用于测序的装置和方法与流程

背景技术：

1、蛋白质组学、基因组学和转录组学已经成为研究生物系统的重要和必要的手段。这些对单个生物体或样品类型的分析可以提供对细胞过程和反应模式的洞察力，从而改进诊断和治疗策略。围绕核酸和蛋白质组成和修饰的复杂性给确定生物样品的大规模测序信息带来了挑战。

技术实现思路

1、本公开的各个方面提供了方法、组合物、装置和/或盒(cartridge)，用于制备分析用样品和/或分析(例如，通过测序分析)样品中的一种或多种靶分子的过程。在一些实施方案中，靶分子是核酸(例如dna或rna，包括但不限于cdna、基因组dna、mrna及其衍生物和片段)。在一些实施方案中，靶分子是蛋白质。

2、本公开的一些方面提供了制备用于测序的生物样品的装置。在一些实施方案中，该装置包括自动化模块，其被设置为接收两个或更多个选自由以下组成的组的盒：(i)裂解盒；(ii)富集盒；(iii)片段化盒；和(iv)官能化盒。在一些实施方案中，该装置包括自动化模块，其包括一个或多个微流控通道，并被设置为接收包含一种或多种靶分子的生物样品。在一些实施方案中，该装置包括自动化模块，其被设置为接收(i)裂解盒；和(ii)富集盒。在一些实施方案中，该装置包括自动化模块，其被设置为接收(i)裂解盒；和(iii)片段化盒。在一些实施方案中，该装置包括自动化模块，其被设置为接收(i)裂解盒；和(iv)官能化盒。在一些实施方案中，该装置包括自动化模块，其被设置为接收(ii)富集盒；和(iii)片段化盒。在一些实施方案中，该装置包括自动化模块，其被设置为接收(i)富集盒；和(iv)官能化盒。在一些实施方案中，该装置包括自动化模块，其被设置为接收(i)片段化盒；和(iv)官能化盒。在一些实施方案中，该装置包括自动化模块，其被设置为接收(i)片段化盒；(ii)富集盒；和(iii)片段化盒。在一些实施方案中，该装置包括自动化模块，其被设置为接收(i)片段化盒；(ii)富集盒；和(iv)官能化盒。在一些实施方案中，该装置包括自动化模块，其被设置为接收(ii)富集盒；(iii)片段化盒；和(iv)官能化盒。在一些实施方案中，该装置包括自动化模块，其被设置为接收(i)片段化盒；(ii)富集盒；(iii)片段化盒；和(iv)官能化盒。在一些实施方案中，该装置产生的核酸的平均读长比使用对照方法产生的平均读长长。

3、本公开的进一步方面提供了用于制备一种或多种靶分子的装置，该装置被设置为执行选自(i)、(ii)、(iii)和(iv)的以下步骤中的两个或更多个，其中(i)、(ii)、(iii)和(iv)定义如下：(i)裂解包含一种或多种靶分子的生物样品；(ii)富集一种或多种靶分子中的至少一种靶分子和/或至少一种非靶分子；(iii)使一种或多种靶分子片段化；和(iv)使一种或多种靶分子的末端部分官能化。

4、在一些实施方案中，选自(i)、(ii)、(iii)和(iv)的一个或多个方法步骤是在盒中进行的。在一些实施方案中，该一个或多个步骤是在同一个盒中进行的。在一些实施方案中，该盒是一次性使用的盒或多次使用的盒。在一些实施方案中，该盒包括一个或多个微流控通道，其被设置为容纳和/或输送在任何一个自动化步骤中使用的流体。在一些实施方案中，该盒包括一个或多个微流控通道，其被设置为在任何一个自动化步骤之间容纳和/或输送一种或多种靶分子。在一些实施方案中，该盒包括树脂，用于在任何一个自动化步骤之间纯化一种或多种靶分子。在一些实施方案中，该树脂是sephadex树脂，可选是g-10sephadex树脂。在一些实施方案中，该盒包括任何尺寸的排除介质。

5、本公开的进一步方面提供了用于制备一种或多种靶分子的方法。在一些实施方案中，用于制备一种或多种靶分子的方法包括选自(i)、(ii)、(iii)和(iv)的以下步骤中的两个或更多个，其中(i)、(ii)、(iii)和(iv)定义如下：(i)裂解包含一种或多种靶分子的生物样品；(ii)富集一种或多种靶分子中的至少一种靶分子和/或至少一种非靶分子；(iii)使一种或多种靶分子片段化；和(iv)使一种或多种片段化的靶分子的末端部分官能化；其中步骤(i)、(ii)、(iii)或(iv)中的至少一个是在自动化样品制备装置中进行的。在一些实施方案中，两个步骤是在自动化样品制备装置中进行的。在一些实施方案中，三个步骤是在自动化样品制备装置中进行的。在一些实施方案中，四个步骤是在自动化样品制备装置中进行的。在一些实施方案中，步骤(i)是使用裂解盒进行的。在一些实施方案中，步骤(ii)是使用富集盒进行的。在一些实施方案中，步骤(iii)是使用片段化盒进行的。在一些实施方案中，步骤(iv)是使用官能化盒进行的。

6、本公开的进一步方面提供了用于制备一种或多种靶分子的盒。在一些实施方案中，盒被设置为执行选自(i)、(ii)、(iii)和(iv)的以下步骤中的两个或更多个，其中(ii)、(iii)和(iv)定义如下：(i)裂解包含一种或多种靶分子的生物样品；(ii)富集一种或多种靶分子中的至少一种靶分子和/或至少一种非靶分子；(iii)使一种或多种靶分子片段化；和(iv)使一种或多种靶分子的末端部分官能化。在一些实施方案中，该盒是一次性使用的盒或多次使用的盒。在一些实施方案中，该盒包括一个或多个微流控通道，其被设置为容纳和/或输送在任何一个自动化步骤中使用的流体。在一些实施方案中，该盒包括一个或多个微流控通道，其被设置为在任何一个自动化步骤之间容纳和/或输送一种或多种靶分子。在一些实施方案中，该盒包括树脂，用于在任何一个自动化步骤之间纯化一种或多种靶分子。在一些实施方案中，该树脂是sephadex树脂，可选是g-10sephadex树脂。

7、在一些实施方案中，生物样品是单细胞、哺乳动物细胞组织、动物样品、真菌样品或植物样品。在一些实施方案中，生物样品是血液样品、唾液样品、痰液样品、粪便样品、尿液样品、口腔拭子样品、羊水样品、精液样品、滑液样品、脊液样品或胸腔积液样品。在一些实施方案中，该一种或多种靶分子是核酸。在一些实施方案中，该一种或多种靶分子是蛋白质。

8、在一些实施方案中，装置进一步包括蠕动泵，其被设置为将一种或多种流体输送到该装置接收的任何一个盒中、其内或从其中输出。在一些实施方案中，装置进一步包括蠕动泵，其被设置为在该装置接收的盒的任何一个微流控通道内或通过其输送一种或多种流体。在一些实施方案中，装置被设置为以小于或等于1000微升、小于或等于100微升、小于或等于50微升、或小于或等于10微升的流体流量分辨率来输送流体。在一些实施方案中，该装置被设置为同时接收两个或更多个盒。在一些实施方案中，该装置被设置为同时在该装置接收的两个或更多个盒之间建立流体连通。在一些实施方案中，该装置被设置为依次接收两个或更多个盒。

9、在一些实施方案中，该装置进一步包括测序模块。在一些实施方案中，该装置被设置为将一种或多种靶分子递送到测序模块。在一些实施方案中，测序模块执行核酸测序。在一些实施方案中，核酸测序包括单分子实时测序、合成法测序、连接法测序、纳米孔测序和/或sanger测序。在一些实施方案中，测序模块执行蛋白质测序。在一些实施方案中，蛋白质测序包括埃德曼降解法或质谱法。在一些实施方案中，测序模块执行单分子蛋白质测序。

10、在一些实施方案中，裂解盒包括一个或多个微流控通道，并被设置为接收包含一种或多种靶分子的生物样品，并产生裂解的样品。在一些实施方案中，富集盒包括一个或多个微流控通道，并被设置为富集一种或多种靶分子中的至少一种，以产生富集的样品。在一些实施方案中，片段化盒包括一个或多个微流控通道，并被设置为消化或片段化一种或多种靶分子中的至少一种，以产生片段化的样品。在一些实施方案中，官能化盒包括一个或多个微流控通道，并被设置为使一种或多种靶分子中的至少一种的末端部分官能化，以形成官能化的样品。

11、在一些实施方案中，任何一个盒被设置为接收来自任何其他盒的样品或靶分子。在一些实施方案中，任何一个盒通过一个或多个微流控通道与任何其他盒连接。

12、在一些实施方案中，裂解盒包括能裂解样品但不会使一种或多种靶分子降解或片段化的试剂。在一些实施方案中，裂解盒包括促进一种或多种靶分子至少部分地从样品的非靶分子中分离或纯化的试剂。在一些实施方案中，试剂包括去污剂、酸和/或碱。在一些实施方案中，试剂包括裂解缓冲液。在一些实施方案中，裂解缓冲液选自由以下组成的组：ripa缓冲液、gcl(胍-hcl)缓冲液和glynp40缓冲液。在一些实施方案中，裂解盒中的一个或多个微流控通道促进细胞和/或组织的剪切(例如，细胞和/或组织的剪切流)。在一些实施方案中，裂解盒包括促进细胞和/或组织的机械剪切的针状通道。在一些实施方案中，针状通道的内径为0.1至1mm。在一些实施方案中，裂解盒中的一个或多个微流控通道包括柱状阵列。在一些实施方案中，裂解盒被设置为在升高温度(例如，20-60℃、20-30℃、25-40℃、30-50℃、35-50℃或50-75℃)下被加热。在一些实施方案中，该装置被设置为在升高温度(例如，20-60℃、20-30℃、25-40℃、30-50℃、35-50℃或50-75℃)下加热裂解盒。在一些实施方案中，该装置被设置为使裂解盒经受微波或超声处理。

13、在一些实施方案中，富集盒包括一种或多种亲和基质。在一些实施方案中，该一种或多种亲和基质在富集盒的微流控通道中。在一些实施方案中，该一种或多种靶分子是核酸，固定化的捕获探针是寡核苷酸捕获探针，寡核苷酸捕获探针包括与一种或多种靶分子中的至少一种至少部分互补的序列。在一些实施方案中，寡核苷酸捕获探针包括与靶分子至少80％、90％、95％或100％互补的序列。在一些实施方案中，该一种或多种靶分子是蛋白质，固定化的捕获探针是与一种或多种靶分子中的至少一种结合的蛋白质捕获探针。在一些实施方案中，蛋白质捕获探针是适体或抗体。在一些实施方案中，蛋白质捕获探针与靶蛋白以10-9至10-8m、10-8至10-7m、10-7至10-6m、10-6至10-5m、10-5至10-4m、10-4至10-3m或10-3至10-2m的结合亲和力结合。在一些实施方案中，该一种或多种靶分子是核酸，固定化的捕获探针是寡核苷酸捕获探针，寡核苷酸捕获探针包括与至少一种非靶分子至少部分互补的序列。在一些实施方案中，寡核苷酸捕获探针包括与非靶分子至少80％、90％、95％或100％互补的序列。在一些实施方案中，寡核苷酸捕获探针不与一种或多种靶分子互补。在一些实施方案中，该一种或多种靶分子是蛋白质，固定化的捕获探针是与至少一种非靶分子结合的蛋白质捕获探针。在一些实施方案中，蛋白质捕获探针与非靶蛋白以10-9至10-8m、10-8至10-7m、10-7至10-6m、10-6至10-5m、10-5至10-4m、10-4至10-3m或10-3至10-2m的结合亲和力结合。在一些实施方案中，蛋白质捕获探针不与一种或多种靶分子结合。在一些实施方案中，富集盒被设置为耗尽样品中的非靶分子。

14、在一些实施方案中，片段化盒包括消化或片段化样品和/或一种或多种靶分子的非酶促试剂。在一些实施方案中，消化或片段化样品和/或一种或多种靶分子的非酶促试剂包括去污剂、酸和/或碱。在一些实施方案中，消化或片段化样品和/或一种或多种靶分子的非酶促试剂包括溴化氰、羟胺、亚碘酰基苯甲酸、二甲亚砜、盐酸、bnps-粪臭素[2-(2-硝基苯基亚磺酰基)-3-甲基吲哚]和/或2-硝基-5-硫氰基苯甲酸。在一些实施方案中，片段化盒包括消化或片段化一种或多种靶分子中的至少一种的一种或多种酶促试剂。在一些实施方案中，该一种或多种酶促试剂包括一种或多种蛋白酶。在一些实施方案中，一种或多种蛋白酶选自由以下组成的组：胰蛋白酶、糜蛋白酶、lysc、lysn、aspn、gluc和argc。在一些实施方案中，该一种或多种酶促试剂包括一种或多种内切核酸酶或外切核酸酶。在一些实施方案中，片段化盒可以在升高温度(例如，20-60℃、20-30℃、25-40℃、30-50℃、35-50℃或50-75℃)下被加热。在一些实施方案中，装置被设置为在升高温度(例如，20-60℃、20-30℃、25-40℃，30-50℃，35-50℃或50-75℃)下加热片段化盒。在一些实施方案中，装置被设置为使片段化盒经受微波或超声处理。

15、在一些实施方案中，官能化盒包括第一室，该室包括将一种或多种靶分子或其一种或多种片段的部分m0共价修饰成修饰的部分m1的试剂。在一些实施方案中，试剂是非酶促的。在一些实施方案中，共价修饰是区域特异性的。在一些实施方案中，该一种或多种靶分子或其一种或多种片段的部分是c-末端羧基或c-末端氨基。在一些实施方案中，试剂包括缓冲剂、盐、有机化合物、酸和/或碱。在一些实施方案中，该一种或多种靶分子或其一种或多种片段的部分是c-末端氨基，共价修饰是重氮转移。在一些实施方案中，部分m0是-nh2，部分m1是-n3。在一些实施方案中，试剂包括咪唑-1-磺酰叠氮化物和铜盐(例如硫酸铜)，以及具有约9-11的ph的缓冲液(例如具有约9-11的ph的碳酸钾缓冲液)。在一些实施方案中，试剂包括任何叠氮化物转移剂。在一些实施方案中，试剂包括三氟甲磺酰叠氮化物。在一些实施方案中，叠氮化物转移剂包括苯磺酰叠氮化物。在一些实施方案中，第一室通过一个或多个微流控通道和/或可选的纯化室与第二室连接。在一些实施方案中，第二室包括共价修饰部分m1以产生官能化的肽的试剂。在一些实施方案中，共价修饰是电环点击反应。在一些实施方案中，试剂包括dbco标记的dna-链霉亲和素缀合物和缓冲液，可选地，其中dbco标记的dna-链霉亲和素缀合物被固定在第二室的表面。在一些实施方案中，官能化的肽被dbco标记的dna-链霉亲和素缀合物官能化。

16、在一些实施方案中，纯化室位于第一室和第二室之间，包括促进纯化或富集修饰的靶分子或其片段的树脂。在一些实施方案中，树脂是sephadex树脂，可选是g-10sephadex树脂。在一些实施方案中，可以在升高温度(例如，20-60℃、20-30℃、25-40℃、30-50℃、35-50℃或50-75℃)下加热官能化盒。在一些实施方案中，装置被设置为在升高温度(例如，20-60℃、20-30℃、25-40℃、30-50℃、35-50℃或50-75℃)下加热官能化盒。在一些实施方案中，官能化盒可以经受微波或超声处理。

17、在一些实施方案中，纯化包括将官能化的样品通过尺寸排除介质。在一些实施方案中，尺寸排除介质可以是柱。该柱可以是脱盐柱。在一些实施方案中，该柱是zeba柱(例如zeba 7kda或zeba 40kda柱)。在一些实施方案中，尺寸排除介质是流体装置的一部分。在一些实施方案中，尺寸排除介质是系统的一部分，但不是该系统的流体装置的一部分。

18、在一些实施方案中，纯化蛋白质包括通过免疫沉淀进行纯化。在一些实施方案中，免疫沉淀包括使用与靶蛋白特异性结合的抗体将靶蛋白从样品(例如，官能化之前或之后的样品)中沉淀出来。

19、在一些实施方案中，该一个或多个微流控通道被设置为容纳和/或输送流体和/或试剂。

20、在一些实施方案中，任何一个盒包括基底层，该基底层具有包括通道的表面。在一些实施方案中，通道包括一个或多个微流控通道。在一些实施方案中，至少一些通道的至少一部分具有基本三角形的截面，该截面在通道的底部具有单个顶点，在基底层的表面具有另外两个顶点。在一些实施方案中，任何一个盒的至少一些通道的至少一部分具有表面层，包括被设置为基本上密封通道的表面开口的弹性体。在一些实施方案中，弹性体包括硅酮。在一些实施方案中，至少一些通道的至少一部分具有壁和底部，包括与生物材料兼容的基本刚性材料。在一些实施方案中，任何一个盒包括一个或多个流体储液器。在一些实施方案中，至少一些通道连接到温度区的储液器。在一些实施方案中，至少一些通道连接到电泳凝胶。