核苷酸的序列不需要与其靶核酸的序列100％互补，以可特异性杂交或可杂交或能够特异性结合。指导核酸可以具有在核酸残基5至20的区域中包含至少一个尿嘧啶的序列，该区域与靶核酸中的修饰可变区反向互补。在一些情况下，指导核酸可以具有在核酸残基5至9、10至14或15至20的区域中包含至少一个尿嘧啶的序列，该区域与靶核酸中的修饰可变区反向互补。指导核酸可以具有在核酸残基5至20的区域中包含至少一个尿嘧啶的序列，该区域与靶核酸中的甲基化可变区反向互补。在一些情况下，指导核酸可以具有在核酸残基5至9、10至14或15至20的区域中包含至少一个尿嘧啶的序列，该区域与靶核酸中的甲基化可变区反向互补。
[0154]
指导核酸可以选自一组针对感染菌株或感兴趣的基因组基因座的核酸序列平铺的指导核酸。指导核酸可以选自一组针对感兴趣的菌株的核酸序列平铺的指导核酸。通常，可以将针对感染菌株或感兴趣的基因组基因座的核酸平铺指导核酸池化用于本文所述的方法。通常，将这些指导核酸池化用于在单一测定中检测靶核酸。针对单一靶核酸平铺的指导核酸的池化可以增强使用本文所述的方法对靶核酸的检测。针对单个靶核酸平铺指导核酸的池化可以确保使用本文所述的方法在单个反应中对靶核酸的广泛覆盖。例如，平铺沿着靶核酸是连续的。有时，平铺沿着靶核酸重叠。在一些情况下，平铺包括沿着靶核酸平铺指导核酸之间的间隙。在一些情况下，指导核酸的平铺是不连续的。通常，用于检测靶核酸的方法包括使靶核酸与指导核酸池和可编程核酸酶接触，其中指导核酸池中的指导核酸具有选自一组对应于靶核酸的核酸的平铺指导核酸的序列；以及测定通过切割报告物群体中
的至少一些报告物产生的信号。指导核酸的池化可以确保在单个反应中对靶物种的广谱鉴定或广泛覆盖。这对于可能由多种生物体引起的疾病或适应症如脓毒症特别有用。
[0155]
c.报告物
[0156]
本文还公开了报告物和使用报告物检测靶核酸的方法。通常，报告物是蛋白质-核酸。例如，一种测定样品中的靶核酸的方法包括使样品与复合物接触，该复合物包含：a)指导核酸，该指导核酸包含与靶核酸的区段反向互补的区段，以及b)可编程核酸酶，该可编程核酸酶在形成包含与靶核酸的区段结合的指导核酸的区段的激活复合物时表现出不依赖于序列的切割；以及测定指示蛋白质-核酸群体中至少一些蛋白质-核酸的切割的信号，其中该信号指示样品中靶核酸的存在，并且其中该信号的不存在指示样品中靶核酸的不存在。通常，蛋白质-核酸是酶-核酸或酶底物-核酸。有时，蛋白质-核酸附着到固体支持物上。核酸可以是dna、rna或dna/rna杂合体。本文所述的方法使用可编程核酸酶诸如crispr/cas系统检测靶核酸。一种测定样品中的靶核酸的方法例如包括：a)使样品与包含指导核酸和可编程核酸酶的复合物接触，所述指导核酸包含与靶核酸的区段反向互补的区段，所述可编程核酸酶在形成包含与靶核酸的区段结合的指导核酸的区段的复合物时表现出不依赖于序列的切割；b)使复合物与底物接触；c)使底物和与切割的底物有差别地反应的试剂接触；以及d)测定指示底物的切割的信号，其中该信号指示样品中靶核酸的存在，并且其中该信号的不存在指示样品中靶核酸的不存在。通常，底物是酶-核酸。有时，底物是酶底物-核酸。
[0157]
蛋白质-核酸的切割产生信号。本文所公开的横向流动装置可用于检测指示样品中是否存在靶核酸的这些信号。
[0158]
本文描述了包含报告物的试剂，所述报告物还包含单链核酸和检测部分，其中单链核酸能够被激活的可编程核酸酶切割，从而产生第一可检测信号。在一些情况下，报告物是包含脱氧核糖核苷酸的单链核酸。在其他情况下，报告物是包含核糖核苷酸的单链核酸。报告物可以是包含至少一种脱氧核糖核苷酸和至少一种核糖核苷酸的单链核酸。在一些情况下，报告物是单链核酸，其在起切割位点作用的内部位置处包含至少一个核糖核苷酸残基。在一些情况下，报告物在内部位置处包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个核糖核苷酸残基。有时核糖核苷酸残基是连续的。或者，核糖核苷酸残基散布在非核糖核苷酸残基之间。在一些情况下，报告物仅具有核糖核苷酸残基。在一些情况下，报告物仅具有脱氧核糖核苷酸残基。在一些情况下，报告物包含抗本文所述的可编程核酸酶切割的核苷酸。在一些情况下，报告物包含合成核苷酸。在一些情况下，报告物包含至少一个核糖核苷酸残基和至少一个非核糖核苷酸残基。在一些情况下，报告物的长度为5-20、5-15、5-10、7-20、7-15或7-10个核苷酸。在一些情况下，报告物包含至少一个尿嘧啶核糖核苷酸。在一些情况下，报告物包含至少两个尿嘧啶核糖核苷酸。有时报告物仅具有尿嘧啶核糖核苷酸。在一些情况下，报告物包含至少一个腺嘌呤核糖核苷酸。在一些情况下，报告物包含至少两个腺嘌呤核糖核苷酸。在一些情况下，报告物仅具有腺嘌呤核糖核苷酸。在一些情况下，报告物包含至少一个胞嘧啶核糖核苷酸。在一些情况下，报告物包含至少两个胞嘧啶核糖核苷酸。在一些情况下，报告物包含至少一个鸟嘌呤核糖核苷酸。在一些情况下，报告物包含至少两个鸟嘌呤核糖核苷酸。报告物可仅包含未修饰的核糖核苷酸、仅包含未修饰的脱氧核糖核苷酸或它们的组合。在一些情况下，报告物的长度为5至12个核苷酸。在一些情况下，报告物的长度为至
少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些情况下，报告物的长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。对于由包含cas13的可编程核酸酶进行的切割，报告物的长度可为5、8或10个核苷酸。对于由包含cas12的可编程核酸酶进行的切割，报告物的长度可为10个核苷酸。
[0159]
在一些实施方案中，单链报告物包含能够产生第一可检测信号的检测部分。有时报告物包含能够产生信号的蛋白质。信号可以是光信号(例如，荧光信号、比色信号等)。在一些情况下，检测部分位于切割位点的一侧。任选地，猝灭部分位于切割位点的另一侧。有时猝灭部分是荧光猝灭部分。在一些情况下，猝灭部分位于切割位点的5'，并且检测部分位于切割位点的3'。在一些情况下，检测部分位于切割位点的5'，并且猝灭部分位于切割位点的3'。有时猝灭部分位于报告物的5
′
端。有时检测部分位于报告物的3
′
端。在一些情况下，检测部分位于报告物的5
′
端。在一些情况下，猝灭部分位于报告物的3
′
端。在一些情况下，单链报告物是能够产生第一可检测信号的单链核酸的至少一个群体。在一些情况下，单链报告物是能够产生第一可检测信号的单链核酸群体。任选地，存在多于一个单链报告物群体。在一些情况下，存在2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50或大于50个或跨越该列表范围的任何数量的能够产生可检测信号的单链报告物的不同群体。
[0160]
表4-示例性单链报告物
[0161][0162][0163]
·
/56-fam/：5
′
6-荧光素(integrated dna technologies)
[0164]
·
/3iabkfq/：3
′
iowa black fq(integrated dna technologies)
[0165]
·
/5ird700/：5
′
irdye 700(integrated dna technologies)
[0166]
·
/5tye665/：5
′
tye 665(integrated dna technologies)
[0167]
·
/5alex594n/：5
′
alexa fluor 594(nhs酯)(integrated dna technologies)
[0168]
·
/5atto633n/：5
′
atto tm 633(nhs酯)(integrated dna technologies)
[0169]
·
/3irqc1n/：3
′
irdye qc-1quencher(li-cor)
[0170]
·
/3iabrqsp/：3
′
iowa black rq(integrated dna technologies)
[0171]
·
ru：尿嘧啶核糖核苷酸
[0172]
·
rg：鸟嘌呤核糖核苷酸
[0173]
·
*该表提及检测部分和猝灭剂部分，如它们的商品名和它们的来源所标识的。然而，也可以使用来自其他来源的具有类似功能的替代物、通用物或非商品名部分。
[0174]
检测部分可以是荧光团。检测部分可以是在可见光谱中发射荧光的荧光团。在一些实施方案中，检测部分可以是在可见光谱中发射荧光的荧光团。在一些实施方案中，检测部分可以是在近红外光谱中发射荧光的荧光团。在一些实施方案中，检测部分可以是在红外光谱中发射荧光的荧光团。检测部分可以是发射500nm至720nm范围内的荧光的荧光团。在一些情况下，检测部分发射波长为700nm或更高的荧光。在其他情况下，检测部分发射约660nm或约670nm的荧光。在一些情况下，检测部分发射在500至520、500至540、500至590、590至600、600至610、610至620、620至630、630至640、640至650、650至660、660至670、670至680、680至690、690至700、700至710、710至720或720至730nm的范围内的荧光。检测部分可以是发射与6-荧光素、ir dye 700、alexa fluor 488、tye 665或atto tm 633(nhs酯)相同范围内的荧光的荧光团。检测部分可以是荧光素亚酰胺、6-荧光素、irdye 700、tye 665、alexa fluor 594或atto tm 633(nhs酯)。检测部分可以是发射与6-荧光素(integrated dna technologies)、irdye 700(integrated dna technologies)、tye 665(integrated dna technologies)、alexa fluor594(integrated dna technologies)或atto tm 633(nhs酯)(integrated dna technologies)相同范围内的荧光的荧光团。检测部分可以是荧光素亚酰胺、6-荧光素(integrated dna technologies)、irdye700(integrated dna technologies)、tye 665(integrated dna technologies)、alexa fluor 594(integrated dna technologies)或atto tm 633(nhs酯)(integrated dna technologies)。本文所述的任何检测部分可以来自任何可商购获得的来源，可以是具有类似功能的替代物、通用物或非商品名的所列出的检测部分。
[0175]
可以基于待测试样品的类型选择检测部分使用。例如，作为红外荧光团的检测部分与尿液样品一起使用。又如，具有发射约520nm的荧光团的seq id no:1用于在非尿液样品中测试，并且具有发射约700nm的荧光的荧光团的seq id no:8用于在尿液样品中测试。
[0176]
猝灭部分可以基于其猝灭检测部分的能力来选择。猝灭部分可以是非荧光荧光猝灭剂。猝灭部分可以猝灭发射在500nm至720nm范围内的荧光的检测部分。在一些情况下，猝灭部分猝灭发射波长为700nm或更高的荧光的检测部分。在其他情况下，猝灭部分猝灭发射约660nm或约670nm的荧光的检测部分。在一些情况下，猝灭部分猝灭发射在500至520、500至540、500至590、590至600、600至610、610至620、620至630、630至640、640至650、650至660、660至670、670至680、680至690、690至700、700至710、710至720或720至730nm的范围内
的荧光的检测部分。猝灭部分可以猝灭荧光素亚酰胺、6-荧光素、irdye 700、tye 665、alexa fluor 594或atto tm 633(nhs酯)。猝灭部分可以是iowa black rq、iowa black fq或irdye qc-1猝灭剂。猝灭部分可以猝灭荧光素亚酰胺、6-荧光素(integrated dna technologies)、irdye 700(integrated dna technologies)、tye 665(integrated dna technologies)、alex fluor 594(integrated dna technologies)或atto tm 633(nhs酯)(integrated dna technologies)。猝灭部分可以是iowa black rq(integrated dna technologies)、iowa black fq(integrated dna technologies)或irdye qc-1quencher(licor)。本文所述的任何猝灭部分可以来自任何可商购获得的来源，可以是具有类似功能的替代物、通用物或非商品名的所列出的猝灭部分。
[0177]
指示检测部分的释放的可检测信号的产生表明可编程核酸酶的切割已经发生并且样品含有靶核酸。在一些情况下，检测部分包含荧光染料。有时检测部分包含荧光共振能量转移(fret)对。在一些情况下，检测部分包含红外(ir)染料。在一些情况下，检测部分包含紫外(uv)染料。替代地或组合地，检测部分包含多肽。有时检测部分包括生物素。有时检测部分包含抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白中的至少一种。在一些情况下，检测部分包含多糖、聚合物或纳米颗粒。在一些情况下，检测部分包含金纳米颗粒或乳胶纳米颗粒。
[0178]
检测部分可以是能够产生量热信号、电位信号、电流信号、光信号(例如，荧光信号、比色信号等)或压电信号的任何部分。报告物有时是能够经由核酸的切割产生量热信号、电位信号、电流信号、光信号(例如，荧光信号、比色信号等)或压电信号的蛋白质-核酸。通常，量热信号是在报告物的切割后产生的热量。有时，量热信号是在报告物的切割后吸收的热量。例如，电位信号是在报告物的切割后产生的电位。电流信号可以是在报告物的切割后产生的电子的运动。通常，信号是光信号，诸如比色信号或荧光信号。例如，光信号是在报告物的切割后产生的光输出。有时，光信号是在报告物的切割之前和之后测量的光吸收、发射或两者的变化。有时，光信号是在报告物的切割之前和之后测量的光吸收、发射或两者的增加。有时，光信号是在报告物的切割之前和之后测量的光吸收、发射或两者的减少。通常，压电信号是在可编程核酸酶切割报告物前后之间的质量变化。
[0179]
通常，蛋白质-核酸是酶-核酸。当存在于酶-核酸中时，酶可能会受到空间位阻，但随后在通过可编程核酸酶从核酸切割时起作用。通常，酶是与酶底物产生反应的酶。酶可以是转化酶。通常，转化酶的底物是蔗糖和dns试剂。
[0180]
有时蛋白质-核酸是底物-核酸。通常，底物是与酶产生反应的底物。在被可编程核酸酶切割时释放底物可以释放底物以与酶反应。
[0181]
蛋白质-核酸可以附着到固体支持物上。固体支持物例如是表面。表面可以是电极。有时，固体支持物是珠。通常，珠是磁珠。在切割时，蛋白质从固体中释放并与其他混合物相互作用。例如，蛋白质是酶，并且在酶-核酸的核酸切割时，酶流过室进入包含底物的混合物中。当酶与酶底物接触时，发生反应，诸如比色反应，然后对其进行检测。又如，蛋白质是酶底物，并且在酶底物-核酸的核酸切割时，酶流过室进入包含酶的混合物中。当酶底物与酶接触时，发生反应，诸如量热反应，然后对其进行检测。
[0182]
在一些实施方案中，报告物包含与亲和分子缀合的核酸，所述亲和分子继而与荧光团缀合(例如，核酸-亲和分子-荧光团)，或者包含与荧光团缀合的核酸，所述荧光团继而与亲和分子缀合(例如，核酸-荧光团-亲和分子)。在一些实施方案中，接头将核酸与亲和分
子缀合。在一些实施方案中，接头将亲和分子与荧光团缀合。在一些实施方案中，接头将核酸与荧光团缀合。接头可以是本领域已知的任何合适的接头。在一些实施方案中，报告物的核酸可以直接与亲和分子缀合，并且亲和分子可以直接与荧光团缀合，或者核酸可以直接与荧光团缀合，并且荧光团可以直接与亲和分子缀合。在本文中，“直接缀合”表示在彼此直接缀合的两个部分之间不存在插入分子、多肽、蛋白质或其他部分。例如，如果报告物包含直接与亲和分子缀合的核酸和直接与荧光团缀合的亲和分子，则在核酸与亲和分子之间不存在插入部分，并且在亲和分子与荧光团之间不存在插入部分。亲和分子可以是生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或任何类似的分子。
[0183]
在一些情况下，报告物包含底物-核酸。当存在于底物-核酸中时，底物可与其同源酶隔离，但随后在切割时从核酸释放，其中释放的底物可以接触同源酶以产生可检测信号。通常，底物是蔗糖，同源酶是转化酶，并且dns试剂可用于监测转化酶活性。
[0184]
报告物可以是杂合核酸报告物。杂合核酸报告物包含具有至少一个脱氧核糖核苷酸和至少一个核糖核苷酸的核酸。在一些实施方案中，杂合核酸报告物的核酸可具有任何长度并且可具有dna和rna的任何混合物。例如，在一些情况下，较长的dna区段可以被一些核糖核苷酸中断。替代地，较长的rna区段可以被一些脱氧核糖核苷酸中断。替代地，核酸中每隔一个碱基可以在核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸之间交替。与纯rna核酸报告物相比，杂合核酸报告物的主要优点是稳定性增加。例如，与纯dna或纯rna报告物相比，杂合核酸报告物在溶液、冻干或玻璃化形式中可以更稳定。
[0185]
报告物可以被冻干或玻璃化。报告物可以悬浮在溶液中或固定在表面上。例如，报告物可以固定在如本文所公开的装置中的室的表面上。在一些情况下，报告物被固定在如本文所公开的装置的室中的珠诸如磁珠上，其中它们通过放置在室下方的磁体保持在适当位置。
[0186]
另外，靶核酸可以任选地在与可编程核酸酶(例如，crispr酶)的指导核酸(例如，crrna)结合之前被扩增。这种扩增可以是pcr扩增或等温扩增。样品的这种核酸扩增可以提高检测靶rna的灵敏度、特异性或准确性中的至少一种。用于核酸扩增的试剂可包括重组酶、寡核苷酸引物、单链dna结合(ssb)蛋白和聚合酶。核酸扩增可以是转录介导的扩增(tma)。核酸扩增可以是解旋酶依赖性扩增(hda)或环状解旋酶依赖性扩增(chda)。在其他情况下，核酸扩增是链置换扩增(sda)。核酸扩增可以是重组酶聚合酶扩增(rpa)。核酸扩增可以是环介导扩增(lamp)或指数扩增反应(expar)中的至少一种。在一些情况下，核酸扩增是通过滚环扩增(rca)、连接酶链反应(lcr)、简单方法扩增rna靶(smart)、单引物等温扩增(spia)、多重置换扩增(mda)、基于核酸序列的扩增(nasba)、铰链引发的引物依赖性核酸扩增(hip)、切口酶扩增反应(near)或改进的多重置换扩增(imda)。核酸扩增可以进行不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50或60分钟。有时，核酸扩增反应在约20-45℃的温度下进行。有时，核酸扩增反应在约45-65℃的温度下进行。核酸扩增反应可以在不高于20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃或65℃的温度下进行。核酸扩增反应可以在至少20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃或65℃的温度下进行。
[0187]
本文公开了测定如本文所述的靶核酸的方法，其中检测信号。例如，一种测定样品中的靶核酸的方法包括：使样品与包含指导核酸和可编程核酸酶的复合物接触，所述指导
核酸包含与靶核酸的区段反向互补的区段，所述可编程核酸酶在形成包含与靶核酸的区段结合的指导核酸的区段的复合物时表现出不依赖于序列的切割；以及测定指示蛋白质-核酸群体中至少一些蛋白质-核酸的切割的信号，其中该信号指示样品中靶核酸的存在，并且其中该信号的不存在指示样品中靶核酸的不存在。又如，一种测定样品中的靶核酸的方法例如包括：a)使样品与包含指导核酸和可编程核酸酶的复合物接触，所述指导核酸包含与靶核酸的区段反向互补的区段，所述可编程核酸酶在形成包含与靶核酸的区段结合的指导核酸的区段的复合物时表现出不依赖于序列的切割；b)使复合物与反应底物接触；c)使反应底物和与切割的底物有差别地反应的试剂接触；以及d)测定指示反应底物的切割的信号，其中该信号指示样品中靶核酸的存在，并且其中该信号的不存在指示样品中靶核酸的不存在。通常，底物是酶-核酸。有时，底物是酶底物-核酸。
[0188]
可编程核酸酶可包括当与指导核酸和靶核酸复合时能够被激活的可编程核酸酶。可编程核酸酶可以在指导核酸与靶核酸结合后被激活，其中激活的可编程核酸酶可切割靶核酸并且可具有反式切割活性。反式切割活性可以是激活的可编程核酸酶对附近核酸的非特异性切割，诸如具有检测部分的报告物的反式切割。一旦报告物被激活的可编程核酸酶切割，检测部分可从报告物释放并且可产生信号。可以从支持介质上的检测点检测信号，其中检测点包含用于切割的报告物片段的捕获探针。信号可被可视化以评估靶核酸是否包含修饰。
[0189]
通常，信号是比色信号或肉眼可见的信号。在一些情况下，通过检测部分与检测区域中的捕获分子的结合产生第一检测信号，其中第一检测信号指示样品含有靶核酸。有时系统能够检测多于一种类型的靶核酸，其中系统包含多于一种类型的指导核酸和多于一种类型的能够直接地或间接地产生至少第一检测信号和第二检测信号的报告物。在一些情况下，可检测信号直接由切割事件产生。替代地或组合地，可检测信号由信号事件间接产生。有时可检测信号不是荧光信号。在一些情况下，可检测信号是比色信号或基于颜色的信号。在一些情况下，基于可检测信号在支持介质的检测区域上的空间位置来鉴定所检测的靶核酸。在一些情况下，第二可检测信号在空间上不同于第一产生信号的位置产生。
[0190]
在一些情况下，对于检测样品中单链靶核酸的主题方法，检测阈值小于或等于10nm。术语“检测阈值”在本文中用于描述为了进行检测而必须存在于样品中的靶核酸的最小量。例如，当检测阈值为10nm时，则当靶核酸以10nm或更高的浓度存在于样品中时可以检测到信号。在一些情况下，检测阈值小于或等于5nm、1nm、0.5nm、0.1nm、0.05nm、0.01nm、0.005nm、0.001nm、0.0005nm、0.0001nm、0.00005nm、0.00001nm、10pm、1pm、500fm、250fm、100fm、50fm、10fm、5fm、1fm、500阿托摩尔(am)、100am、50am、10am或1am。在一些情况下，检测阈值在1am至1nm、1am至500pm、1am至200pm、1am至100pm、1am至10pm、1am至1pm、1am至500fm、1am至100fm、1am至1fm、1am至500am、1am至100am、1am至50am、1am至10am、10am至1nm、10am至500pm、10am至200pm、10am至100pm、10am至10pm、10am至1pm、10am至500fm、10am至100fm、10am至1fm、10am至500am、10am至100am、10am至50am、100am至1nm、100am至500pm、100am至200pm、100am至100pm、100am至10pm、100am至1pm、100am至500fm、100am至100fm、100am至1fm、100am至500am、500am至1nm、500am至500pm、500am至200pm、500am至100pm、500am至10pm、500am至1pm、500am至500fm、500am至100fm、500am至1fm、1fm至1nm、1fm至500pm、1fm至200pm、1fm至100pm、1fm至10pm、1fm至1pm、10fm至1nm、10fm至500pm、10fm至
200pm、10fm至100pm、10fm至10pm、10fm至1pm、500fm至1nm、500fm至500pm、500fm至200pm、500fm至100pm、500fm至10pm、500fm至1pm、800fm至1nm、800fm至500pm、800fm至200pm、800fm至100pm、800fm至10pm、800fm至1pm、fom 1pm至1nm、1pm至500pm、1pm至200pm、1pm至100pm或1pm至10pm的范围内。在一些情况下，检测阈值在800fm至100pm、1pm至10pm、10fm至500fm、10fm至50fm、50fm至100fm、100fm至250fm或250fm至500fm的范围内。在一些情况下，在样品中检测到单链靶核酸的最小浓度在1am至1nm、10am至1nm、100am至1nm、500am至1nm、1fm至1nm、1fm至500pm、1fm至200pm、1fm至100pm、1fm至10pm、1fm至1pm、10fm至1nm、10fm至500pm、10fm至200pm、10fm至100pm、10fm至10pm、10fm至1pm、500fm至1nm、500fm至500pm、500fm至200pm、500fm至100pm、500fm至10pm、500fm至1pm、800fm至1nm、800fm至500pm、800fm至200pm、800fm至100pm、800fm至10pm、800fm至1pm、1pm至1nm、1pm至500pm、1pm至200pm、1pm至100pm或1pm至10pm的范围内。在一些情况下，可在样品中检测到单链靶核酸的最小浓度在1am至100pm的范围内。在一些情况下，可在样品中检测到单链靶核酸的最小浓度在1fm至100pm的范围内。在一些情况下，可在样品中检测到单链靶核酸的最小浓度在10fm至100pm的范围内。在一些情况下，可在样品中检测到单链靶核酸的最小浓度在800fm至100pm的范围内。在一些情况下，可在样品中检测到单链靶核酸的最小浓度在1pm至10pm的范围内。在一些情况下，本文所述的简化横向流动装置和方法检测包含多种核酸诸如多种非靶核酸的样品中的靶单链核酸，其中该靶单链核酸以低至1am、10am、100am、500am、1fm、10fm、500fm、800fm、1pm、10pm、100pm或1pm的浓度存在。
[0191]
在一些情况下，本文所述的简化横向流动装置和方法检测样品中的靶单链核酸，其中使样品与试剂接触预定长度的时间，该预定长度的时间足以使反式切割发生或切割反应完成。在一些情况下，本文所述的简化横向流动装置和方法检测样品中的靶单链核酸，其中样品与试剂接触不超过60分钟。有时样品与试剂接触不超过120分钟、110分钟、100分钟、90分钟、80分钟、70分钟、60分钟、55分钟、50分钟、45分钟、40分钟、35分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟或1分钟。有时样品与试剂接触至少120分钟、110分钟、100分钟、90分钟、80分钟、70分钟、60分钟、55分钟、50分钟、45分钟、40分钟、35分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟或5分钟。在一些情况下，本文所述的简化横向流动装置和方法可在少于10小时、少于9小时、少于8小时、少于7小时、少于6小时、少于5小时、少于4小时、少于3小时、少于2小时、少于1小时、少于50分钟、少于45分钟、少于40分钟、少于35分钟、少于30分钟、少于25分钟、少于20分钟、少于15分钟、少于10分钟、少于9分钟、少于8分钟、少于7分钟、少于6分钟或少于5分钟内检测样品中的靶核酸。
[0192]
当指导核酸与靶核酸结合时，可引发可编程核酸酶的反式切割活性，并且可切割报告物，从而检测到可检测信号(例如，荧光)。如本文所述的一些方法可以是测定样品中的靶核酸的方法，该方法包括：使样品与包含指导核酸和可编程核酸酶的复合物接触，所述指导核酸包含与靶核酸的区段反向互补的区段，所述可编程核酸酶在形成包含与靶核酸的区段结合的指导核酸的区段的复合物时表现出不依赖于序列的切割；以及测定指示报告物群体中至少一些报告物(例如，蛋白质-核酸群体中至少一些蛋白质-核酸)的切割的信号，其中该信号指示样品中靶核酸的存在，并且其中该信号的不存在指示样品中靶核酸的不存在。作为非限制性示例，使用可编程核酸酶切割报告物可以至少约50％的效率切割，如通过光信号(例如，荧光信号、比色信号等)的变化所测量。如本文所述的一些方法可以是检测样
品中的靶核酸的方法，该方法包括使包含靶核酸的样品与靶向靶核酸区段的指导核酸、当与指导核酸和靶核酸区段复合时能够被激活的可编程核酸酶、包含检测部分的单链报告物接触，其中该报告物能够被激活的可编程核酸酶切割，从而产生第一可检测信号，使用如通过颜色变化所测量进行切割的可编程核酸酶切割单链报告物，并且测量支持介质上的第一可检测信号。使用可编程核酸酶切割单链报告物可以至少约50％的效率切割，如通过如本文所述的检测区域或检测点的颜色变化所测量。在一些情况下，切割效率为至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％，如通过颜色变化所测量。颜色变化可以是可检测的比色信号或肉眼可见的信号。颜色变化可作为第一可检测信号来测量。第一可检测信号可以在使包含靶核酸的样品与靶向靶核酸区段的指导核酸、当与指导核酸和靶核酸区段复合时能够被激活的可编程核酸酶和包含检测部分的单链报告物接触的5分钟内是可检测的，其中报告物能够被激活的核酸酶切割。第一可检测信号可以在使包含靶核酸的样品与靶向靶核酸区段的指导核酸接触的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100、110或120分钟内是可检测的。
[0193]
在一些情况下，本文所述的简化横向流动装置和方法用可编程核酸酶和单链报告物检测样品中的靶单链核酸，其中使样品与试剂接触足以反式切割单链报告物的预定长度的时间。例如，可编程核酸酶是检测靶核酸的lbucas13a，并且单链报告物包含两个相邻的尿嘧啶核苷酸，其具有在切割时检测到的绿色可检测部分。又如，可编程核酸酶是检测靶核酸的lbacas13a，并且单链报告物包含两个相邻的腺嘌呤核苷酸，其具有在切割时检测到的红色可检测部分。
[0194]
在一些情况下，本文所述的简化横向流动装置和方法用两种不同的可编程核酸酶和两种不同的单链报告物检测样品中的两种不同的靶单链核酸，其中使样品与试剂接触足以反式切割所述至少两种单链报告物的预定长度的时间。例如，第一可编程核酸酶是lbucas13a，其被第一单链靶核酸激活，并且在激活后切割包含两个相邻的尿嘧啶核苷酸并具有在切割时检测到的绿色可检测部分的第一单链报告物，并且第二可编程核酸酶是lbacas13a，其被第二单链靶核酸激活，并且在激活后切割包含两个相邻的腺嘌呤核苷酸并具有在切割时检测到的红色可检测部分的第二单链报告物。在一些情况下，激活两种可编程核酸酶以切割它们各自的单链核酸例，例如lbucas13a以切割包含两个相邻的尿嘧啶核苷酸并具有在切割时检测到的绿色可检测部分的第一单链报告物，以及lbacas13a以切割包含两个相邻的腺嘌呤核苷酸并具有在切割时检测到的红色可检测部分的第二单链报告物，使得随后检测到黄色信号，指示第一单链靶核酸和第二单链靶核酸均存在于样品中。
[0195]
替代地，本文所述的简化横向流动装置和方法可包括检测样品中第一单链靶核酸的存在的第一可编程核酸酶和用作对照的第二可编程核酸酶。例如，第一可编程核酸酶是lbucas13a，其切割包含两个相邻的尿嘧啶核苷酸并具有在切割时检测到的绿色可检测部分的第一单链报告物，并且在第一单链靶核酸存在于样品中时被第一单链靶核酸激活，并且第二可编程核酸酶是lbacas13a，其切割包含两个相邻的腺嘌呤核苷酸并具有在切割时检测到的红色可检测部分的第二单链报告物，并且被样品中未发现(并且预期不会被发现)并用作对照的第二单链靶核酸激活。在这种情况下，红色信号或黄色信号的检测表明测试存在问题(例如，样品含有高水平的其他rna酶，所述rna酶在不存在第二可编程核酸酶的激活的情况下切割单链报告物)，但是仅绿色信号的检测表明测试正确地工作并且第一可编
程核酸酶的第一靶单链核酸存在于样品中。
[0196]
又如，本文所述的简化横向流动装置和方法用至少两种不同的可编程核酸酶和至少两种不同的单链报告物检测样品中的至少两种不同的靶单链核酸，其中使样品与试剂接触足以反式切割所述至少两种单链检测核酸的预定长度的时间。例如，第一可编程核酸酶是cas13a蛋白，其切割在切割时检测到的第一单链检测核酸并且在来自败血症rna生物标志物的第一单链靶核酸存在于样品中时被其激活，并且第二可编程核酸酶是cas14蛋白，其切割在切割时检测到的第二单链报告物并且被第二单链靶核酸激活。
[0197]
本文所述的试剂还可包括与本文所公开的简化横向流动装置和方法相容的缓冲液。这些缓冲液与本文所述的其他试剂、样品和支持介质相容，用于检测病痛，诸如疾病，包括由病毒引起的疾病。本文所述的方法还可包括使用与本文所公开的方法相容的缓冲液。相容的缓冲液和缓冲液组分可包括hepes、kcl、mgcl2、甘油、igepal ca-630、bsa和咪唑。
[0198]
许多检测装置和方法与本文所公开的方法一致。例如，可以测量或检测量热信号、电位信号、电流信号、光信号(例如，荧光信号、比色信号等)或压电信号的任何装置。通常，量热信号是在报告物的切割后产生的热量。有时，量热信号是在报告物的切割后吸收的热量。例如，电位信号是在报告物的切割后产生的电位。电流信号可以是在报告物的切割后产生的电子的运动。通常，信号是光信号，诸如比色信号或荧光信号。例如，光信号是在报告物的切割后产生的光输出。有时，光信号是在报告物的切割前后之间的光吸收变化。通常，压电信号是在报告物的切割前后之间的质量变化。有时，报告物是蛋白质-核酸。通常，蛋白质-核酸是酶-核酸。
[0199]
来自完成测定的检测区域的结果可以多种方式检测和分析，例如通过血糖仪。在一些情况下，检测区域中的阳性对照点和检测点是肉眼可见的，并且结果可以由用户读取。在一些情况下，检测区域中的阳性对照点和检测点根据信号的类型通过成像装置或其他装置可视化。通常，成像装置是数码相机，诸如移动装置上的数码相机。移动装置可具有软件程序或移动应用程序，其可以捕获支持介质的图像，识别正在执行的测定，检测检测区域和检测点，提供检测点的图像特性，分析检测点的图像特性并且/或者提供结果。替代地或组合地，成像装置可以捕获荧光、紫外(uv)、红外(ir)或可见波长信号。成像装置可以具有激发源以提供激发能量并捕获发射的信号。在一些情况下，激发源可以是相机闪光灯和任选的滤光器。在一些情况下，成像装置与放置在装置的支持介质上的成像盒一起使用以产生暗室，从而改善成像。成像盒可以是成像装置可以在成像之前装入的纸板盒。在一些情况下，成像盒具有光学透镜、反射镜、滤光器或其他光学元件，以帮助产生更聚焦的激发信号或捕获更聚焦的发射信号。通常，成像盒和成像装置是小型的、薄型的、手持式的和/或便携式的，以便于在远程或资源匮乏的环境中运输和使用测定。
[0200]
本文所述的测定可以通过移动应用程序(app)或软件程序进行可视化和分析。使用应用程序或程序的图形用户界面(gui)，个人可以使用移动装置上的相机拍摄支持介质的图像，包括壳体上的检测区域、条形码、参考色标和/或基准标记。程序或应用程序读取测试类型的条形码或可识别标签，定位基准标记以定向样品，并读取可检测信号，与参考色栅比较，并确定靶核酸的存在或不存在，其指示基因、病毒或导致疾病或病症或状态的因子的存在。移动应用程序可以向个人呈现测试的结果。移动应用程序可以将测试结果存储在移动应用程序中。移动应用程序可以与远程装置通信并传送测试结果的数据。测试结果可以
由另一个人(包括医疗保健专业人员)从远程装置远程查看。远程用户可以访问结果并使用该信息来推荐治疗、干预、环境清理的行动。
[0201]
样品
[0202]
许多样品与本文所公开的简化横向流动装置和方法一致。这些样品例如与本文所公开的用于检测样品内的靶核酸的简化横向流动装置一致，其中简化横向流动装置可包括样品制备区域、用于扩增样品内的靶核酸的任选扩增区域、用于将样品与可编程核酸酶混合的区域、以及用于测定由于简化横向流动装置本身内的可编程核酸酶切割报告物而产生的可检测信号的检测区域。这些样品可包含用于检测病症或物种诸如疾病、病原体或病毒的靶核酸。通常，可以获取来自个体、动物的样品或环境样品以测试病症、疾病、病毒、病原体或任何感兴趣的突变的存在。来自个体的生物样品可以是血液、血清、血浆、唾液、尿液、粘膜样品、腹膜样品、脑脊液、胃分泌物、鼻分泌物、痰、咽分泌物、尿道或阴道分泌物、渗出物、流出物或组织。在应用于本公开的检测系统之前，可以将组织样品解离或液化。来自环境的样品可以来自土壤、空气或水。在一些情况下，环境样品作为拭子取自感兴趣的表面或直接取自感兴趣的表面或环境。在一些情况下，将原始样品施加到检测系统。在一些情况下，样品a)在施加到检测系统之前用缓冲液或流体稀释或浓缩，或者b)在不改变的情况下(即，“直接”)施加到检测系统。有时，样品的含量不超过20ul。在一些情况下，样品的含量不超过1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、200、300、400、500ul、或1ul至500ul的任何值、或由1ul至500ul的任何值界定的范围。有时，样品的含量超过500ul。
[0203]
在一些情况下，样品取自单细胞真核生物体；植物或植物细胞；藻细胞；真菌细胞；动物细胞、组织或器官；来自无脊椎动物的细胞、组织或器官；来自脊椎动物诸如鱼、两栖动物、爬行动物、鸟和哺乳动物的细胞、组织、体液或器官；来自哺乳动物诸如人、非人灵长类动物、有蹄类动物、猫科动物、牛、绵羊和山羊的细胞、组织、体液或器官。在一些情况下，样品取自线虫、原生动物、蠕虫或疟原虫。在一些情况下，样品包含来自真核细胞、哺乳动物细胞、人类细胞、原核细胞或植物细胞的细胞裂解物的核酸。在一些情况下，样品包含由细胞表达的核酸。
[0204]
样品可包含至少一种可以与本文所述试剂的指导核酸结合的靶序列。在一些情况下，靶序列是核酸的一部分。核酸的一部分可以来自基因组基因座、转录的mrna或逆转录的cdna。核酸的一部分的长度可以是5至100、5至90、5至80、5至70、5至60、5至50、5至40、5至30、5至25、5至20、5至15或5至10个核苷酸。核酸的一部分的长度可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、60、70、80、90或100个核苷酸。靶序列可以与指导核酸反向互补。
[0205]
在一些情况下，靶序列是来自病毒或细菌或导致样品中的疾病或病症的其他因子的核酸的一部分。在一些情况下，靶序列是样品中来自性传播感染或传染病的核酸的一部分。在一些情况下，靶序列是样品中来自上呼吸道感染、下呼吸道感染或传染病的核酸的一部分。在一些情况下，靶序列是样品中来自医院获得性感染或传染病的核酸的一部分。在一些情况下，靶序列是ssrna。这些靶序列可以来自疾病，并且该疾病可包括但不限于流感病毒，包括甲型流感病毒(iav)或乙型流感病毒(ibv)、鼻病毒、感冒病毒、呼吸道病毒、上呼吸道病毒、下呼吸道病毒、sars-cov-2或呼吸道合胞病毒。病原体包括病毒、真菌、蠕虫、原生
动物和寄生虫。致病病毒包括但不限于流感病毒等。病原体包括例如结核分枝杆菌、无乳链球菌(streptococcus agalactiae)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、嗜肺军团菌(legionella pneumophila)、酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)、大肠杆菌、脑膜炎奈瑟球菌(neisseria meningitidis)、肺炎球菌(pneumococcus)、乙型流感嗜血杆菌(hemophilus influenzae b)、流感病毒、呼吸道合胞病毒(rsv)、肺炎支原体(m.pneumoniae)、中间链球菌(streptococcus intermdius)、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)和酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)。通常，靶核酸包含来自病毒或细菌或导致可在样品中发现的疾病的其他因子的序列。致病病毒包括但不限于流感病毒；rsv；冠状病毒、ssrna病毒、呼吸道病毒、上呼吸道病毒、下呼吸道病毒或鼻病毒。病原体包括例如结核分枝杆菌、无乳链球菌、嗜肺军团菌、酿脓链球菌、乙型流感嗜血杆菌、流感病毒、呼吸道合胞病毒(rsv)或结核分枝杆菌。
[0206]
在一些情况下，靶核酸可指示癌症(例如，结肠直肠癌、乳腺癌、脑癌或其他癌症)或任何其他疾病的存在。在一些方面，靶核酸可指示感兴趣的特定表型(例如，眼睛或毛发颜色)。在一些方面，靶核酸可指示任何遗传病症或疾病，诸如肌营养不良。在一些方面，本文所公开的横向流动装置可包括允许用户区分感兴趣的靶标的杂合和纯合等位基因的试剂。在一些方面，本文所公开的横向流动装置可以从复合物样品(例如，细胞裂解物、肿瘤活检)中检测感兴趣的靶核酸。在一些方面，本文所公开的横向流动装置可检测来自纯化样品的感兴趣的靶核酸。
[0207]
样品可用于鉴定疾病状态或状况。例如，样品是本文所述的任何样品，并且从受试者获得以用于鉴定受试者的疾病状态。有时，方法包括从受试者获得血清样品并且鉴定受试者的疾病状态或状况。有时，方法包括从受试者获得鼻拭子并且鉴定受试者的疾病状态或状况。
[0208]
在一些情况下，靶核酸是单链核酸。替代地或组合地，靶核酸是双链核酸并且在接触试剂之前或之时制备成单链核酸。靶核酸可以是rna、dna、合成核酸或在生物或环境样品中发现的核酸。靶核酸包括但不限于mrna、rrna、trna、非编码rna、长非编码rna和微rna(mirna)。在一些情况下，靶核酸是mrna。在一些情况下，靶核酸来自本文所述的病毒、寄生虫或细菌。在一些情况下，靶核酸转录自如本文所述的基因。
[0209]
许多靶核酸与本文所公开的方法和组合物一致。本文所述的一些方法可检测以各种浓度或量存在于样品中的靶核酸作为靶核酸群体。在一些情况下，样品具有至少两个拷贝的靶核酸。在一些情况下，样品具有至少3、5、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000个靶核酸拷贝。在一些情况下，该方法检测每101个非靶核酸、102个非靶核酸、103个非靶核酸、104个非靶核酸、105个非靶核酸、106个非靶核酸、107个非靶核酸、108个非靶核酸、109个非靶核酸或10
10
个非靶核酸存在至少一个拷贝的靶核酸。
[0210]
许多靶核酸群体与本文所公开的方法和组合物一致。本文所述的一些方法可检测以各种浓度或量存在于样品中的两个或更多个靶核酸群体。在一些情况下，样品具有至少两个不同的靶核酸群体。在一些情况下，样品具有至少3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50个靶核酸群体。在一些情况下，该方法检测每101个非靶核酸、102个非靶核酸、103个非靶核酸、104个非靶核酸、105个非靶核酸、106个非靶核酸、107个非靶核酸、108个非靶核酸、109个非靶
核酸或10
10
个非靶核酸存在至少一个拷贝的靶核酸群体。靶核酸群体可以不同的浓度或量存在于样品中。
[0211]
任何上文公开的样品与本文所公开的系统、测定和可编程核酸酶一致，并且可用作本文所公开的任何疾病的伴随诊断，或者可用于试剂盒、即时护理诊断或非处方药诊断。
[0212]
应用
[0213]
a.检测靶核酸中的突变
[0214]
本文公开了测定如本文所述的靶核酸的方法，该方法可用于检测靶核酸中的突变。例如，一种测定样品中的靶核酸的方法包括：使样品与包含指导核酸和可编程核酸酶的复合物接触，所述指导核酸包含与靶核酸的区段反向互补的区段，所述可编程核酸酶在形成包含与靶核酸的区段结合的指导核酸的区段的复合物时表现出不依赖于序列的切割；以及测定指示蛋白质-核酸群体中至少一些蛋白质-核酸的切割的信号，其中该信号指示样品中靶核酸的存在，并且其中该信号的不存在指示样品中靶核酸的不存在。信号的检测可以指示靶核酸的存在。有时，靶核酸包含突变。通常，突变是单核苷酸突变。又如，一种测定样品中的靶核酸的方法例如包括：a)使样品与包含指导核酸和可编程核酸酶的复合物接触，所述指导核酸包含与靶核酸的区段反向互补的区段，所述可编程核酸酶在形成包含与靶核酸的区段结合的指导核酸的区段的复合物时表现出不依赖于序列的切割；b)使复合物与底物接触；c)使底物和与切割的底物有差别地反应的试剂接触；以及d)测定指示底物的切割的信号，其中该信号指示样品中靶核酸的存在，并且其中该信号的不存在指示样品中靶核酸的不存在。通常，底物是酶-核酸，并且试剂是酶底物。有时，底物是酶底物-核酸，并且试剂是酶。
[0215]
本文所述的方法可用于鉴定靶核酸中的突变。该方法可用于鉴定影响基因表达的靶核酸的单核苷酸突变。影响基因表达的突变可以是基因内靶核酸的单核苷酸突变、包含与基因表达相关的rna的靶核酸的单核苷酸突变、或包含与基因表达调节相关的核酸的单核苷酸突变的靶核酸，诸如rna或基因的启动子、增强子或阻遏物。通常，突变状态用于诊断或鉴定与靶核酸的突变相关的疾病。具有突变的靶核酸的检测适用于许多领域，诸如临床上、作为诊断、在实验室中作为研究工具以及农业应用。通常，突变是单核苷酸突变。突变可导致病毒的突变株。
[0216]
b.疾病检测
[0217]
本文公开了测定如本文所述的靶核酸的方法，该方法可用于疾病检测。例如，一种测定样品中的靶核酸的方法包括：使样品与包含指导核酸和可编程核酸酶的复合物接触，所述指导核酸包含与靶核酸的区段反向互补的区段，所述可编程核酸酶在形成包含与靶核酸的区段结合的指导核酸的区段的复合物时表现出不依赖于序列的切割；以及测定指示蛋白质-核酸群体中至少一些蛋白质-核酸的切割的信号，其中该信号指示样品中靶核酸的存在，并且其中该信号的不存在指示样品中靶核酸的不存在。信号的检测可以指示靶核酸的存在。有时，靶核酸包含突变。通常，突变是单核苷酸突变。又如，一种测定样品中的靶核酸的方法例如包括：a)使样品与包含指导核酸和可编程核酸酶的复合物接触，所述指导核酸包含与靶核酸的区段反向互补的区段，所述可编程核酸酶在形成包含与靶核酸的区段结合的指导核酸的区段的复合物时表现出不依赖于序列的切割；b)使复合物与底物接触；c)使底物和与切割的底物有差别地反应的试剂接触；以及d)测定指示底物的切割的信号，其中
该信号指示样品中靶核酸的存在，并且其中该信号的不存在指示样品中靶核酸的不存在。通常，底物是酶-核酸。有时，底物是酶底物-核酸。
[0218]
本文所述的方法可用于鉴定来自细菌、病毒或微生物的靶核酸中的突变。该方法可用于鉴定影响基因表达的靶核酸的突变。影响基因表达的突变可以是基因内靶核酸的突变、包含与基因表达相关的rna的靶核酸的突变，或包含与基因表达调节相关的核酸的突变的靶核酸，诸如rna或基因的启动子、增强子或阻遏物。有时，靶核酸突变的状态用于确定细菌、病毒或微生物的致病性或治疗抗性，诸如对抗生素治疗的抗性。通常，突变状态用于诊断或鉴定与细菌、病毒或微生物中靶核酸的突变相关的疾病。通常，突变是单核苷酸突变。
[0219]
c.检测作为研究工具、即时护理或非处方药
[0220]
本文公开了测定如本文所述的靶核酸的方法，其可用作研究工具，并且可作为试剂盒提供。例如，一种测定样品中的靶核酸的方法包括：使样品与包含指导核酸和可编程核酸酶的复合物接触，所述指导核酸包含与靶核酸的区段反向互补的区段，所述可编程核酸酶在形成包含与靶核酸的区段结合的指导核酸的区段的复合物时表现出不依赖于序列的切割；以及测定指示蛋白质-核酸群体中至少一些蛋白质-核酸的切割的信号，其中该信号指示样品中靶核酸的存在，并且其中该信号的不存在指示样品中靶核酸的不存在。信号的检测可以指示靶核酸的存在。有时，靶核酸包含突变。通常，突变是单核苷酸突变。又如，一种测定样品中的靶核酸的方法例如包括：a)使样品与包含指导核酸和可编程核酸酶的复合物接触，所述指导核酸包含与靶核酸的区段反向互补的区段，所述可编程核酸酶在形成包含与靶核酸的区段结合的指导核酸的区段的复合物时表现出不依赖于序列的切割；b)使复合物与底物接触；c)使底物和与切割的底物有差别地反应的试剂接触；以及d)测定指示底物的切割的信号，其中该信号指示样品中靶核酸的存在，并且其中该信号的不存在指示样品中靶核酸的不存在。通常，底物是酶-核酸。有时，底物是酶底物-核酸。
[0221]
如本文所述的方法可用于鉴定靶核酸中的单核苷酸突变。该方法可用于鉴定影响基因表达的靶核酸的突变。影响基因表达的突变可以是基因内靶核酸的单核苷酸突变、包含与基因表达相关的rna的靶核酸的突变，或包含与基因表达调节相关的核酸的突变的靶核酸，诸如rna或基因的启动子、增强子或阻遏物。通常，突变是单核苷酸突变。
[0222]
试剂盒或研究工具可用于在实验室环境中检测任何数量的靶核酸、突变或本文所公开的其他适应症。试剂盒可以作为开盒仪器的试剂包提供。
[0223]
在其他实施方案中，任何系统、测定形式、cas报告物、可编程核酸酶或其他试剂均可用于即时护理(poc)测试，其可在分散的地点诸如医院、医生办公室实验室(pol)或诊所进行。这些即时护理测试可用于诊断本文所公开的任何适应症，或者可用于测量靶核酸(例如，egfr)中特定突变的存在或不存在。poc测试可以作为具有消耗性测试卡的小型仪器提供，其中测试卡是本文所公开的任何测定形式(例如，横向流动测定)。
[0224]
在其他实施方案中，任何系统、测定形式、cas报告物、可编程核酸酶或其他试剂可用于非处方(otc)、无读取器形式，其可用于在远程场所或家中诊断一系列适应症。otc产品可包括消耗性测试卡，其中测试卡是本文所公开的任何测定形式(例如，横向流动测定)。在otc产品中，测试卡可以被可视地或使用移动电话来解释。
[0225]
d.靶标扩增和检测
[0226]
本文所公开的横向流动装置可任选地包括用于扩增的装置和试剂的区域。然而，
不包括用于扩增的区域或试剂的所述横向流动装置的变型也与本公开一致。许多靶标扩增和检测方法与本文所公开的方法、组合物、试剂、酶和试剂盒一致。如本文所述，可使用dna激活的可编程rna核酸酶(例如，cas13)、dna激活的可编程dna核酸酶(例如，cas12)或rna激活的可编程rna核酸酶(例如，cas13)和本文所公开的其他试剂(例如，rna组分)检测靶核酸。可使用detectr
tm
检测靶核酸，如本文所述。靶核酸可以是rna、逆转录的rna、dna、dna扩增子、扩增的dna、合成核酸或在生物或环境样品中发现的核酸。在一些情况下，在检测之前或同时扩增靶核酸。在一些情况下，在扩增之前逆转录靶核酸。可经由靶核酸序列的环介导等温扩增(lamp)来扩增靶核酸。在一些情况下，使用与逆转录偶联的lamp(rt-lamp)扩增靶核酸。lamp扩增可独立地进行(例如，在装置外或在装置的单独室或区域中)，或者lamp扩增可偶联到detectr
tm
以检测靶核酸。rt-lamp扩增可独立地进行，或者rt-lamp扩增可偶联到detectr
tm
以检测靶核酸。detectr
tm
反应可使用与本文所公开的方法一致的任何方法进行。
[0227]
(a)扩增和检测反应混合物
[0228]
在一些实施方案中，lamp扩增反应包含多种引物、dntp和dna聚合酶。lamp可用于在等温条件下以高特异性扩增dna。dna可以是单链dna或双链dna。在一些情况下，可以在lamp扩增之前使用逆转录酶将包含rna的靶核酸逆转录成dna。逆转录反应可包含引物、dntp和逆转录酶。在一些情况下，逆转录反应和lamp扩增反应可以在同一反应中进行。组合的rt-lamp反应可包含lamp引物、逆转录引物、dntp、逆转录酶和dna聚合酶。在一些情况下，lamp引物可包括逆转录引物。
[0229]
检测靶核酸序列的detectr
tm
反应可包含含有与靶核酸的区段反向互补的区段的指导核酸和可编程核酸酶。如本文别处所述，可编程核酸酶在被激活时表现出报告物的不依赖于序列的切割(例如，包含在通过可编程核酸酶切割核酸时变得可检测的部分的核酸)。可编程核酸酶在指导核酸与靶核酸杂交时被激活。组合的lamp detectr
tm
反应可包含多种引物、dntp、dna聚合酶、指导核酸、可编程核酸酶和底物核酸。组合的rt-lamp detectr
tm
反应可包含lamp引物、逆转录引物、dntp、逆转录酶、dna聚合酶、指导核酸、可编程核酸酶和底物核酸。在一些情况下，lamp引物可包括逆转录引物。lamp和detectr
tm
可以在同一样品或反应体积中进行。lamp和detectr
tm
可以在单独的样品或反应体积中或在同一样品体积中同时进行。rt-lamp和detectr
tm
可以在同一样品或反应体积中进行。rt-lamp和detectr
tm
可以在单独的样品或反应体积中或在同一样品体积中同时进行。
[0230]
(b)单核苷酸多态性等位基因的扩增和检测
[0231]
detectr
tm
反应可用于检测样品中特定单核苷酸多态性(snp)等位基因的存在。如本文别处所述，detectr
tm
反应可产生可检测信号，该可检测信号指示包含特定snp等位基因的靶核酸的存在。在不存在靶核酸的情况下或在存在不包含特定snp等位基因或包含不同snp等位基因的核酸序列的情况下，detectr
tm
反应可能不产生信号。在一些情况下，detectr
tm
反应可包含与包含特定snp等位基因的靶核酸序列的一部分反向互补的指导rna。指导rna和包含特定snp等位基因的靶核酸可结合并激活可编程核酸酶，从而产生如本文别处所述的可检测信号。指导rna和不包含特定snp等位基因的核酸序列可以不结合或激活可编程核酸酶，并且可以不产生可检测信号。在一些情况下，可使用例如lamp扩增反应扩增可包含或可不包含特定snp等位基因的靶核酸序列。在一些情况下，lamp扩增反应可与逆转录反应、detectr
tm
反应或两者组合。例如，lamp反应可以是rt-lamp反应、lamp detectr
tm
反应
或rt-lamp detectr
tm
反应。
[0232]
如本文别处所述，detectr
tm
反应可在包含特定snp等位基因的靶核酸序列的存在下特异性地产生可检测信号。例如，detectr
tm
反应可在snp位置处存在包含g核酸的靶核酸的情况下产生可检测信号，但在snp位置处存在包含c、t或a核酸的核酸的情况下不产生可检测信号。detectr
tm
反应可在snp位置处存在包含t核酸的靶核酸的情况下产生可检测信号，但在snp位置处存在包含g、c或a核酸的核酸的情况下不产生可检测信号。detectr
tm
反应可在snp位置处存在包含c核酸的靶核酸的情况下产生可检测信号，但在snp位置处存在包含g、t或a核酸的核酸的情况下不产生可检测信号。detectr
tm
反应可在snp位置处存在包含a核酸的靶核酸的情况下产生可检测信号，但在snp位置处存在包含g、t或c核酸的核酸的情况下不产生可检测信号。除了detectr
tm
反应之外，具有snp的靶核酸可以与lamp或rt-lamp同时地、顺序地、在样品中一起同时地、或在样品中一起顺序地进行。例如，反应可包括lamp和detectr
tm
反应、或rt-lamp和detectr
tm
反应。与在不存在lamp反应的情况下的detectr
tm
反应相比，结合lamp反应进行detectr
tm
反应可导致可检测信号增加。
[0233]
在一些情况下，在存在包含特定snp等位基因的靶核酸的情况下在detectr
tm
反应中产生的可检测信号比在存在不包含特定snp等位基因的核酸的情况下高。在一些情况下，在存在包含特定snp等位基因的靶核酸的情况下detectr
tm
反应产生的可检测信号可以比在存在不包含特定snp等位基因的核酸的情况下产生的可检测信号大至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、最后400倍、至少500倍、至少1000倍、至少2000倍、至少3000倍、至少4000倍、至少5000倍、至少6000倍、至少7000倍、至少8000倍、至少9000倍、至少10000倍、至少50000倍、至少100000倍、至少500000倍或至少1000000倍。在一些情况下，在存在包含特定snp等位基因的靶核酸的情况下detectr
tm
反应产生的可检测信号可以比在存在不包含特定snp等位基因的核酸的情况下产生的可检测信号大1倍至2倍、2倍至3倍、3倍至4倍、4倍至5倍、5倍至10倍、10倍至20倍、20倍至30倍、30倍至40倍、40倍至50倍、50倍至100倍、100倍至500倍、500倍至1000倍、1000倍至10,000倍、10,000倍至100,000倍、或100,000倍至1,000,000倍。
[0234]
detectr
tm
反应可用于检测核酸样品中与疾病或病症相关的snp等位基因的存在。detectr
tm
反应可用于检测核酸样品中与发展疾病或病症的可能性增加相关的snp等位基因的存在。detectr
tm
反应可用于检测核酸样品中与表型相关的snp等位基因的存在。例如，detectr
tm
反应可用于检测与疾病相关的snp等位基因，所述疾病诸如苯丙酮尿症(pku)、囊性纤维化、镰状细胞性贫血、白化病、亨廷顿病、肌强直性营养不良1型、高胆固醇血症、神经纤维瘤病、多囊性肾病、血友病、肌营养不良、低磷性佝偻病、rett综合征或精子生成障碍。detectr
tm
反应可用于检测与癌症风险增加相关的snp等位基因，所述癌症例如膀胱癌、脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、胆囊癌、胃癌、白血病、肝癌、肺癌、口腔癌、食道癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、睾丸癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤或淋巴瘤。detectr
tm
反应可用于检测与疾病风险增加相关的snp等位基因，所述疾病例如阿尔茨海默病、帕金森病、淀粉样变性、血色病、乳糜泻、黄斑变性或高胆固醇血症。detectr
tm
反应可用于检测与表型相关的snp等位基因，所述表型例如眼睛颜色、毛发颜色、身高、皮肤颜色、种族、酒精脸红反应、咖啡因摄取、深度睡眠、遗传体重、乳糖不耐受、肌肉组成、饱和脂肪和体
重、或睡眠运动。
[0235]
其他装置特征
[0236]
a.支持介质
[0237]
许多支持介质与本文所公开的简化横向流动装置和方法一致。这些支持介质例如与本文所公开的用于检测样品内的靶核酸的简化横向流动装置一致，其中简化横向流动装置可包括用于样品制备、任选地扩增样品内的靶核酸、与可编程核酸酶混合、以及检测由简化横向流动装置本身内的可编程核酸酶切割报告物而产生的可检测信号的一个或多个区域。这些支持介质与本文所述的用于检测病痛或病症诸如病毒感染的样品、试剂和简化横向流动装置相容。本文所述的支持介质可提供呈现来自试剂与样品之间的相互作用的结果的方式。支持介质提供以可检测形式呈现可检测信号的介质。任选地，支持介质将可检测信号集中到检测区域中的检测点以提高测定的灵敏度、特异性或准确性。支持介质可以呈现测定的结果并且指示靶核酸所靶向的感兴趣疾病的存在或不存在。支持介质上的结果可通过眼睛或使用机器读取。支持介质有助于稳定支持介质表面上切割的检测分子产生的可检测信号。在一些情况下，支持介质是横向流动测定条。在一些情况下，支持介质是pcr板。pcr板可具有96个孔或384个孔。pcr板可具有96孔板或384孔板的孔的子集数目。96孔pcr板的孔的子集数目为例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95个孔。例如，pcr子集板可具有4个孔，其中孔为来自96孔pcr板的孔的大小(例如，4孔pcr子集板，其中孔为来自96孔pcr板的孔的大小)。384孔pcr板的孔的子集数目为例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、220、240、260、280、300、320、340、360或380个孔。例如，pcr子集板可具有20个孔，其中孔为来自384孔pcr板的孔的大小(例如，20孔pcr子集板，其中孔为来自384孔pcr板的孔的大小)。pcr板或pcr子集板可以与荧光读取器、可见光读取器或其他成像装置配对。通常，成像装置是数码相机，诸如移动装置上的数码相机。移动装置可具有软件程序或移动应用程序，其可以捕获pcr板或pcr子集板的图像，识别正在执行的测定，检测各个孔和其中的样品，提供包含测定的样品的各个孔的图像特性，分析各个孔的内容物的图像特性，并提供结果。
[0238]
支持介质具有至少一个专门的区或区域来呈现可检测信号。所述区域包括样品垫区域、核酸扩增区域、缀合垫区域、检测区域和收集垫区域中的至少一者。在一些情况下，所述区域完全重叠、部分重叠、或串联且仅在区域的边缘处接触，其中区域与其相邻区域流体连通。在一些情况下，支持介质具有位于其他区域上游的样品垫；缀合垫区域，其具有用于特异性标记检测部分的手段；位于样品垫下游的检测区域；以及至少一个基体，其限定与样品垫流体连接的流动路径。在一些情况下，支持介质具有延伸的基底层，各种区或区域置于该基底层的顶部。延伸的基底层可以为这些区或区域提供机械支持。
[0239]
本文描述了提供将样品施加到支持介质上的区的样品垫。样品可通过滴管或移液管在样品垫的顶部，通过将样品倾倒或分配在样品垫区域的顶部，或通过将样品垫浸入容纳样品的试剂室中而施加到支持介质上。样品可在与试剂反应之前被施加到样品垫上，所述反应发生在将试剂置于支持介质上时，或者在施加到样品垫上之前与试剂反应。样品垫区域可以将反应的试剂和样品转移到支持介质的其他区中。反应的试剂和样品的转移可通
过毛细管作用、扩散、对流或通过泵辅助的主动输送来实现。在一些情况下，支持介质与微流体通道集成或被微流体通道覆盖以促进流体输送。
[0240]
滴管或移液管可分配预定体积。在一些情况下，预定体积可在约1μl至约1000μl、约1μl至约500μl、约1μl至约100μl、或约1μl至约50μl的范围内。在一些情况下，预定体积可为至少1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、25μl、50μl、75μl、100μl、250μl、500μl、750μl或1000μl。预定体积可以不超过5μl、10μl、25μl、50μl、75μl、100μl、250μl、500μl、750μl或1000μl。滴管或移液管可以是一次性的或单次使用的。
[0241]
任选地，缓冲液或流体也可施加到样品垫上以帮助驱动样品沿支持介质的运动。在一些情况下，缓冲液或流体的体积可在约1μl至约1000μl、约1μl至约500μl、约1μl至约100μl、或约1μl至约50μl的范围内。在一些情况下，缓冲液或流体的体积可为至少1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、25μl、50μl、75μl、100μl、250μl、500μl、750μl或1000μl。缓冲液或流体的体积可以不超过5μl、10μl、25μl、50μl、75μl、100μl、250μl、500μl、750μl或1000μl。在一些情况下，缓冲液或流体可具有至少1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10的样品与缓冲液或流体的比率。
[0242]
样品垫可以由各种材料制成，这些材料有利于将大部分施加的反应试剂和样品转移到后续区域。样品垫可包括纤维素纤维过滤器、织造网、多孔塑料膜、玻璃纤维过滤器、氧化铝涂覆的膜、硝化纤维素、纸、聚酯过滤器或基于聚合物的基质。用于样品垫区域的材料可以是亲水性的并且具有低非特异性结合。用于样品垫的材料可在约50μm至约1000μm厚、约50μm至约750μm、约50μm至约500μm、或约100μm至约500μm的范围内。
[0243]
样品垫可用化学品处理以改善反应结果在支持介质上的呈现。可处理样品垫以增强样品中核酸的提取，以控制反应的试剂和样品或缀合物向支持介质的其他区域的运输，或者以增强切割的检测部分与缀合物表面上的缀合物结合分子或检测区域中的捕获分子的结合。化学品可包括洗涤剂、表面活性剂、缓冲液、盐、粘度增强剂或多肽。在一些情况下，化学品包括牛血清白蛋白。
[0244]
本文描述了在支持介质上提供区域的缀合垫，该缀合垫包含在其表面上被缀合物结合分子包被的缀合物，所述缀合物结合分子可与来自切割的检测分子的检测部分结合或与对照分子结合。缀合垫可由有利于缀合物结合分子与切割的检测分子上的检测部分结合并随后将大部分缀合物结合的检测部分转移到后续区域的各种材料制成。缀合垫可包含与样品垫或其他区相同的材料或与样品垫不同的材料。缀合垫可包括玻璃纤维过滤器、多孔塑料膜、氧化铝涂覆的膜、纸、纤维素纤维过滤器、织造网、聚酯过滤器或基于聚合物的基质。用于缀合垫区域的材料可以是亲水性的，具有低非特异性结合，或者在缀合垫上具有一致的流体流动特性。在一些情况下，用于缀合垫的材料可在约50μm至约1000μm厚、约50μm至约750μm、约50μm至约500μm、或约100μm至约500μm的范围内。
[0245]
本文还描述了放置在缀合垫上并固定到缀合垫上直到将样品施加到支持介质上的缀合物。缀合物可包含纳米颗粒、金纳米颗粒、乳胶纳米颗粒、量子点、化学发光纳米颗粒、碳纳米颗粒、硒纳米颗粒、荧光纳米颗粒、脂质体或树枝状聚合物。缀合物的表面可以被缀合物结合分子包被，所述缀合物结合分子与切割的检测分子的检测部分结合。
[0246]
本文所述的缀合物结合分子包被缀合物的表面并且可与检测部分结合。缀合物结合分子选择性地与从报告物切割的检测部分结合。一些合适的缀合物结合分子包括抗体、
多肽或单链核酸。在一些情况下，缀合物结合分子结合染料和/或荧光团。与染料或荧光团结合的一些此类缀合物结合分子可猝灭它们的信号。在一些情况下，缀合物结合分子是单克隆抗体。在一些情况下，抗体(也称为免疫球蛋白)包括任何同种型、可变区、恒定区、fc区、fab片段、f(ab')2片段和fab'片段。替代地，缀合物结合分子是特异性结合检测部分的非抗体化合物。有时，缀合物结合分子是可与检测部分结合的多肽。有时，缀合物结合分子是抗生物素蛋白或结合生物素的多肽。有时，缀合物结合分子是结合检测部分的核酸。
[0247]
缀合物的直径可被选择为提供期望的表面积与体积之比。在一些情况下，高表面积与体积之比可允许每总体积缀合物有更多可用于与检测部分结合的缀合物结合分子。在一些情况下，缀合物的直径可在约1nm至约1000nm、约1nm至约500nm、约1nm至约100nm、或约1nm至约50nm的范围内。在一些情况下，缀合物的直径可为至少1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm或1000nm。在一些情况下，缀合物的直径可以不超过1nm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm或1000nm。
[0248]
可调整缀合物结合分子与缀合物的比率以实现缀合物结合分子与检测部分之间的期望结合特性。在一些情况下，缀合物结合分子与缀合物的摩尔比为至少1:1、1:5、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:110、1:120、1:130、1:140、1:150、1:160、1:170、1:180、1:190、1:200、1:250、1:300、1:350、1:400、1:450或1:500。在一些情况下，缀合物结合分子与缀合物的质量比为至少1:1、1:5、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:110、1:120、1:130、1:140、1:150、1:160、1:170、1:180、1:190、1:200、1:250、1:300、1:350、1:400、1:450或1:500。在一些情况下，每个缀合物的缀合物结合分子的数目为至少1、10、50、100、500、1000、5000或10000。
[0249]
缀合物结合分子可通过各种方法与缀合物结合。有时，缀合物结合分子可通过被动结合与缀合物结合。一些此类被动结合包括吸附、吸收、疏水相互作用、静电相互作用、离子结合或表面相互作用。在一些情况下，缀合物结合分子可与缀合物共价结合。有时，通过edc/nhs化学反应或硫醇化学反应促进缀合物结合分子与缀合物的共价键合。
[0250]
本文描述了支持介质上的检测区域，其提供用于向用户或检测装置呈现测定结果的区域。检测区域可由有利于缀合物结合的检测部分从切割的检测分子结合到特异于检测部分的捕获分子的各种材料制成。检测垫可包含与其他区相同的材料或与其他区不同的材料。检测区域可包括硝化纤维素、纸、纤维素、纤维素纤维过滤器、玻璃纤维过滤器、多孔塑料膜、氧化铝涂覆的膜、织造网、聚酯过滤器或基于聚合物的基质。通常，检测区域可包括硝化纤维素。用于区域垫区域的材料可以是亲水性的，具有低非特异性结合，或者在区域垫上具有一致的流体流动特性。用于缀合垫的材料可在约10μm至约1000μm、约10μm至约750μm、约10μm至约500μm、或约10μm至约300μm的范围内。
[0251]
检测区域包括至少一个具有高密度捕获分子的捕获区和至少一个具有高密度阳性对照捕获分子的区，所述捕获分子可与切割的检测分子上的检测部分结合。具有高密度捕获分子或阳性对照捕获分子的捕获区可以是线、圆形、椭圆形、矩形、三角形、加号或任何
其他形状。在一些情况下，检测区域包括多于一个具有高密度的多于一种捕获分子的捕获区，其中每个捕获区包含一种类型的捕获分子，所述捕获分子与切割的检测分子上的一种类型的检测部分或缀合物特异性结合并且与其他捕获区中的捕获分子不同。具有不同捕获分子的捕获区可以完全重叠、部分重叠或彼此在空间上分离。在一些情况下，捕获区可重叠并且产生与各个捕获区产生的可检测信号不同的组合可检测信号。通常，阳性对照点在空间上不同于任何检测点。
[0252]
本文所述的捕获分子与检测部分结合并且固定在检测区域中的检测点上。一些合适的捕获分子包括抗体、多肽或单链核酸。在一些情况下，捕获分子结合染料和/或荧光团。与染料或荧光团结合的一些此类捕获分子可猝灭它们的信号。有时，捕获分子是与染料或荧光团结合可猝灭其信号的抗体。在一些情况下，捕获分子是单克隆抗体。在一些情况下，抗体(也称为免疫球蛋白)包括任何同种型、可变区、恒定区、fc区、fab片段、f(ab')2片段和fab'片段。替代地，捕获分子是特异性结合检测部分的非抗体化合物。有时，捕获分子是可与检测部分结合的多肽。在一些情况下，来自切割的检测分子的检测部分具有与检测部分结合的缀合物，并且缀合物-检测部分复合物可以与特异于检测区域上的检测部分或缀合物的捕获分子结合。有时，捕获分子是可与检测部分结合的多肽。有时，捕获分子是抗生物素蛋白或结合生物素的多肽。有时，捕获分子是结合检测部分的核酸。
[0253]
本文所述的检测区域包括至少一个具有高密度阳性对照捕获分子的区。检测区域中的阳性对照点提供测定的验证和测定完成的确认。如果阳性对照点不能通过本文所述的可视化方法检测到，则该测定无效并且应当用新的系统或试剂盒再次进行。阳性对照捕获分子结合缀合物、缀合物结合分子或检测部分中的至少一者，并且被固定在检测区域中的阳性对照点中。一些合适的阳性对照捕获分子包括抗体、多肽或单链核酸。在一些情况下，阳性对照捕获分子与缀合物结合分子结合。与染料或荧光团结合的一些此类阳性对照捕获分子可猝灭它们的信号。有时，阳性对照捕获分子是与染料或荧光团结合可猝灭其信号的抗体。在一些情况下，阳性对照捕获分子是单克隆抗体。在一些情况下，抗体包括任何同种型、可变区、恒定区、fc区、fab片段、f(ab')2片段和fab'片段。替代地，阳性对照捕获分子是特异性结合检测部分的非抗体化合物。有时，阳性对照捕获分子是可与缀合物、缀合物结合分子或检测部分中的至少一者结合的多肽。在一些情况下，未与检测部分结合的缀合物与特异于缀合物、缀合物结合分子中的至少一者的阳性对照捕获分子结合。
[0254]
本文所述的试剂盒或系统还可包括阳性对照样品以确定可编程核酸酶、指导核酸或单链报告物中的至少一者的活性。通常，阳性对照样品包含与指导核酸结合的靶核酸。阳性对照样品以与测试样品相同的方式与试剂接触，并且使用支持介质可视化。阳性对照样品的阳性对照点和检测点的可视化提供了试剂和测定的验证。
[0255]
本文所述的用于检测靶核酸的试剂盒或系统还可包括对样品进行蛋白酶处理的试剂。可在扩增之前或在测定可检测信号之前用蛋白酶诸如蛋白酶k处理样品。通常，蛋白酶处理不超过15分钟。有时，蛋白酶处理不超过1、5、10、15、20、25、30或更多分钟、或1至30分钟的任何值。
[0256]
本文所述的用于检测靶核酸的试剂盒或系统还包括用于样品中靶核酸的核酸扩增的试剂。等温核酸扩增允许在偏远地区或资源匮乏的环境中使用试剂盒或系统，而无需用于扩增的专门设备。通常，用于核酸扩增的试剂包括重组酶、寡核苷酸引物、单链dna结合
(ssb)蛋白和聚合酶。有时，样品的核酸扩增提高了检测靶核酸的测定的灵敏度、特异性或准确性中的至少一种。在一些情况下，核酸扩增在支持介质上的核酸扩增区中进行。替代地或组合地，在试剂室中进行核酸扩增，并将所得样品施加到支持介质上。有时，核酸扩增是等温核酸扩增。在一些情况下，核酸扩增是转录介导的扩增(tma)。在其他情况下，核酸扩增是解旋酶依赖性扩增(hda)或环状解旋酶依赖性扩增(chda)。在其他情况下，核酸扩增是链置换扩增(sda)。在一些情况下，核酸扩增通过重组酶聚合酶扩增(rpa)进行。在一些情况下，核酸扩增通过环介导扩增(lamp)或指数扩增反应(expar)中的至少一种进行。在一些情况下，核酸扩增是通过滚环扩增(rca)、连接酶链反应(lcr)、简单方法扩增rna靶(smart)、单引物等温扩增(spia)、多重置换扩增(mda)、基于核酸序列的扩增(nasba)、铰链引发的引物依赖性核酸扩增(hip)、切口酶扩增反应(near)或改进的多重置换扩增(imda)。通常，核酸扩增进行不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50或60分钟、或1至60分钟的任何值。有时，核酸扩增反应在约20-45℃的温度下进行。在一些情况下，核酸扩增反应在不高于20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、或20℃至45℃的任何值的温度下进行。在一些情况下，核酸扩增反应在至少20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃或45℃、或20℃至45℃的任何值的温度下进行。
[0257]
有时，执行本文所述方法的总时间不超过3小时、2小时、1小时、50分钟、40分钟、30分钟、20分钟、或3小时至20分钟的任何值。通常，从原始或复合物样品中检测核酸的方法包括蛋白酶处理样品不超过15分钟，扩增(也称为预扩增)样品不超过15分钟，对样品进行可编程核酸酶介导的检测，以及测定核酸酶介导的检测。有时，执行该方法的总时间不超过3小时、2小时、1小时、50分钟、40分钟、30分钟、20分钟、或3小时至20分钟的任何值。通常，蛋白酶处理是蛋白酶k。通常，扩增是热循环扩增。有时，扩增是等温扩增。
[0258]
本文描述了收集垫区域，其提供用于收集沿支持介质流动或从支持介质流动的样品的区域。通常，收集垫被放置在检测区域的下游并且包含吸收性材料。收集垫可通过从支持介质的其他较小体积区域收集和移出样品来增加进入支持介质的样品的总体积。这种增加的体积可用于将未结合的缀合物从检测区域洗去，以降低背景噪声并增强测定灵敏度。当支持介质的设计不包括收集垫时，在支持介质中分析的样品的体积可以由支持介质的床体积决定。收集垫可提供用于过量或耗尽的样品体积的贮存器，并且可有助于为样品沿支持介质的流动提供毛细作用力。
[0259]
收集垫可以由高吸收性并且能够保持流体的各种材料制备。通常，收集垫包括纤维素过滤器。在一些情况下，收集垫包括纤维素、棉、织造网、基于聚合物的基质。可调节收集垫的尺寸，通常是收集垫的长度，以改变支持介质所吸收的总体积。
[0260]
本文所述的支持介质可具有围绕支持介质边缘的屏障。通常，该屏障是疏水性屏障，其有利于将样品保持在支持介质内或使样品在支持介质内流动。通常，样品在疏水性屏障中的运输速率比通过支持介质区域的运输速率低得多。在一些情况下，疏水性屏障通过在支持介质的边缘周围接触疏水性材料来制备。有时，疏水性屏障包含蜡、聚二甲基硅氧烷、橡胶或有机硅中的至少一种。
[0261]
可用化学品处理支持介质上的任何区域，以改善支持介质上的检测点和阳性对照点的可视化。可处理这些区域以增强样品中核酸的提取，以控制反应的试剂和样品或缀合物向支持介质的其他区域的运输，或者以增强切割的检测部分与缀合物表面上的缀合物结
合分子或检测区域中的捕获分子的结合。化学品可包括洗涤剂、表面活性剂、缓冲液、盐、粘度增强剂或多肽。在一些情况下，化学品包括牛血清白蛋白。在一些情况下，化学品或物理试剂增强样品的流动，并且在区域的宽度上具有更均匀的流动。在一些情况下，化学品或物理试剂在区域的宽度上提供样品的更均匀的混合。在一些情况下，化学品或物理试剂将流速控制得更快或更慢以改善测定的性能。有时，测定的性能通过更短的测定时间、更长的切割活性持续时间、更长或更短的与缀合物的结合时间、灵敏度、特异性或准确性中的至少一者来测量。
[0262]
b.壳体或外壳
[0263]
如本文所述的支持介质可以与本文所公开的简化横向流动装置和方法一致的多种方式容纳或封闭。用于支持介质的外壳例如与本文所公开的用于检测样品内的靶核酸的简化横向流动装置一致。例如，简化横向流动装置可包括将流体流从一个室引导到另一个室的支持介质，并且其中整个简化横向流动装置被封装在本文所述的外壳或壳体内。通常，本文所述的支持介质被封装在外壳中，以保护支持介质免受污染和有意或无意的拆卸。外壳可以由多于一个部件制成，并且被组装以封装支持介质。在一些情况下，单个外壳可以封装多于一个支持介质。外壳可以由纸板、塑料、聚合物或为支持介质提供机械保护的材料制成。通常，用于外壳的材料是惰性的或不与支持介质或置于支持介质上的试剂反应。外壳可具有上部，当处于适当位置时，该上部暴露样品垫以接收样品，并且在检测区域上方具有开口或窗口以允许读取横向流动测定的结果。外壳可以在其内表面上具有导向销，该导向销围绕支持介质放置在支持介质上，以帮助将隔室和支持介质固定在外壳内的适当位置。在一些情况下，外壳封装整个支持介质。替代地，支持介质的样品垫未被封装并且被暴露以便于接收样品，而支持介质的其余部分被封装在外壳中。
[0264]
外壳和封装在外壳内的支持介质的尺寸可被设定成小型的、薄型的、便携式的和/或手持式的。外壳和支持介质的小尺寸将便于在偏远地区和/或资源匮乏的环境中运输和使用测定。在一些情况下，外壳的长度不超过30cm、25cm、20cm、15cm、10cm或5cm。在一些情况下，外壳的长度为至少1cm、5cm、10cm、15cm、20cm、25cm或30cm。在一些情况下，外壳的宽度不超过30cm、25cm、20cm、15cm、10cm、5cm、4cm、3cm、2cm或1cm。在一些情况下，外壳的宽度为至少1cm、2cm、3cm、4cm、5cm、10cm、15cm、20cm、25cm或30cm。在一些情况下，外壳的高度不超过10cm、9cm、8cm、7cm、6cm、5cm、4cm、3cm、2cm或1cm。在一些情况下，外壳的高度为至少1cm、2cm、3cm、4cm、5cm、6cm、7cm、8cm、9cm或10cm。通常，外壳为矩形。
[0265]
在一些情况下，外壳在上盖的外表面上提供附加信息，以便于识别测试类型、可视化检测区域和分析结果。上部外壳可具有识别标签，包括但不限于条形码、qr码、识别标签或其他视觉上可识别的标签。在一些情况下，识别标签通过移动装置上的相机成像，并且分析图像以识别正在测试的疾病。正确识别测试对于准确可视化和分析结果很重要。在一些情况下，上部外壳具有用于定向检测区域以将阳性对照点与检测点区分开的基准标记。在一些情况下，上部外壳具有颜色参考指导。当用颜色参考指导对检测区域成像时，可将使用基准标记定位的检测点与阳性对照点和颜色参考指导进行比较，以确定检测点的各种图像特性，诸如点的颜色、颜色强度和尺寸。在一些情况下，颜色参考指导具有红色、绿色、蓝色、黑色和白色。在一些情况下，与颜色参考指导中的至少两种参考颜色进行比较，检测点的图像可归一化为颜色参考指导中的至少一种参考颜色，并且生成检测点的值。有时，与至少两
种参考颜色的比较是与标准参考色标的比较。在一些情况下，检测点的图像在分析之前经历变换或滤波。检测点的图像特性的分析可提供关于由测定靶向的靶核酸的存在或不存在和与靶核酸相关的疾病的信息。在一些情况下，该分析提供样品中存在或不存在靶核酸的定性结果。在一些情况下，该分析提供样品中存在的靶核酸水平的半定量或定量结果。可通过在点/孔中具有一组标准物并将测试样品与标准物范围进行比较来进行定量。更加半定量的方法可通过计算彼此比较的2个点/孔的颜色强度并测量一个点/孔是否比另一个更强来进行。有时，定量是循环核酸的定量。循环核酸可包含靶核酸。例如，循环核酸定量的方法包括测定样品的第一等分试样中的循环核酸的靶核酸，测定样品的第二等分试样中的对照核酸，并且通过测量由报告物的切割产生的信号来定量第一等分试样中的靶核酸靶标。有时，循环rna定量的方法包括测定样品的第一等分试样中的循环rna的靶核酸，测定样品的第二等分试样中的对照核酸，并且通过测量由报告物的切割产生的信号来定量第一等分试样中的靶核酸靶标。通常，输出包括荧光/秒。有时，反应速率对于输出信号和靶核酸浓度是对数线性的。在一些情况下，信号输出与靶核酸浓度相关。有时，循环核酸是dna。
[0266]
c.检测/可视化装置
[0267]
许多检测或可视化装置和方法与本文所公开的简化横向流动装置和方法一致。检测/可视化的方法例如与本文所公开的用于检测样品内的靶核酸的简化横向流动装置一致。例如，简化横向流动装置可包括孵育和检测室或独立的检测室，其中产生比色信号、荧光信号、电化学信号或电化学发光信号用于检测/可视化。有时，被产生用于检测的信号是量热信号、电位信号、电流信号、光信号(例如，荧光信号、比色信号等)或压电信号。通常，量热信号是在报告物的切割后产生的热量。有时，量热信号是在报告物的切割后吸收的热量。例如，电位信号是在报告物的切割后产生的电位。电流信号可以是在报告物的切割后产生的电子的运动。通常，信号是光信号，诸如比色信号或荧光信号。例如，光信号是在报告物的切割后产生的光输出。有时，光信号是在报告物的切割前后之间的光吸收变化。通常，压电信号是在报告物的切割前后之间的质量变化。有时，报告物是蛋白质-核酸。通常，蛋白质-核酸是酶-核酸。可使用各种方法分析检测/可视化，如下文进一步所述。来自完成的测定的检测区域的结果可以各种方式可视化和分析。在一些情况下，检测区域中的阳性对照点和检测点是肉眼可见的，并且结果可以由用户读取。在一些情况下，检测区域中的阳性对照点和检测点通过成像装置可视化。通常，成像装置是数码相机，诸如移动装置上的数码相机。移动装置可具有软件程序或移动应用程序，其可以捕获支持介质的图像，识别正在执行的测定，检测检测区域和检测点，提供检测点的图像特性，分析检测点的图像特性并且提供结果。替代地或组合地，成像装置可以捕获荧光、紫外(uv)、红外(ir)或可见波长信号。成像装置可以具有激发源以提供激发能量并捕获发射的信号。在一些情况下，激发源可以是相机闪光灯和任选的滤光器。在一些情况下，成像装置与放置在支持介质上的成像盒一起使用以产生暗室，从而改善成像。成像盒可以是成像装置可以在成像之前装入的纸板盒。在一些情况下，成像盒具有光学透镜、反射镜、滤光器或其他光学元件，以帮助产生更聚焦的激发信号或捕获更聚焦的发射信号。通常，成像盒和成像装置是小型的、手持式的和便携式的，以便于在远程或资源匮乏的环境中运输和使用测定。
[0268]
本文所述的测定可以通过移动应用程序(app)或软件程序进行可视化和分析。使用应用程序或程序的图形用户界面(gui)，个人可以使用移动装置上的相机拍摄支持介质
的图像，包括外壳上的检测区域、条形码、参考色标和基准标记。程序或应用程序读取测试类型的条形码或可识别标签，定位基准标记以定向样品，并读取可检测信号，与参考色栅进行比较，并确定靶核酸的存在或不存在，其指示基因、病毒或导致疾病的因子的存在。移动应用程序可以向个人呈现测试的结果。移动应用程序可以将测试结果存储在移动应用程序中。移动应用程序可以与远程装置通信并传送测试结果的数据。测试结果可以由另一个人(包括医疗保健专业人员)从远程装置远程查看。远程用户可以访问结果并使用该信息来推荐治疗、干预、环境清理的行动。
[0269]
旋通过滤装置
[0270]
本文描述了用于基于可编程核酸酶的检测的各种装置，其防止污染并利用如图20所示的旋通测定。在一些实施方案中，旋通过滤装置包括：外壳，该外壳包含基于可编程核酸酶的检测试剂、扩增试剂和样品，其中检测试剂通过过滤器与包含扩增试剂和样品的混合物物理分离，其中过滤器被构造成保持检测试剂与混合物之间的分离，直到外壳被离心，从而允许样品被扩增试剂扩增；其中过滤器被构造成在将外壳离心时促进检测试剂转移到混合物中；并且其中外壳被构造成允许由混合物产生的一个或多个信号可视化。在一些实施方案中，外壳包含被构造成允许荧光穿过其中的透明或半透明材料。在一些实施方案中，外壳包含被构造成允许可见光穿过其中的透明或半透明材料。
[0271]
多路复用
[0272]
本文所述的简化横向流动装置和方法可以多种方式多路复用。这些多路复用方法例如与本文所公开的用于检测样品中的靶核酸的简化横向流动装置一致。
[0273]
与本公开一致的方法包括测定样品中的两种或更多种靶核酸的多路复用方法。一种多路复用方法包括：使样品与包含指导核酸和可编程核酸酶的复合物接触，所述指导核酸包含与靶核酸的区段反向互补的区段，所述可编程核酸酶在形成包含与靶核酸的区段结合的指导核酸的区段的复合物时表现出不依赖于序列的切割；以及测定指示蛋白质-核酸群体中至少一些蛋白质-核酸的切割的信号，其中该信号指示样品中靶核酸的存在，并且其中该信号的不存在指示样品中靶核酸的不存在。又如，一种测定样品中的靶核酸的多路复用方法例如包括：a)使样品与包含指导核酸和可编程核酸酶的复合物接触，所述指导核酸包含与靶核酸的区段反向互补的区段，所述可编程核酸酶在形成包含与靶核酸的区段结合的指导核酸的区段的复合物时表现出不依赖于序列的切割；b)使复合物与底物接触；c)使底物和与切割的底物有差别地反应的试剂接触；以及d)测定指示底物的切割的信号，其中该信号指示样品中靶核酸的存在，并且其中该信号的不存在指示样品中靶核酸的不存在。通常，底物是酶-核酸。有时，底物是酶底物-核酸。
[0274]
多路复用可以是空间多路复用，其中同时从同一样品中检测多种不同的靶核酸，但反应在空间上是分开的。通常，使用相同的可编程核酸酶，但使用不同的指导核酸来检测多种靶核酸。有时使用不同的可编程核酸酶检测多种靶核酸。有时，多路复用可以是单反应多路复用，其中在单个反应体积中检测多种不同的靶酸。通常，在单反应多路复用中使用至少两种不同的可编程核酸酶。例如，可通过将多种类型的报告物固定在简化横向流动装置内来实现多路复用，从而能够在单个简化横向流动装置内检测多种靶核酸。多路复用允许在一个试剂盒或系统中检测多种靶核酸。在一些情况下，多种靶核酸包含与病毒不同的靶核酸。在一些情况下，多种靶核酸包含与至少第一疾病和第二疾病相关的不同靶核酸。针对
一种疾病的多路复用增加了检测样品中疾病存在的测定的灵敏度、特异性或准确性中的至少一种。在一些情况下，多种靶核酸包括针对导致一种以上疾病的不同病毒、细菌或病原体的靶核酸。在一些情况下，多路复用允许区分多种靶核酸，诸如包含导致疾病的相同细菌或病原体的不同基因型的靶核酸，例如细菌或病原体的野生型基因型和包含突变的细菌或病原体的基因型，诸如可赋予对治疗(诸如抗生素治疗)的抗性的单核苷酸多态性(snp)。例如，多路复用包括测定的方法，该方法包括使用第一可编程核酸酶对微生物物种和使用第二可编程核酸酶对微生物中的抗生素抗性模式进行单一测定。多路复用允许区分不同流感毒株例如甲型流感和乙型流感的多种靶核酸。通常，多路复用允许区分多种靶核酸，诸如包含不同基因型的靶核酸，例如野生型基因型和突变(例如，snp)基因型。多种病毒感染的多路复用可提供测试来自单个样品的一组疾病的能力。例如，多种疾病的多路复用在对新患者进行广泛的小组测试或流行病学调查中可能很有价值。通常，多路复用用于鉴定败血症或与多种病原体相关的其他疾病中的细菌病原体。
[0275]
此外，可以定量来自多路复用的信号。例如，疾病组的定量方法包括测定来自样品的多个等分试样中的多种独特靶核酸，测定样品的另一等分试样中的对照核酸对照，并且通过测量与第二等分试样中产生的信号相比由报告物的切割产生的信号来定量多种独特靶核酸的多个信号。通常，多种独特靶核酸来自样品中的多种病毒。有时，多个信号的定量与产生多个信号的多种独特靶核酸的多种独特靶核酸的浓度相关。疾病组可用于任何疾病。
[0276]
本文所述的简化横向流动装置和方法可通过试剂和支持介质的各种配置进行多路复用。在一些情况下，试剂盒或系统被设计成具有封装在单个外壳中的多个支持介质。有时，容纳在单个外壳中的多个支持介质共享单个样品垫。单个样品垫可以以各种设计诸如分支或径向形式连接到支持介质。替代地，多个支持介质中的每一个均具有其自己的样品垫。在一些情况下，试剂盒或系统被设计成具有封装在外壳中的单个支持介质，其中支持介质包括用于检测多种靶核酸的多个检测点。有时，用于多路复用测定的试剂包括多种指导核酸、多种可编程核酸酶和多种单链报告物，其中指导核酸中的一种、可编程核酸酶中的一种和单链报告物中的一种的组合检测一种靶核酸并且可以在检测区域上提供检测点。在一些情况下，将指导核酸、可编程核酸酶和被配置为检测一种靶核酸的单链报告物的组合与至少一种其他组合在单个试剂室中混合。在一些情况下，将指导核酸、可编程核酸酶和被配置为检测一种靶核酸的单链报告物的组合与至少一种其他试剂组合在单个支持介质上混合。当这些试剂组合与样品接触时，多种靶核酸的反应在同一介质或试剂室中同时发生。有时，将该反应的样品施加到本文所述的多路复用支持介质上。
[0277]
在一些情况下，将指导核酸、可编程核酸酶和被配置为检测一种靶核酸的单链报告物的组合提供在其自身的试剂室或其自身的支持介质中。在这种情况下，在装置、试剂盒或系统中提供多个试剂室或支持介质，其中一个试剂室被设计成检测一种靶核酸。在这种情况下，使用多种支持介质来检测该组病毒感染或其他感兴趣的疾病。
[0278]
在一些情况下，多路复用简化横向流动装置和方法在单个反应中检测至少2种不同的靶核酸。在一些情况下，多路复用简化横向流动装置和方法在单个反应中检测至少3种不同的靶核酸。在一些情况下，多路复用简化横向流动装置和方法在单个反应中检测至少4种不同的靶核酸。在一些情况下，多路复用简化横向流动装置和方法在单个反应中检测至
少5种不同的靶核酸。在一些情况下，多路复用简化横向流动装置和方法在单个反应中检测至少6、7、8、9或10种不同的靶核酸。在一些情况下，多路复用试剂盒在单个试剂盒中检测至少2种不同的靶核酸。在一些情况下，多路复用试剂盒在单个试剂盒中检测至少3种不同的靶核酸。在一些情况下，多路复用试剂盒在单个试剂盒中检测至少4种不同的靶核酸。在一些情况下，多路复用试剂盒在单个试剂盒中检测至少5种不同的靶核酸。在一些情况下，多路复用试剂盒在单个试剂盒中检测至少6、7、8、9或10种不同的靶核酸。
[0279]
制造
[0280]
支持介质可以用多种材料和试剂组装。可将试剂分配或涂覆到支持介质材料的表面上。支持介质的材料可以层压到背衬卡上，并且背衬卡可以被单一化或切割成单独的测试条。装置可通过完全手动的分批式加工；或完全自动化的在线连续方法；或两种加工方法的混合来制造。分批方法可以从用于支持介质的每种材料的片材或卷材开始。支持介质的各个区可以独立地加工以用于分配和干燥，并且最终的支持介质可以与独立制备的区组装并切割。与可具有较高设备成本的更自动化的在线加工相比，分批加工方案可具有较低的设备成本和较高的劳动力成本。在一些情况下，由于减少的资本投资，分批加工对于低量生产可以是优选的。在一些情况下，由于减少的生产时间，自动在线加工对于大量生产可以是优选的。两种方法都可以扩展到生产水平。
[0281]
在一些情况下，使用各种仪器制备支持介质，所述仪器包括具有分配器的xyz方向运动系统、浸渍槽、干燥烘箱、手动或半自动层压机、以及用于将卷料或片料减小到适于层压的长度和宽度的切割方法。为了分配用于缀合区的缀合物结合分子和用于检测区的捕获分子，可使用具有分配器的xyz方向运动系统。在一些实施方案中，分配器可通过接触方法或非接触方法分配。
[0282]
在支持介质的自动或半自动制备中，支持介质可以由用于每个区域的膜卷制备，所述膜卷被排序成最终的组装顺序并从卷展开。例如，膜可以从左到右从样品垫区域到收集垫区域排序，其中一个膜对应于支持介质上的区域，全部位于粘合剂卡片纸料上。分配器将试剂、缀合物、检测分子和用于膜的其他处理物置于膜上。通过在低湿度室中加热或通过冷冻干燥将分配的流体干燥到膜上以稳定分配的分子。将膜切割成条并置于外壳或壳体中并包装。
[0283]
试剂盒
[0284]
本文公开了用于检测靶核酸的简化横向流动装置的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含至少一种本文所述的试剂和支持介质。可以在试剂室中或在支持介质上提供试剂。替代地，试剂可以由使用试剂盒的个体置于试剂室或支持介质中。任选地，试剂盒还包括缓冲液和滴管。试剂室是测试孔或容器。试剂室的开口可以足够大以容纳支持介质。缓冲液可以提供在滴瓶中以便于分配。滴管可以是一次性的并转移固定体积。滴管可用于将样品置于试剂室内或支持介质上。
[0285]
在一些实施方案中，一种用于检测靶核酸的试剂盒包括：支持介质；靶向靶核酸区段的指导核酸；可编程核酸酶，该可编程核酸酶能够在与指导核酸和靶核酸区段复合时被激活；以及包含检测部分的单链报告物，其中报告物能够被激活的核酸酶切割，从而产生第一可检测信号。
[0286]
在一些实施方案中，一种用于检测靶核酸的试剂盒包括：pcr板；靶向靶核酸区段
的指导核酸；可编程核酸酶，该可编程核酸酶能够在与指导核酸和靶核酸区段复合时被激活；以及包含检测部分的单链报告物，其中报告物能够被激活的核酸酶切割，从而产生第一可检测信号。pcr板的孔可以用靶向靶核酸区段的指导核酸、能够在与指导核酸和靶序列复合时被激活的可编程核酸酶以及至少一个包含检测部分的单链报告物群体进行预等分。因此，用户可以将感兴趣的生物样品添加到预等分的pcr板的孔中，并用荧光读数器或可见光读数器测量可检测的信号。
[0287]
在一些情况下，这样的试剂盒可包括包装、载体或容器，其被隔开以容纳一个或多个容器，诸如小瓶、管等，每个容器包括在本文所述的方法中使用的单独元件之一。合适的容器包括例如测试孔、瓶子、小瓶和试管。在一个实施方案中，容器由多种材料诸如玻璃、塑料或聚合物形成。
[0288]
本文所述的试剂盒或系统含有包装材料。包装材料的示例包括但不限于小袋、泡罩包装、瓶子、管、袋、容器、瓶子和适合于预期使用模式的任何包装材料。
[0289]
试剂盒通常包括列出内容物和/或使用说明书的标签，以及带有使用说明的包装插页。通常还包括一组说明。在一个实施方案中，标签在容器上或与容器相关联。在一些情况下，当形成标签的字母、数字或其他字符被附着、模制或蚀刻到容器本身中时，标签在容器上；当标签存在于也容纳容器的容器或载体内时，标签与容器相关联，例如作为包装插页。在一个实施方案中，标签用于指示内容物用于特定的治疗应用。标签还指示内容物的使用说明，诸如在本文所述的方法中。
[0290]
在包装形成的产品并包装或装盒以保持无菌屏障后，可以通过热灭菌、气体灭菌、γ辐射或电子束灭菌对产品进行最终灭菌。替代地，可以通过无菌处理制备和包装来产品。
[0291]
稳定性
[0292]
本文公开了用于上述方法的试剂和可编程核酸酶系统的稳定组合物。本文所述的试剂和可编程核酸酶系统在包括冷藏、环境和加速条件的各种储存条件下可以是稳定的。本文公开了稳定试剂。可测量试剂和可编程核酸酶系统本身或存在于支持介质上的试剂和可编程核酸酶系统的稳定性。
[0293]
在一些情况下，如本文所用的稳定是指试剂在给定储存期结束时具有约5％w/w或更少的总杂质。稳定性可通过hplc或任何其他已知的测试方法来评估。稳定试剂可在给定储存期结束时具有约10％w/w、约5％w/w、约4％w/w、约3％w/w、约2％w/w、约1％w/w或约0.5％w/w的总杂质。
[0294]
在一些实施方案中，如本文所用的稳定是指试剂和可编程核酸酶系统在给定储存期结束时和在给定储存条件下具有约10％或更少的检测活性损失。检测活性可使用已知方法通过已知阳性样品评估。替代地或组合地，检测活性可通过灵敏度、准确性或特异性来评估。在一些实施方案中，稳定试剂在给定储存期结束时具有约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％或约0.5％的检测活性损失。
[0295]
在一些实施方案中，稳定组合物在给定的储存期结束时和在给定储存条件下具有零检测活性损失。给定储存条件可包括等于或小于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％相对湿度的湿度。受控储存环境可包括0％至50％相对湿度、0％至40％相对湿度、0％至30％相对湿度、0％至20％相对湿度或0％至10％相对湿度的湿度。受控储存环境可包括-100℃、-80℃、-20℃、4℃、约25℃(室温)或40℃的温度。受控储存环境
可包括介于-80℃与25℃之间、或-100℃与40℃之间的温度。受控储存环境可保护系统或试剂盒免受光或机械损坏。受控储存环境可以是消过毒的或无菌的或保持光导管的无菌性。受控储存环境可以是无菌的或消过毒的。
[0296]
试剂盒或系统可被包装以在使用前储存延长的时间段。试剂盒或系统可被包装以避免试剂盒或系统的降解。包装可包括干燥剂或其他试剂以控制包装内的湿度。包装可保护试剂盒或系统免受机械损坏或热损坏。包装可保护试剂盒或系统免受试剂和可编程核酸酶系统的污染。试剂盒或系统可以在与导致试剂的高稳定性或试剂活性的很少损失的储存条件类似的条件下运输。包装可被构造成提供和保持试剂盒或系统的无菌性。试剂盒或系统可与标准制造和运输操作相容。
[0297]
本文描述了基于可编程核酸酶的即时需求(pon)装置的各种实施方案。在一些实施方案中，pon装置被构造用于如图21所示的5重呼吸面板。图21示出了用于病毒检测的在分立区域中包含池化的crispr-cas复合物的pon 5重面板的示例性测定设计。分立区域用于检测：(1)sars-cov-2，(2)甲型流感，(3)乙型流感，(4)pan-cov，以及(5)内源性人对照。(1)sars-cov-2区域包含用于检测n-基因靶标和e-基因靶标的grna，(2)甲型流感区域包含用于检测h1n1靶标、h3n2靶标和h1n1 pdm2009靶标的grna，(3)乙型流感区域包含用于检测yamagata靶标和victoria靶标的grna，(4)pan-cov区域包含用于检测hcov-oc43靶标、hcov-nl63靶标、hcov-229e靶标和hcov-hku1靶标的grna，并且(5)内源性人对照区域包含用于人rpp30靶标的grna。每个区域可包含池化的grna。例如，甲型流感区域的grna与h1n1、h3n2和h1n1 pdm2009中98％保守的靶位点结合，诸如基质蛋白1(mp)、非结构蛋白1(ns)、神经氨酸酶(na)、核蛋白(np)、血凝素(ha)、pb1、聚合酶酸性蛋白(pa)和聚合酶碱性蛋白2(pb2)。来自每个区域的检测信号可指示在该区域内检测到靶标。在一些实施方案中，基于可编程核酸酶的pon装置是一次性的，如图22所示。
[0298]
基于多路复用detectr
tm
测定的横向流动测定
[0299]
在此描述了用于如图23所示的基于detectr
tm
测定的多路复用横向流动条的各种装置和方法。在一些实施方案中，报告物(2301)被固定到固体支持物的表面(2300)上。在一些实施方案中，可编程核酸酶(例如，cas-复合物)探针(2307)并固定到表面(2300)上。在一些实施方案中，可编程核酸酶探针(2307)包含指导核酸，诸如单一指导rna(sgrna)(2308)。在一些实施方案中，可编程核酸酶探针(2307)包含sgrna(2308)，其被设计为样品的靶核酸的互补物。在一些实施方案中，可编程核酸酶探针(2307)和报告物(2301)均被固定到表面(2300)上。在一些实施方案中，可编程核酸酶探针(2307)和报告物(2301)均以足够接近的方式固定到表面(2300)上，使得报告物(2301)可被可编程核酸酶探针(2307)的可编程核酸酶切割。在一些实施方案中，可编程核酸酶探针(2307)和报告物(2301)均以足够接近的方式固定到表面(2300)上，使得当靶核酸和sgrna(2308)互补时，报告物(2301)可以在靶核酸与可编程核酸酶探针(2307)的sgrna(2308)结合时被可编程核酸酶探针(2307)的可编程核酸酶切割(2309)。在这样的实施方案中，这指示靶标的存在并且是靶标的“命中”。在一些实施方案中，与可编程核酸酶探针(2307)的sgrna(2308)互补的靶核酸的结合导致可编程核酸酶探针(2307)的可编程核酸酶在足够接近可编程核酸酶的范围内引发核酸的切割。在一些实施方案中，表面(2300)在孔的底部。在一些实施方案中，第一可编程核酸酶探针(2307)和第一报告物(2301)的集合被固定到表面(2300)的一个位置处的表面上。
[0300]
在一些实施方案中，如图23a所示，报告物(2301)包含表面接头(2302)、核酸(2303)、第二接头(2306)、检测部分(例如，标记物)(2304)和亲和分子(例如，结合部分)(2305)。在一些实施方案中，结合部分(2305)是生物素。在一些实施方案中，同一报告物(2301)的多于一个拷贝被固定到表面上。
[0301]
在一些实施方案中，横向流动测定条(2310)用于检测切割的报告物(2309)。在一些实施方案中，切割的报告物(2309)与横向流动条(2310)的样品垫(2311)接触。在一些实施方案中，切割的报告物(2309)与存在于样品垫中的缀合物颗粒结合。在一些实施方案中，缀合物颗粒是金纳米颗粒。在一些实施方案中，金纳米颗粒用抗生物素官能化。在一些实施方案中，抗生物素官能化金纳米颗粒与在结合部分(2305)中含有一个或多个生物素的切割的报告物结合。
[0302]
在一些实施方案中，报告物包含第二接头。在一些实施方案中，第二接头将一个或多个结合部分连接至核酸。在一些实施方案中，第二接头将一种或多种标记物连接至核酸。在一些实施方案中，第二接头将一个或多个结合部分和一种或多种标记物连接至报告物的核酸。在一些实施方案中，报告物是树枝状聚合物或三重物(trebler)分子。
[0303]
在一些实施方案中，报告物包含标记物。在一些实施方案中，标记物是fitc、dig、tamra、cy5、af594、cy3或用于横向流动测定的任何适当的标记物。
[0304]
在一些实施方案中，报告物包含用于结合的化学官能团。在一些实施方案中，化学官能团是生物素。在一些实施方案中，化学官能团与流动捕获探针(例如，缀合物颗粒或捕获分子)上的捕获探针互补。在一些实施方案中，流动捕获探针是用抗生物素官能化的金纳米颗粒。在一些实施方案中，流动捕获探针位于样品垫中。在一些实施方案中，流动捕获探针位于与样品垫接触的缀合垫中，其中两个横向流动测定条均包括样品垫和缀合垫，另外其中样品垫和缀合垫均与检测区域流体连通。
[0305]
在一些实施方案中，横向流动测定条(2310)包括检测区域(2312)。在一些实施方案中，检测区域(2312)包括一个或多个检测点。在一些实施方案中，检测点包含固定捕获探针(例如，捕获分子)。在一些实施方案中，固定捕获探针包含一种或多种捕获抗体。在一些实施方案中，捕获抗体是抗fitc、抗dig、抗tamra、抗cy5、抗af594或能够结合检测部分或缀合物的任何其他适当的捕获抗体。
[0306]
在一些实施方案中，包含fitc的流动捕获探针被包含抗fitc抗体的固定捕获探针捕获。在一些实施方案中，包含tamra的流动捕获探针被包含抗tamra抗体的固定捕获探针捕获。在一些实施方案中，包含dig的流动捕获探针被包含抗dig抗体的固定捕获探针捕获。在一些实施方案中，包含cy5的流动捕获探针被包含抗cy5抗体的固定捕获探针捕获。在一些实施方案中，包含af574的流动捕获探针被包含抗af594抗体的固定捕获探针捕获。
[0307]
在一些实施方案中，横向流动测定条(2310)包括对照线(2314)。在一些实施方案中，对照线(2314)包含与所有流动捕获探针互补的抗igg。在一些实施方案中，当流动捕获探针不与报告物结合时，流动捕获探针将被对照线上的抗igg捕获，从而为用户确保装置正常工作，即使未从测试线读出信号。
[0308]
在一些实施方案中，横向流动测定条(2310)包括样品垫。在一些实施方案中，流动捕获探针包含抗生物素。在一些实施方案中，流动捕获探针包含hrp。在一些实施方案中，流动捕获探针包含hrp-抗生物素。在一些实施方案中，流动捕获探针是hrp-抗生物素dab/
tmb。
[0309]
在此描述了用于如图24所示的基于detectr
tm
测定的多路复用横向流动条的各种装置和方法。图24描绘了在横向流动测定条上读出的detectr
tm
测定的非限制性示例性工作流程。在一些实施方案中，样品(2401)包含一个或多个靶核酸序列。在一些实施方案中，样品(2401)(例如，样品溶液)包含至少第一和第二靶核酸序列。在一些实施方案中，样品(2401)被引入孔(2402)(例如，d1-d5)中，其中在一个或多个位置处存在固定到孔的表面上的不同指导核酸，诸如sgrna。在一些实施方案中，sgrna是被固定到表面上的可编程核酸酶探针的一部分。在一些实施方案中，sgrna被设计成与样品中的靶核酸特异性结合。在一些实施方案中，存在对应于孔表面上的不同位置(例如，位置d1-d5)的不同sgrna，其中每种不同的sgrna与可存在或可不存在于样品中的不同靶核酸序列互补。在一些实施方案中，除了包含sgrna的可编程核酸酶探针之外，每个位置用具有不同官能团的一种或多种报告探针官能化。在一些实施方案中，报告探针足够接近以被可编程核酸酶探针切割。在一些实施方案中，如实施例7所述，特定sgrna和sgrna被设计成特异性与其结合的靶核酸之间的结合允许一种或多种报告物的一部分从对应的核酸上切割并释放到样品溶液中。在一些实施方案中，报告物用标记物官能化。在一些实施方案中，横向流动测定条包含包括检测点(例如，2403、2404)的检测区域，其中每个检测点包含不同类型的捕获抗体。在一些实施方案中，每种捕获抗体类型与报告物的特定标记物类型特异性结合。在一些实施方案中，第一检测点(2403)包含捕获抗体抗fitc。在一些实施方案中，孔(2402)表面上的位置d5包含第一固定可编程核酸酶探针，其包含特异于第一靶核酸序列的sgrna。在一些实施方案中，d5还包含固定化的第一报告物(2406)，其用fitc标记。在一些实施方案中，当第一靶核酸序列与可编程核酸酶探针结合时，导致第一报告物(2406)的可切割核酸被切割并释放到溶液中。替代地或组合地，在一些实施方案中，第二检测点(2404)包含捕获抗体抗dig。在一些实施方案中，第二位置d4包含固定的可编程核酸酶探针，其包含特异于第二靶核酸序列的sgrna。在一些实施方案中，d4还包含固定的第二报告物(2405)，其用dig标记。因此，在一些实施方案中，当结合第二靶核酸序列时，固定的第二报告物(2405)被切割并释放到溶液中。在一些实施方案中，包含切割的第一报告物(2405)和第二报告物(2406)的溶液与追踪缓冲液一起与横向流动测定条的样品垫接触。在一些实施方案中，样品垫具有设置在其上的一种或多种流动捕获探针(例如，抗生物素-aunp)。在一些实施方案中，包含切割的第一报告分子和第二报告分子的样品溶液与追踪缓冲液一起流过样品垫，其中报告物与缀合物(例如，抗生物素-金纳米颗粒)结合。在一些实施方案中，通过手动移液使包含切割的报告物的溶液与样品垫接触。在一些实施方案中，包含切割的报告物的溶液与从与样品垫流体连接的室中抽出的样品垫接触。在一些实施方案中，通过将包含切割的报告物的溶液从在其中进行产生切割的报告物溶液的测定的室中抽出，使该溶液与样品垫接触。在一些实施方案中，报告物在样品垫中被切割。在一些实施方案中，通过detectr
tm
测定在样品垫中切割报告物。在一些实施方案中，通过毛细管作用或芯吸将溶液吸入和抽出样品垫。在一些实施方案中，毛细管作用或芯吸是由被吸入吸收垫的液体引起的。在一些实施方案中，毛细管作用或芯吸是由被吸入吸收垫中的液体引起的，不需要电力。在一些情况下，通过压力梯度将溶液吸入或抽出样品垫。在一些实施方案中，具有用fitc标记的报告物(2406)的金纳米颗粒-报告物缀合物将选择性地与包含捕获抗体抗fitc的第一检测点(2403)结合，从而指示样品中第一靶核
酸序列的存在。在一些实施方案中，主要具有用dig标记的报告物(2405)的aunp-报告物缀合物将选择性地与包含捕获抗体抗dig的第二检测点(2404)结合，从而指示样品中第二靶核酸序列的存在。以这种方式，对于一些实施方案，能够平行检测存在于多路复用样品中的两个或更多个靶核酸序列。
[0310]
本文描述了如图25所示的基于横向流动的检测的各种实施方案。在一些实施方案中，辣根过氧化物酶(hrp)(2501)用于增强基于横向流动的detectr
tm
测定中的检测。在一些实施方案中，将包含靶核酸序列的样品暴露于表面(2500)，可编程核酸酶探针和报告探针被固定在该表面上。在一些实施方案中，报告探针包含hrp分子。在一些实施方案中，在靶标与指导rna之间的特异性结合事件后通过可编程核酸酶切割报告物时，报告物的切割部分被释放到样品溶液(2506)中。在一些实施方案中，然后将样品溶液暴露于包括含有过碳酸钠(2504)的样品垫或邻近该样品垫的横向流动测定条(2502)，所述过碳酸钠在暴露于水溶液时产生h2o2。在一些实施方案中，过碳酸钠再水合以形成h2o2发生在样品被芯吸通过该区域时。在一些实施方案中，底物包含dab、tmb或任何其他足够的底物。在一些实施方案中，“点”从蓝色变为红色，指示hrp的存在，并进而指示靶核酸序列的“命中”。在一些实施方案中，在样品溶液(2508)的颜色改变时，在溶液中完成读出。
[0311]
本文描述了利用hrp增强的多路复用detectr
tm
测定的各种方法和装置，所述测定利用横向流动测定条进行读出。在一些实施方案中，hrp信号增强的多路复用横向流动测定如图26所示。在一些实施方案中，支持介质的固定表面(2600)和在横向流动测定条(2610)上的检测如图23至图26所述进行，不同的是信号转导不通过金纳米颗粒散射光进行。相反，在一些实施方案中，用hrp-抗生物素dab/tmb代替抗生物素标记的aunp。在一些实施方案中，hrp被存在于横向流动测定条中的过碳酸钠激活，所述横向流动测定条被反应缓冲液和/或追踪缓冲液再水合。在一些实施方案中，hrp实现足够强的信号，以便不需要样品扩增诸如pcr。
[0312]
本文描述了利用对于dna的cas13 rna切割特异性、hrp信号增强和捕获寡核苷酸探针特异性的多路复用靶核酸检测的各种实施方案。在一些实施方案中，如图27所示，样品(2700)包含不同的靶核酸。在一些实施方案中，然后使样品(2700)与在一个或多个位置(例如，五个位置，d1-d5)处官能化的孔(2701)的表面接触。在一些实施方案中，存在一个或多个位置。在一些实施方案中，cas13酶存在于可编程核酸酶探针中。在一些实施方案中，cas13切割rna而不切割dna，使得能够使用包含具有dna链和rna链的核酸序列的报告物(2702)。在一些实施方案中，当靶核酸与sgrna结合时，报告物的rna被cas13酶切割，并且包含一部分rna、完整dna序列和(fitc标记物的片段被释放到溶液中。在一些实施方案中，该作用在每个位置或具有不同报告物的点处平行重复。在一些实施方案中，对于五种不同的靶核酸，该作用在位置d1至d5处平行重复，从而产生五种不同的报告片段。在一些实施方案中，然后将溶液与横向流动测定条的样品垫接触，其中样品垫包含hrp-抗fitc。在一些实施方案中，然后fitc标记的报告片段与hrp-抗fitc结合，形成复合物(2703)并被携带到检测区域的下游，从而与包含捕获寡核苷酸的检测点特异性结合，所述捕获寡核苷酸被设计为复合物(2703)中寡核苷酸的互补物。图28示出了基于dna酶和detectr
tm
的测定的结果，两次重复运行相隔一周进行。
[0313]
用于信号增强的指导rna池化
[0314]
在一些实施方案中，一种或多种cas-复合物探针(2900-2902)用于指导池化以在横向流动测定中实现增强的信号检测，如图29a所示。在一些实施方案中，第一cas-复合物探针(2900)包含与靶核酸的第一区段互补的第一sgrna。在一些实施方案中，第二cas-复合物探针(2901)包含与相同靶核酸的第二区段互补的第二sgrna。在一些实施方案中，第三cas-复合物探针(2902)包含与相同靶核酸的第三区段互补的第三sgrna。在一些实施方案中，第一cas-复合物探针、第二cas-复合物探针和第三cas-复合物探针都足够接近地定位以允许标记的报告物的充分切割以指示靶核酸的存在。图29b示出了包括样品垫(2903)、测试线(2904)和对照线(2905)的典型横向流动测定条。
[0315]
本文描述了在横向流动测定中实现增强的信号检测的指导池化的各种实施方案。对于本文所述的一些实施方案，指导池化显示出增强的cas12a活性。图30(如实施例14中所述)描绘了detectr
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测定的结果，其显示与使用单独grna形式的基于detectr
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cas12a的测定相比，使用池化指导(池化grna)形式的基于cas12a的gf184靶标的检测增强。在图30中，标记为“红色”的y轴显示强度单位，并且x轴显示其中发生不同detectr
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反应的室编号。图31(如实施例14中所述)描绘了detectr
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测定的结果，其显示与使用单独指导形式的基于cas13a的测定相比，使用池化指导形式的基于cas13a的sc2靶标检测的灵敏度提高。
[0316]
图32(如实施例14中所述)示出了对应于用于计数阳性液滴的数量的每个室的图像，其显示与含有单独形式的指导rna的cas13a-detectr
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测定样品相比，含有池化的指导rna的cas13a-detectr
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测定样品在每个起始靶rna拷贝中产生更多的含有扩增产物的晶体。
[0317]
图33(如实施例14中所述)示出了扩增后信号强度的测量显示，与含有单独形式的指导rna的cas13a-detectr
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测定样品相比，含有池化的指导rna的cas13a-detectr
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测定样品在每个起始靶模板rna拷贝中产生更多的信号强度。图34(如实施例14中所述)示出了扩增后信号强度的测量显示，与含有单独形式的指导rna的cas13a-detectr
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测定样品相比，含有池化的指导rna的cas13a-detectr
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测定样品在每个起始靶模板rna拷贝中产生更多的信号强度。图34还示出了通过计数阳性液滴的数量进行的相对定量显示，与含有单独形式的指导rna的cas13a-detectr
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测定样品相比，含有池化的指导rna的cas13a-detectr
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测定样品在每个起始靶模板rna拷贝中产生更多的含有扩增产物的晶体。
[0318]
图35(如实施例14中所述)示出了与含有单独形式的单个指导物r4684、r4667或r4785(rnasep指导物)的cas13a detectr
tm
样品相比，含有池化的指导物(r4637、r4638、r4667、r4676、r4684、r4689、r4691)的cas13a detectr
tm
测定样品在每个起始靶标拷贝中没有表现出更高的靶标检测灵敏度。
[0319]
本文公开了包含工程化可编程核酸酶(例如，工程化cas蛋白)和工程化指导核酸中的至少一种的非天然存在的组合物和体系，所述工程化可编程核酸酶和工程化指导核酸在本文中可分别简称为cas蛋白和指导核酸。通常，工程化cas蛋白和工程化指导核酸分别是指自然界中不存在的cas蛋白和指导核酸。在一些情况下，体系和组合物包含至少一种非天然存在的组分。例如，组合物和体系可包含指导核酸，其中指导核酸的序列与天然存在的指导核酸的序列不同或被修饰。在一些情况下，组合物和体系包含至少两种不天然一起存在的组分。例如，组合物和体系可以包含指导核酸，该指导核酸包含不天然一起存在的重复区和间隔区。此外，例如，组合物和体系可包含不天然一起存在的指导核酸和cas蛋白。相
反，为清楚起见，“天然的”、“天然存在的”或“自然界中存在的”cas蛋白或指导核酸包括来自未被人或机器基因修饰的细胞或生物体的cas蛋白和指导核酸。
[0320]
在一些情况下，指导核酸包含非天然核碱基序列。在一些情况下，非天然序列是自然界中不存在的核碱基序列。非天然序列可包含天然存在的序列的一部分，其中天然存在的序列的该部分在自然界中不存在，天然存在的序列的其余部分不存在。在一些情况下，指导核酸包含以自然界中未观察到的顺序或接近度排列的两个天然存在的序列。在一些情况下，组合物和体系包含核糖核苷酸复合物，该核糖核苷酸复合物包含不天然一起存在的crispr/cas效应蛋白和指导核酸。工程化指导核酸可以包含不天然一起存在的第一序列和第二序列。例如，工程化指导核酸可以包含天然存在的重复区和与天然存在的真核序列互补的间隔区的序列。工程化指导核酸可以包含天然存在于生物体中的重复区和天然不存在于该生物体中的间隔区的序列。工程化指导核酸可以包含存在于第一生物体中的第一序列和存在于第二生物体中的第二序列，其中第一生物体和第二生物体是不同的。指导核酸可以包含位于指导核酸的3'或5'端处或在指导核酸的第一序列与第二序列之间的第三序列。例如，工程化指导核酸可以包含通过接头序列偶联的天然存在的crrna和tracrrna。
[0321]
在一些情况下，本文所述的组合物和体系包含与天然存在的cas蛋白类似的工程化cas蛋白。工程化cas蛋白可缺乏天然存在的cas蛋白的一部分。cas蛋白可以包含相对于天然存在的cas蛋白的突变，其中该突变在自然界中不存在。cas蛋白还可以包含相对于天然存在的cas蛋白的至少一个额外的氨基酸。例如，cas蛋白可以包含相对于天然存在的cas蛋白的添加的核定位信号。在某些实施方案中，编码cas蛋白的核苷酸序列相对于天然存在的序列是密码子优化的(例如，用于在真核细胞中表达)。
[0322]
在一些情况下，本文提供的组合物和体系包含编码本文所述的cas蛋白和指导核酸的多载体体系，其中指导核酸和cas蛋白由相同或不同的载体编码。在一些实施方案中，工程化指导和工程化cas蛋白由该体系的不同载体编码。
[0323]
定义
[0324]
除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。如本说明书和所附权利要求中所用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代。除非另有说明，否则本文对“或”的任何引用旨在涵盖“和/或”。
[0325]
如本文所用，术语“包含”及其语法等同物指明存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或部件，但并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、部件和/或它们的群组。如本文所用，术语“和/或”包括一个或多个相关联的所列项目的任何和所有组合。
[0326]
除非明确指明或从上下文显而易见，否则如本文所用，对于针对范围所列的值，关于数值或数值范围的术语“约”应理解为意指所述数值及其数值+/-10％，或低于所列下限10％且高于所列上限10％。
[0327]
如本文所用，术语“个体”、“受试者”和“患者”可互换使用并且包括动物界的任何成员，包括人。
[0328]
如本文所用，术语“抗体”是指但不限于单克隆抗体、合成抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链fv(scfv)(包括双特异
性scfv)、单链抗体、fab片段、f(ab’)片段、二硫键连接的fv(sdfv)或其表位结合片段。在一些情况下，抗体是免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的免疫活性部分。在一些情况下，抗体为动物来源，包括鸟和哺乳动物。替代地，抗体是人或人源化单克隆抗体。
[0329]
实施例
[0330]
以下实施例对于本文所述的简化横向流动装置和方法的范围是说明性的而非限制性的。
[0331]
实施例1：用于检测核酸的横向流动装置
[0332]
本实施例描述了一种用于检测核酸的简化横向流动装置。
[0333]
可测试来自个体的生物样品以确定该个体是否具有感兴趣的靶核酸。可测试生物样品以检测靶核酸序列的存在或不存在。
[0334]
装置被构造成容纳多个单次使用的料筒，所述料筒包含用于样品制备、任选的扩增和靶核酸检测的试剂。装置执行以下步骤：(1)样品制备(例如，在室温下从拭子洗脱)，(2)在60℃下等温核酸扩增，(3)在37℃下基于crispr的反应(例如，detectr
tm
反应)，以及(4)使用横向流动条目视读出结果(图1)。所述简化横向流动装置的示意图示于图2中。
[0335]
样品制备包括用板载储存原型的溶液进行化学裂解。将全部体积的样品裂解物(约200μl)分配到至少两个横向流动条中。上升温度包括62℃：2-5分钟，伴随预热，因此反应在添加样品后立即开始，和/或37℃：2-5分钟，伴随预热，因此反应在添加样品后立即开始。横向流动装置是电池供电的，并且是单次使用的。操作者(例如，临床医生或实验室技术人员)一旦插入装置中就不能移除拭子，从而减少污染、样品泄漏、样品损失等。用户将样品插入横向流动装置中，允许装置处理样品，扩增靶核酸，并产生指示靶核酸存在或不存在的结果。
[0336]
目标度量、用途、微生物靶标和其他特征的概述示于下面的表5中。
[0337]
表5
[0338]
[0339]
实施例2：用于检测核酸的改进横向流动装置
[0340]
本实施例描述了用于检测核酸的改进横向流动装置。修改实施例1的横向流动装置并将其用于感兴趣的核酸的基于crispr的检测。将实施例1的横向流动装置修改为(1)使用氧化镁晶体或其他试剂的无电力功能，(2)移除扩增步骤，从而移除对应于扩增的区域，以及(3)使用除np拭子之外的其他样品类型(例如，唾液和血液)。它可适应作战人员的需求。用户将样品插入横向流动装置中，允许装置处理样品并产生指示靶核酸的存在或不存在的结果。
[0341]
实施例3：用于检测核酸的横向流动装置的指导池化
[0342]
本实施例描述了用于检测核酸的横向流动装置的指导池化。实施例1或实施例2的横向流动装置用于检测核酸。在这些横向流动装置上进行多路复用测定，其中使用5重或10重指导池分别靶向、结合和检测5或10个单独靶标。指导池被设计成靶向靶标中的相同核酸的不同区域，或被设计成完全靶向不同的微生物。用户将样品插入横向流动装置中，允许装置处理样品，任选地扩增靶核酸并产生指示每种靶核酸的存在或不存在的结果。
[0343]
实施例4：用于即时需求crispr装置的概念设计
[0344]
家庭测试为患者和社区提供了相当大的益处，包括快速测试结果，改善疾病管理和降低疾病传播给医疗保健提供者的风险。家庭测试的两个最广泛使用的应用是葡萄糖监测(tonyushkina和nichols，2009年)和妊娠测试(gnoth和johnson，2014年)。诸如横向流动测定的技术(koczula和gallotta，2016年)能够快速测试体液诸如血液、唾液和尿液中的蛋白质。使用用于样品收集的拭子通过横向流动检测蛋白质的商业实施例是savvychecktm阴道酵母测试(“savvychecktm阴道酵母测试-savyon诊断”，未测定)。尽管有家庭测试的前景，但现有的测试方法限于检测小分子和蛋白质，并且目前不存在用于即时需求的分子测试的技术。本实施例描述了使用detectr
tm
测定和拭子输入的用于家庭测试的即时需求装置的构思。
[0345]
在本实施例中，执行以下步骤：(1)样品制备(在室温下从拭子洗脱)，(2)在约60℃下等温核酸扩增，(3)在37℃下基于crispr的反应，以及(4)使用横向流动条目视读出结果。图1示出了在装置上执行的方法的工作流程。
[0346]
为了使用该装置，用户将拭抹他们的鼻孔(或面颊，如果是口腔细胞靶标)，然后将该拭子旋入装置中。当将盖子拧入装置中时，装置锁定(使用儿童安全锁状机构)，这防止流体从装置中泄漏。在通过锁之后，继续拧上盖子将刺穿泡罩包装，这将释放储存在泡罩包装中靠近样品端口顶部的裂解缓冲液和lamp缓冲液。装置的样品制备部分的剖面示意图示于下面的图15中。
[0347]
在装置的样品制备部分之后，有不同的策略可用于测定的剩余部分。一种选择是使用连续的微流体通道，lamp部分具有蛇形通道，如图所示。当通道的表面足够亲水时，该通道中的流动可由毛细流动驱动。图16是从顶部观察微流体装置的平面示意图。标记样品制备区域(诸如图1中的上述方案)，但为简单起见画作圆形。微流体结构的其余部分由黑线示出。当detectr
tm
需要多路复用时，设计可改变为包括分支detectr
tm
通道，每个分支中具有一个靶标。对于反应，流体可缓慢流过lamp通道并在加热器上行进，导致靶标的扩增。然后样品可遇到冻干的detectr
tm
试剂，并在另一个加热器上孵育，其中可存在用于检测的光学系统。如果需要lamp多路复用，则这可通过具有多个lamp通道来实现。图17提供了本实施
例中描述的装置的处理步骤细节。
[0348]
实施例5：用于运行crispr诊断反应同时防止扩增子污染的封闭横向流动测定形式
[0349]
如本文所述的crispr诊断反应可涉及两个步骤。第一步是任选的核酸扩增步骤，该步骤实现对测定的单分子灵敏度。该核酸扩增步骤可包括使用热循环和热稳定聚合酶的方法诸如pcr，或在单一温度下扩增核酸靶标的等温方法诸如rpa、lamp、sda或near。crispr诊断中的第二步是crispr酶反应，其使用可编程核酸酶蛋白诸如cas12、cas13或cas14识别通过使用可编程指导rna(grna)的核酸扩增步骤产生的扩增子。在临床实验室或其他环境中运行crispr诊断反应的主要风险之一是核酸扩增子污染实验室并在测定中导致假阳性的可能性。对于pcr和其他核酸扩增方法，这通常可通过防止扩增后测定板的打开来控制。然而，对于一些crispr诊断工作流程，特别是使用横向流动作为读出的那些，通常打开核酸扩增子反应体积以将其与crispr酶组合。已开发包含核酸扩增反应的装置，所述反应被加载到横向流动条上。在本实施例中，装置被设计成混合crispr诊断反应的两种组分(核酸扩增反应和crispr酶组分)，同时防止实验室或其他环境被核酸扩增子污染。简言之，该装置使用反应盒，该反应盒容纳一个包含核酸扩增反应的管和另一个包含crispr酶组分的管。装置的用户在扩增完成后将核酸扩增反应管插入反应盒中。反应盒还包含含有crispr酶试剂的第二管。将反应盒插入装置中，装置的外臂迫使反应盒向下并密封装置。当反应盒被压低时，其被推到两个针状或刀片状突起部上，所述突起部刺穿两个管，如图18所示。两个管的内容物在混合室中池化在一起并滴落到纸芯上。该芯将试剂向上吸入装置内部的盒中，该盒包含横向流动条，如图19所示。横向流动条用于评估crispr诊断反应的结果。可使用其他机构(例如，致动器、微流体、泵等)使反应室的内容物与横向流动测定条接触。
[0350]
实施例6：用于运行crispr诊断反应同时防止扩增子污染的封闭旋转柱形式
[0351]
在本实施例中，描述了使用旋转柱分离反应的两部分的测定的第二形式，如图20所示。核酸扩增反应可以发生在主管的底部，而crispr酶试剂保持与旋转柱中的主反应分开。当使用能够耐受较高温度(例如，55-60℃)的crispr酶或使用不需要使crispr蛋白变性的温度的等温方法时，等温扩增可以与crispr组分物理分离，而不抑制crispr诊断反应的性能。然后可通过在微量离心管中旋转该管，或通过使用注射器将crispr试剂推入底管中来组合反应。可使用蓝光和能够目视检测测定的荧光输出的滤光片观察测定的结果。
[0352]
实施例7：基于detectr
tm
的横向流动测定条
[0353]
本实施例的目的是展示使用如图23a-b所示的用于平行读出的横向流动测定(lfa)条的基于detectr
tm
的多路复用测定。为了进行detectr
tm
测定，用可编程核酸酶探针(2307)和报告探针(2301)固定表面(2300)。在本实施例中，表面是与lfa条分离的孔的底部。报告探针(2301)包含表面接头(2302)、可切割核酸序列(2303)、标记物(2304)和条的流动捕获探针(2305)的结合部分。在本实施例中，结合部分是生物素。标记物和结合部分通过第二接头(2306)连接到核酸(2303)，其中在本实施例中接头是树枝状聚合物或三重物分子。可编程核酸酶探针(2307)包含表面接头和可编程核酸酶(例如，cas酶)，所述可编程核酸酶继而包含sgrna(2308)。sgrna含有重复单元(或发夹结构)和识别序列。识别序列是样品的靶核酸的互补物。
[0354]
抗生物素标记的金纳米颗粒位于lfa条(2310)的样品垫(2311)中，如图23b所示。
[0355]
在本实施例中，第一步是使表面(2300)与包含靶核酸的样品接触。当与固定的可编程核酸酶探针(2307)的sgrna(2308)互补的靶核酸结合时，固定在附近的报告物(2301)被可编程核酸酶切割，从而将报告物(2309)的切割部分释放到溶液中。
[0356]
然后将现在含有对应于样品中存在的靶核酸的切割报告物的样品溶液与横向流动测定条(2310)的样品垫(2311)接触。在本实施例中，样品垫具有设置在其上的流动捕获探针(例如，抗生物素标记的金纳米颗粒)。一旦包含报告分子的释放部分的样品溶液与样品垫接触，所述样品溶液就流过样品垫(例如，通过芯吸)。样品溶液中的切割的报告物接触抗生物素金纳米颗粒流动捕获探针，并在溶液中接触时与所述流动捕获探针结合。然后报告物和纳米颗粒的复合物与液体样品的剩余部分一起通过毛细管作用穿过横向流动测定条的检测区域(2312)被携带到下游。在本实施例中，检测区域(2312)包括六个检测点(2313)，其中每个检测点(2313)包含特异于报告染料(2304)的不同捕获抗体类型。在本实施例中，染料(2304)是fitc，并且固定捕获探针是官能化至检测点(2313)的抗fitc抗体，允许对fitc标记的报告物以及特异于其他靶核酸的其他报告物进行特异性检测。存在对照线(2314)，其用抗igg官能化，以便捕获和检测未与fitc标记的报告片段(例如检测部分)结合的所有流动捕获探针。应当注意，在本实施例中，经由检测部分(2306)的树枝状接头存在多种标记物和结合部分以放大信号。在本实施例中，存在多个检测点(2313)，允许多路复用样品的可能的平行检测，如实施例8中所述。
[0357]
实施例8：基于多路复用detectr
tm
的横向流动测定条
[0358]
本实施例的目的是展示利用如图24所示的多路复用“热点”测定的横向流动测定条工作流程。在本实施例中，样品(2401)包含靶核酸序列1和2。样品(2401)与孔的表面(2402)接触，其中在五个位置d1至d5的每一个处，存在固定到表面上的不同sgrna。例如，5种不同sgrna中的每一种都是固定在五个不同位置d1至d5的5种不同可编程核酸酶探针(例如，参见图23)的一部分，如图24所示。另外，5种不同sgrna中的每一种被设计成与样品中的不同靶核酸特异性结合，从而允许样品多路复用。除了含有sgrna的固定可编程核酸酶探针之外，每个位置d1至d5用具有不同官能团的报告探针官能化。报告探针足够接近以被可编程核酸酶探针切割。因此，如实施例7中所述，当sgrna与sgrna被设计成与其特异性结合的靶核酸结合时，报告物被切割并释放到溶液中。在本实施例中，d4和d5各自包含用两种不同标记物或捕获抗体识别元件标记的报告物。一旦样品与孔(d1至d5)接触，报告分子的各个切割部分就被释放到样品溶液中(如实施例7中所述)。然后将具有释放的报告分子的样品溶液与样品垫接触，其中在本实施例中，样品垫位于横向流动测定中。在本实施例中，每个检测点包含不同类型的捕获抗体，其中每种捕获抗体类型与报告物的特定标记物特异性结合。对于本实施例，检测点(2403)包含捕获抗体抗fitc，而孔d5包含1)固定的cas-复合物，其包含特异于第一靶核酸序列的sgrna，以及2)用fitc标记的固定报告分子(2406)。因此，当第一靶核酸序列与对应的sgrna结合时，对应的固定报告分子(2406)与对应的核酸之间的连接(例如参见图23中的附图标记2301)被切割，从而将报告分子释放到溶液中。相比之下，对于本实施例，检测点(2404)包含捕获抗体抗dig，而孔d4包含1)固定的cas-复合物，其包含特异于第二靶核酸序列的sgrna，以及2)用dig标记的固定报告分子(2405)。因此，当第二靶核酸序列与对应的sgrna结合时，对应的固定报告分子(2405)与对应的核酸之间的连接(例如参见图23中的附图标记2301)被切割，从而在溶液中释放报告分子。然后将现在含
有切割的报告分子(2405和2406)的溶液与追踪缓冲液一起接触lfa条的样品垫，其中报告分子与设置在样品垫上的流动捕获探针(例如，抗生物素-aunp)结合并拾取所述流动捕获探针。具有用fitc标记的报告物(2406)的aunp-报告物缀合物将选择性地与包含捕获抗体抗fitc的检测点(2403)结合，从而指示样品中第一靶核酸序列的存在。具有用dig标记的报告物(2405)的aunp-报告物缀合物将选择性地与包含捕获抗体抗dig的检测点(2404)结合，从而指示样品中第二靶核酸序列的存在。以这种方式，能够平行检测存在于多路复用样品中的2个或更多个靶核酸序列。在一些实施例中，检测点在指定位置彼此间隔开，使得在给定检测点检测报告物将与特定靶核酸相关。
[0359]
实施例9：基于hrp增强的detectr
tm
的横向流动测定条
[0360]
本实施例的目的是展示如图25所示的辣根过氧化物酶(hrp)纸基检测。在此，“纸基”是指横向流动测定条。如实施例7和8中，将包含靶核酸序列的液体蓝色样品暴露于其上固定有crispr-cas/grna探针和报告探针的表面。在本实施例中，报告探针包含hrp分子。在靶标与指导rna之间的特异性结合事件后通过cas酶切割报告物时，报告物的切割部分被释放到样品溶液中。在本实施例中，然后使具有报告分子的释放部分的样品溶液与包括含有过碳酸钠的样品垫的横向流动测定条接触，所述过碳酸钠在水合时产生h2o2。过碳酸钠再水合以形成h2o2发生在样品被芯吸通过样品垫和横向流动测定到达检测点时，如先前的实施例7和8中所述。在本实施例中，横向流动测定条包含化学底物dab和tmb，它们激活从蓝色到红色的颜色变化，指示hrp的存在，并进而“命中”靶核酸序列。hrp的化学催化性质使得信号放大。替代地，也可以在样品溶液从蓝色变为红色时在溶液中完成读出。
[0361]
实施例10：基于hrp增强的多路复用detectr
tm
的横向流动测定条
[0362]
本实施例的目的是展示如图26所示的hrp信号增强的多路复用横向流动测定。固定表面(2600)和横向流动测定条(2610)上的检测如先前实施例所述进行，不同的是信号转导不通过金纳米颗粒散射光进行。相反，用hrp-抗生物素dab/tmb代替抗生物素标记的aunp。hrp被存在于lfa条中的过碳酸钠激活，所述lfa条被反应和/或追踪缓冲液再水合。以这种方式，hrp实现足够强的信号，以便不需要样品扩增诸如pcr。以与实施例8中所述相同的方式实现多路复用检测。
[0363]
实施例11：具有捕获寡核苷酸探针特异性的基于cas13的hrp增强detectr
tm
lfa
[0364]
本实施例的目的是展示利用对于dna的cas13 rna切割特异性、hrp信号增强和捕获寡核苷酸探针特异性的多路复用靶核酸检测，如图27所示。在本实施例中，样品(2700)包含不同的靶核酸。然后将样品(2700)与在五个位置d1-d5处官能化的孔的表面(2701)接触，如实施例8中所述。此处的区别是cas13酶存在于cas-复合物探针中。cas13切割rna，但不切割dna。这使得能够使用包含核酸序列的报告物(2702)，一个由dna组成，另一个由rna组成。在靶核酸与sgrna结合时，报告物的rna被cas13酶切割，并且包含一部分rna、完整dna序列和fitc标记物的片段被释放到溶液中。对于五种不同的靶核酸，该作用在每个点d1至d5处平行重复，从而产生5种不同的报告片段。然后将溶液与lfa条的样品垫接触，其中样品垫包含hrp-抗fitc。然后fitc标记的报告片段与hrp-抗fitc结合，形成复合物(2703)并被携带到检测区域的下游，从而与包含捕获寡核苷酸的检测点特异性结合，所述捕获寡核苷酸被设计为复合物(2703)中寡核苷酸的互补物。以这种方式，如实施例8中所述的多路复用样品的平行检测是可能的。
[0365]
实施例12：利用cas14的基于hrp增强的detectr
tm
的横向流动测定条
[0366]
本实施例的目的是展示如图25所示的辣根过氧化物酶(hrp)纸基检测。在此，“纸基”是指横向流动测定条。如实施例7和8中，将包含靶核酸序列的液体蓝色样品暴露于其上固定有可编程核酸酶探针和报告探针的表面。在本实施例中，报告探针包含hrp分子。在靶标与指导核酸之间的特异性结合事件后通过cas14酶切割报告物时，报告物的切割部分被释放到样品溶液中。在本实施例中，然后将样品溶液暴露于包括含有过碳酸钠的样品垫的横向流动测定条，所述过碳酸钠在水合时产生h2o2。过碳酸钠再水合以形成h2o2发生在样品被芯吸通过该区域时，如先前的实施例7和8中所述。由于底物包含dab、tmb等，“点”从蓝色变为红色，指示hrp的存在，并进而“命中”靶核酸序列。以这种方式，hrp使得信号放大。替代地，如图25所示，也可以在样品溶液从蓝色变为红色时在溶液中完成读出。
[0367]
实施例13：基于hrp-t20-生物素detectr
tm
的测定
[0368]
本实施例的目的是展示基于hrp和detectr
tm
的测定。在本实施例中，报告物被溶液中的cas复合物或dna酶切割。切割的报告物与hrp-t20-生物素反应。然后将上清液添加到含有tmb和h2o2的反应体积中以产生颜色信号。然后通过溶液的光密度测量来检测切割的报告物-hrp缀合物。从反应开始时获取光密度测量值。实验在两组中进行，每组包括2次运行，其中每组相隔1周运行。在每组的每次运行中分别使用dna酶和detectr
tm
。在dna酶运行中，在蓝色系列中使用1nm hrp靶寡核苷酸。结果示于图28中。本实施例的重要性在于hrp和detectr
tm
两者的多次周转使得能够实现另选的信号放大以用于样品扩增，诸如pcr。
[0369]
实施例14：用于detectr
tm
测定中增强的靶检测信号的指导池化
[0370]
作为增强来自detectr
tm
测定的靶标检测信号的策略，将设计为与单个靶分子内不同区域结合的指导rna池化。例如，在该策略中，每个detectr
tmtm
反应包含crispr-cas rnp复合物的池，每种crispr-cas rnp复合物靶向单个靶核酸分子内的不同区域。如本文所讨论，该策略通过使用增加数量的复合物/单个靶标来提高对靶标检测的灵敏度，使得信号足够强以在泊松分布(低于一个拷贝(sub-one copy)/液滴)内检测并提供样品内靶标数量的定量评估。
[0371]
为了测试指导池对使用cas12a核酸酶的靶标检测的影响，首先，制备cas12a复合混合物，其中r1965(脱靶指导物)、r1767、r3164、r3178指导物以池化的grna形式(选自r1767、r3164或r3178的三种指导物中的两种或更多种的池)或以单grna形式(其中r1767、r3164、r3178各自存在)存在，并且将混合物在37℃下孵育20分钟。从起始稀释浓度制成模板rna(gf184)的2倍稀释系列(其中将5.4μl的0.1ng/μl gf184添加到44.6μl无核酸酶的水中)。然后如表6所示组装包含cas12复合物、报告底物、荧光素、缓冲液和稀释的模板(gf184或脱靶模板gf577)的detectr
tm
主混合物。然后将detectr
tm
混合物装载到stilla sapphire芯片中并放入naica geode中。由来自每个样品的数千个液滴制成晶体。未执行扩增步骤。在红色通道中测量来自sapphire芯片的信号。detectr
tm
测定的结果显示，与使用单独指导形式的基于detectr
tm
cas12a的测定相比，使用池化指导形式的基于cas12a的gf184靶标的检测增强。例如，detectr
tm
测定显示，与来自分别含有单独指导形式的r1767和r3178的室2或室4的信号相比，来自含有两种指导物r1767和r3178的池的室5的信号增强(图30)。类似地，detectr
tm
测定显示，与来自含有两种指导物(r1767和r3178)的池的室5的信号相比，并且与来自分别含有单独指导形式的r1767、r3164和r3178的室2、室3或室4的信号相比，来自
含有三种指导物(r1767、r3164和r3178)的池的室9的信号增强(图30)。
[0372]
表6
[0373][0374]
在cas13a核酸酶的情况下，也观察到用指导池对靶标检测的灵敏度的提高。在这些测定中，制备cas13a复合混合物，其中r002(脱靶指导物)、r4517、r4519、r4530指导物以池化的grna形式(r4517、r4519和r4530的三种指导物中的两种或更多种的池)或以单grna形式(其中r4517、r4519和r4530各自存在)存在，并且将混合物在37℃下孵育20分钟。然后如表7所示组装包含cas13a复合物、fam-u5报告底物、缓冲液和稀释的模板sc2 rna(或脱靶模板5s-87)的detectr
tm
主混合物。然后将detectr
tm
混合物装载到stilla sapphire芯片中并放入geode系统中。由来自每种样品的液滴生成晶体，并在37℃下孵育(不执行扩增步骤)。在cy5通道中测量来自sapphire芯片的信号。detectr
tm
测定的结果显示，与使用单独指导形式的sc2靶rna的基于cas13a的检测相比，使用池化指导形式的sc2靶rna的基于cas13a的检测增强。例如，detectr
tm
测定显示，与含有浓度为1x106个拷贝的模板和分别以单独指导形式的指导物r4517、r4519和r4530的室2、室4或室6的信号相比，来自含有浓度为1x106个拷贝的模板和三种指导物r4517、r4519和r4530的池的室8(饱和-未显示)的信号增强(图31)。类似地，detectr
tm
测定显示，与含有浓度为1x106个拷贝的模板和分别以单独指导形式的指导物r1767、r3164和r3178的室2、室6或室4的信号相比，来自含有浓度为1x105个拷贝的模板和三种指导物(r1767、r3164和r3178)的池的室9的信号增强(图31)。
[0375]
表7
[0376][0377][0378]
接着，测定在含有池化的指导形式或单独指导形式的指导rna的cas13a数字液滴detectr
tm
测定中的靶标检测的灵敏度。制备每种grna(r4637、r4638、r4667、r4676、r4684、r4689、r4691或r4785(rnasep))的detectr
tm
反应主混合物，并且除了grna之外还包括cas13a核酸酶和报告底物。复合后，将2μl各rnp池化成合并的grna形式(七种grna的池，即r4637、r4638、r4676、r4689、r4691、r4667和r4684)或保留为单grna形式(其中r4667、r4684和r4785(rnase p)单独存在)。稀释模板rna(twist sc2、atcc sc2和5s-87脱靶)以获得一系列模板浓度。如表8所示，通过将cas13a-grna rnp与来自前一步骤的稀释的模板rna组合来组装被导向模板rna(twist sc2、atcc sc2和5s-87脱靶模板rna)的检测的detectr
tm
反应。将组装的detectr
tm
反应装载到stilla sapphire芯片上的室中。将芯片放入geode系统中，并使用液滴生成程序生成晶体，并进行成像以显示含有检测到的靶标的液滴。
[0379]
将含有池化的指导物(r4637、r4638、r4667、r4676、r4684、r4689、r4691)的detectr
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测定的靶标检测灵敏度与含有单独形式的单个指导物r4684、r4667、r4785(rnasep指导物)的detectr
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测定的靶标检测灵敏度进行比较。通过计数这些阳性液滴的数量进行的相对定量显示，与含有单独形式的指导rna的样品相比，含有池化的指导rna的样品在每个起始靶rna拷贝中产生更多的含有扩增产物的晶体(图32)。例如，来自室1的阳性液滴的数量高于室2和室3中的液滴的数量；并且来自室5的液滴的数量高于室6和室7中的液滴的数量(图32)。来自芯片的靶标检测信号强度的测量还证实，含有池化的指导物(r4637、r4638、r4667、r4676、r4684、r4689、r4691)的detectr
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测定的每个起始靶rna拷贝的靶标检测灵敏度高于含有单独形式的单个指导物r4684、r4667、r4785(rnasep指导物)的detectr
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测定的靶标检测灵敏度(图33)。例如，来自室1(含有七种指导物的池和twist sc2模板rna)的信号强度高于室2和室3(在存在twist sc2 rna的情况下分别含有单独形式的r4684和r4667 grna)中的信号强度；并且来自室5(含有七种指导物的池和atcc sc2模板rna)的信号强度高于室6和室7(在存在atcc sc2 rna的情况下分别含有单独形式的r4684和r4667grna)中的信号强度(图33)。类似地，来自室5(含有七种指导物的池和atcc sc2模板rna)的信号强度高于室6(含有单独形式的grna r4684和atcc sc2 rna)中的信号强度、来自室8(含有单独形式的对照rnasep grna和atcc sc2模板rna)的信号强度和来自室12(含有七种池化的grna而无模板rna)的信号强度(图33)。
[0380]
在室5(含有七种指导物的池和atcc sc2模板rna)中观察到的含有扩增靶标(每个
起始靶rna拷贝)的液滴数量的相对定量高于在室6(含有单独形式的grna r4684和atcc sc2 rna)中观察到的液滴数量、在室8(含有单独形式的对照rnasep grna和atcc sc2模板rna)中观察到的液滴数量和在室12(含有七种池化的grna而无模板rna)中观察到的液滴数量(图34)。当以台式测定形式进行测定时，将含有池化的指导物(r4637、r4638、r4667、r4676、r4684、r4689、r4691)的测定的靶标检测灵敏度与含有单独形式的单个指导物r4684、r4667、r4785(rnasep指导物)的测定的靶标检测灵敏度进行比较(图35)。来自台式测定的结果显示，含有池化的指导物(r4637、r4638、r4667、r4676、r4684、r4689、r4691)的样品不高于含有单独形式的单个指导物r4684、r4667或r4785(rnasep指导物)的样品的靶标检测灵敏度(图35)。
[0381]
表8
[0382][0383][0384]
虽然本文已经示出并描述了本公开的优选实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施方案仅作为示例提供。在不偏离本公开的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替代。应理解的是，本文所述的本公开实施方案的各种替代方案可用于实施本公开。以下权利要求意图限定本公开的范围并且因此涵盖这些权利要求及其等效物范围内的方法和结构。