用于纯化信使RNA的方法与流程

背景技术：

1、信使rna(mrna)治疗药是有前途的新型治疗剂；例如，mrna替代治疗药可以是传统蛋白质替代疗法的替代方案。在mrna替代治疗药中，将编码特定蛋白质序列的完整mrna递送至靶细胞，并且通过细胞的天然翻译机制翻译成完整蛋白质。用于此类治疗药的mrna典型地是这样合成的，使用体外转录系统用酶(诸如rna聚合酶)从模板(诸如质粒dna)转录mrna，同时或随后添加5'-帽和3'-聚腺苷酸化。此类反应的结果是包含全长mrna和各种不期望的污染物(例如，蛋白质、盐、缓冲剂和非rna核酸)的组合物，所述污染物典型地被去除以提供可用于mrna替代治疗药的洁净且均匀的mrna。

2、传统上，通过可商购的基于二氧化硅的柱系统(诸如qiagen 试剂盒)或者通过将蛋白质提取到有机混合物(苯酚:氯仿:异戊醇)中并且随后进行乙醇沉淀，从体外转录反应中纯化mrna。这些方法在规模上是有限制性的，因为它们可以提供最多5至10mg洁净且均匀的mrna；因此，它们不足以满足mrna的临床和商业用途的需要。最近的新颖方法(诸如切向流过滤(tff))已经被修改为从体外转录反应中纯化沉淀mrna；这大大增加了纯化的规模。适用于大规模纯化mrna的另外的方法可用于mrna治疗药的临床和商业开发。例如，另一种方法使用过滤离心。然而，这些方法中的许多方法在纯化过程中需要大体积的洗涤缓冲剂，以实现适用于临床制剂的洗涤效率。鉴于安全法规(其限制了可储存于设施中的易燃溶剂的量)，这些大体积的洗涤缓冲剂(通常包括乙醇)使批量大小受到限制。因此，这些已知的方法在不重新配置现有设施的情况下通常只能用于较小的批量大小。

3、因此，需要一种有成本效益方式且可扩大的方法，其避免了现有技术方法的缺点，并且产生具有治疗用途可接受的纯度和完整性水平的洁净且均匀的mrna组合物。

技术实现思路

1、本发明尤其提供了一种纯化信使rna(mrna)的高效且有成本效益的方法。所述方法涉及使不纯的rna制剂沉淀，并且使用过滤离心机对其进行纯化。本发明部分基于这样一个出乎意料的发现，即将包含沉淀mrna的悬浮液加载到过滤离心机中并且洗涤所保留的沉淀mrna可以以比先前使用的离心机速度更低的离心机速度进行。特别地，加载步骤可以以较低的离心机速度进行，同时仍确保mrna可以被有效地洗涤和纯化。这是违反直觉的，因为较高的离心机速度在本领域中用于加载过滤离心机。人们认为，较高的速度是确保悬浮液中沉淀mrna被过滤器有效地保留从而避免所得滤饼被逐出所必要的。出乎意料地是，诸位发明人发现，在加载步骤和洗涤步骤中均使用较低的离心机速度降低了纯化过程期间所需的挥发性有机溶剂(例如，乙醇)的体积。确实，在本发明的一些方面，在使用较低的速度来加载和洗涤沉淀mrna时可以完全避免使用挥发性有机溶剂(例如，乙醇)。根据这些观察结果，与先前的方法相比，本发明的方法可以在加载和洗涤步骤两者中使用相同的较低离心机速度，简化和自动化纯化过程，这两者均有助于增加可扩大性。因此，本发明提供了一种纯化mrna的有效、可靠且更安全的方法，所述方法可以适用于使用现有制造设施的大规模制造过程，提供非常高产率的具有临床级完整性和纯度的mrna。

2、在一方面，本发明提供了一种用于纯化信使rna(mrna)的方法，所述方法包括以下步骤：a)使mrna从包含来自所述mrna的制造的一种或多种蛋白质和/或短流产性转录物污染物的溶液中沉淀，以提供包含沉淀mrna的悬浮液；b)将包含所述沉淀mrna的悬浮液加载到包含过滤器的过滤离心机中，其中所述沉淀mrna被所述过滤器保留；c)通过向所述过滤离心机中添加洗涤缓冲剂来洗涤所保留的沉淀mrna；以及d)从所述过滤器中回收所保留的沉淀mrna，其中在加载步骤(b)和洗涤步骤(c)期间使所述过滤离心机以施加小于1300g的重力(g)的离心机速度运行。

3、在一些实施方案中，所述离心机速度施加在约150g与约1300g之间的重力(g)。在一些实施方案中，所述离心机速度施加在约300g与约1300g之间，例如在约400g与约1100g之间的重力(g)。在一些实施方案中，所述离心机速度施加在约500g与约900g之间，例如在约550g与约850g之间的重力(g)。在一些实施方案中，所述离心机速度施加在约550g与约750g之间的重力(g)。在一些实施方案中，所述离心机速度施加在约650g与约750g之间的重力(g)。在特定实施方案中，所述离心机速度施加在约700g与约900g之间，例如在约750g与850g之间(例如约800g)的重力(g)。

4、在一些实施方案中，在加载步骤(b)和洗涤步骤(c)期间使过滤离心机以相同的离心机速度运行。

5、在一些实施方案中，从过滤器中回收所保留的沉淀mrna包括以下步骤：(i)使所保留的沉淀mrna溶解；以及(ii)收集溶解的mrna。

6、在一些实施方案中，所述mrna的沉淀包括添加一种或多种促进mrna沉淀的试剂，例如醇、两亲性聚合物、缓冲剂、盐和/或表面活性剂中的一种或多种。在一些实施方案中，所述一种或多种促进所述mrna沉淀的试剂是：盐、和醇或两亲性聚合物。在一些实施方案中，所述醇是乙醇。在一些实施方案中，所述盐是离液盐。在一些实施方案中，所述盐的最终浓度为2-4m，例如为2.5-3m。在特定实施方案中，所述盐的最终浓度为约2.7m。硫氰酸胍鎓(gscn)是特别适用于本发明的方法的离液盐。在一些实施方案中，所述两亲性聚合物选自普朗尼克、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇(peg)、三乙二醇单甲醚(mteg)或其组合。

7、在一些实施方案中，所述peg的分子量为约200至约40,000g/mol。在一些实施方案中，所述peg的分子量为约200-600g/mol、约2000-10000g/mol或约4000-8000g/mol。在特定实施方案中，所述peg的分子量为约6000g/mol(例如，peg-6000)。

8、在一些实施方案中，所述peg的最终浓度为约10％至约100％重量/体积。在一些实施方案中，所述peg的最终浓度为约50％重量/体积。在一些实施方案中，所述peg的最终浓度小于25％重量/体积。在一些实施方案中，所述peg的最终浓度为约5％至20％重量/体积。在特定实施方案中，所述peg的最终浓度为约10％至15％重量/体积。

9、在一些实施方案中，所述两亲性聚合物是mteg。在一些实施方案中，所述mteg的最终浓度为约10％至约100％重量/体积的浓度。在一些实施方案中，所述mteg的最终浓度为约15％至约45％重量/体积，例如约20％至约40％重量/体积。在一些实施方案中，所述mteg的最终浓度为约20％、约25％、约30％或约35％重量/体积。在特定实施方案中，所述mteg的最终浓度为约25％重量/体积。

10、在一些实施方案中，所述悬浮液包含沉淀mrna、盐和mteg。在一些实施方案中，所述悬浮液中的盐是硫氰酸胍鎓(gscn)。在一些实施方案中，所述悬浮液不含醇，例如乙醇。

11、在一些实施方案中，本发明方法的步骤(a)进一步包括向包含沉淀mrna的悬浮液中添加至少一种助滤剂。在一些实施方案中，所述沉淀mrna与所述至少一种助滤剂的质量比为约1:2；约1:5；约1:10或约1:15。在特定实施方案中，所述沉淀mrna与所述至少一种助滤剂的质量比为约1:10。在一些实施方案中，所述助滤剂是分散剂。在一些实施方案中，所述分散剂是灰、粘土、硅藻土、玻璃珠、塑料珠、聚合物、聚合物珠(例如，聚丙烯珠、聚苯乙烯珠)、盐(例如，纤维素盐)、砂和糖中的一种或多种。在特定实施方案中，所述聚合物是天然存在的聚合物，例如纤维素(例如，粉状纤维素纤维)。

12、在一些实施方案中，所述悬浮液包含至少100mg、1g、10g、100g、250g、500g、1kg、10kg、100kg、1公吨或10公吨或其之间任何量的mrna。在一些实施方案中，所述悬浮液包含大于1kg的mrna。

13、在一些实施方案中，所述过滤器包括多孔基质。在一些实施方案中，所述多孔基质是滤布、滤纸、筛网和丝网。在一些实施方案中，所述过滤器是微滤膜或超滤膜。在一些实施方案中，所述过滤器的平均孔径为约0.5微米或更大、约0.75微米或更大、约1微米或更大、约2微米或更大、约3微米或更大、约4微米或更大或约5微米或更大。在一些实施方案中，所述过滤器的平均孔径为约0.01微米至约200微米、约1微米至约2000微米、约0.2微米至约5微米、或约1微米至约3微米，例如约1微米。在特定实施方案中，所述滤布是平均孔径为约1微米的聚丙烯布。

14、在一些实施方案中，用于洗涤所保留的沉淀mrna的洗涤缓冲剂的体积在约0.5l/gmrna与约8l/g mrna之间。在一些实施方案中，用于洗涤所保留的沉淀mrna的洗涤缓冲剂的体积小于2l/g mrna。在一些实施方案中，用于洗涤所保留的沉淀mrna的洗涤缓冲剂的体积在约0.5l/g mrna与约1.5l/g mrna之间，例如约0.5l/g mrna。在特定实施方案中，用于洗涤所保留的沉淀mrna的洗涤缓冲剂的体积为约0.5l/gmrna或更少。

15、在一些实施方案中，将洗涤缓冲剂以约1升/min至约60升/min的速率，例如以约5升/min至约45升/min的速率加载到过滤离心机中。在一些实施方案中，例如通过使用转子尺寸(即，转筒直径)为约30cm至约170cm的过滤离心机，在约0.5小时至约4小时之间，将总体积的洗涤缓冲剂加载到过滤离心机中。在一些实施方案中，在约0.5小时至约4小时之间，例如小于约90分钟，将所保留的沉淀mrna洗涤至在约50％至约100％之间的纯度。在特定实施方案中，在小于90分钟内，将所保留的沉淀mrna洗涤至至少95％的纯度。在一些实施方案中，将洗涤缓冲剂以取决于过滤离心机的过滤器表面积(即，m2)的速率(例如，约5升/min/m2至约25升/min/m2，例如约15升/min/m2)加载至过滤离心机中。

16、在一些实施方案中，所述洗涤缓冲剂包含醇、两亲性聚合物、缓冲剂、盐和/或表面活性剂中的一种或多种。在一些实施方案中，所述洗涤缓冲剂包含醇或两亲性聚合物。

17、在一些实施方案中，所述洗涤缓冲剂包含乙醇。在一些实施方案中，所述乙醇为约80％重量/体积的浓度。

18、在一些实施方案中，所述洗涤缓冲剂包含选自以下的两亲性聚合物：普朗尼克、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇(peg)、三乙二醇单甲醚(mteg)或其组合。

19、在一些实施方案中，所述两亲性聚合物是peg。在一些实施方案中，所述peg以约10％至约100％重量/体积的浓度存在于所述洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述peg以约50％至约95％重量/体积的浓度存在于所述洗涤溶液中。在特定实施方案中，所述peg以约90％重量/体积的浓度存在于所述洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述peg的分子量为约100至约1,000g/mol。在一些实施方案中，所述peg的分子量为约200-600g/mol。在一些实施方案中，所述peg的分子量为约400g/mol(例如，peg-400)。

20、在一些实施方案中，其中所述两亲性聚合物是mteg。在一些实施方案中，所述mteg以约75％、约80％、约85％、约90％或约95％重量/体积的浓度存在于所述洗涤溶液中。在一些实施方案中，所述mteg以约90％重量/体积的浓度或约95％重量/体积的浓度存在于所述洗涤溶液中。在特定实施方案中，所述mteg以约95％重量/体积的浓度存在于所述洗涤溶液中。

21、在一些实施方案中，所述洗涤缓冲剂不含醇，例如乙醇。

22、在一些实施方案中，所保留的mrna的回收是在所述过滤离心机运行时发生的。在一些实施方案中，所保留的mrna的回收是经由叶片发生的，所述叶片将所保留的沉淀mrna从所述过滤离心机的过滤器中去除。在一些实施方案中，所保留的mrna的回收是在所述过滤离心机不运行时发生的。

23、在一些实施方案中，根据本发明的纯化方法不含醇，例如乙醇。

24、在一些实施方案中，所保留的mrna的溶解包括将所述mrna溶解于水性介质中。在一些实施方案中，所述水性介质包括水、缓冲剂(例如，tris-edta(te)缓冲剂或柠檬酸钠缓冲剂)、糖溶液(例如，蔗糖或海藻糖溶液)或其组合。在一些实施方案中，所述水性介质是注射用水。在一些实施方案中，所述水性介质是te缓冲剂。在一些实施方案中，所述水性介质是10％海藻糖溶液。在一些实施方案中，所述溶解发生在所述过滤离心机内。在一些实施方案中，所述溶解发生在所述过滤离心机外。

25、在一些实施方案中，所溶解的mrna的收集包括一个或多个将所述助滤剂与所溶解的mrna分离的步骤。在一些实施方案中，所述一个或多个用于将所述助滤剂与所溶解的mrna分离的步骤包括将包含所溶解的mrna和助滤剂的溶液应用到过滤器上，其中所述助滤剂被所述过滤器保留，从而产生纯化mrna的溶液。在特定实施方案中，通过离心将包含所溶解的mrna和助滤剂的悬浮液应用到过滤离心机的过滤器上。在一些实施方案中，以小于3100g，例如在约1000g与约3000g之间的重力(g)进行离心。

26、在一些实施方案中，所述过滤离心机是连续离心机和/或所述过滤离心机是竖直或水平取向的，或者所述离心机是倒置卧式离心机。在一些实施方案中，所述过滤离心机包括样品进料口和/或样品排出口。

27、在一些实施方案中，将所述mrna悬浮液以约1升/min至约60升/min的速率，例如以约5升/min至约45升/min的速率加载到所述过滤离心机中。在一些实施方案中，例如通过使用转子尺寸(即，转筒直径)为约30cm至约170cm的过滤离心机，在约0.5小时至约8小时之间，将总mrna悬浮液加载到过滤离心机中。

28、在一些实施方案中，所述mrna的制造包括所述mrna的体外转录(ivt)合成。在一些实施方案中，所述mrna的制造包括所述mrna的3’-加尾的单独步骤。在一些实施方案中，所述mrna的3’-加尾的单独步骤进一步包括所述mrna的5’加帽。在一些实施方案中，所述mrna的ivt合成包括所述mrna的5’-加帽和任选地3’-加尾。

29、在特定实施方案中，在mrna的ivt合成后进行本发明方法的步骤(a)至(d)。在一些实施方案中，用于在ivt合成后洗涤所保留的沉淀mrna的洗涤缓冲剂的体积小于8l/gmrna，例如小于6l/g mrna或小于5l/g mrna。在一些实施方案中，用于在ivt合成后洗涤所保留的沉淀mrna的洗涤缓冲剂的体积在约0.5l/g mrna与约4l/g mrna之间。在一些实施方案中，用于在ivt合成后洗涤所保留的沉淀mrna的洗涤缓冲剂的体积在约0.5l/g mrna与约1.5l/g mrna之间。

30、在一些实施方案中，在mrna的ivt合成后并且再次在mrna的3’-加尾的单独步骤后进行本发明的步骤(a)至(d)。在一些实施方案中，用于在ivt合成后和/或在所述mrna的3’-加尾的单独步骤后洗涤所保留的沉淀mrna的洗涤缓冲剂的总体积小于8l/gmrna，例如小于6l/g mrna或小于5l/g mrna。在一些实施方案中，用于在ivt合成后和/或在所述mrna的3’-加尾的单独步骤后洗涤所保留的沉淀mrna的洗涤缓冲剂的总体积在约0.5l/g mrna与约4l/g mrna之间。在一些实施方案中，用于在ivt合成后和/或在所述mrna的3’-加尾的单独步骤后洗涤所保留的沉淀mrna的洗涤缓冲剂的总体积在约0.5l/g mrna与约1.5l/g mrna之间，例如约1l/g mrna。在特定实施方案中，用于在ivt合成后洗涤所保留的沉淀mrna的洗涤缓冲剂的体积为约0.5l/g mrna。在一个特定实施方案中，用于在mrna的3’-加尾和/或加帽的单独步骤后洗涤所保留的沉淀mrna的洗涤缓冲剂的体积为约0.5l/g mrna。在一个具体实施方案中，用于在ivt合成后以及在mrna的3’-加尾和/或5’-加帽的单独步骤后洗涤所保留的沉淀mrna的洗涤缓冲剂的总体积为约1l/g mrna。

31、在一些实施方案中，所述mrna的长度为或大于约1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb、15kb或20kb。

32、在一些实施方案中，所述mrna包含一种或多种核苷酸修饰。在一些实施方案中，所述一种或多种核苷酸修饰包括经修饰的糖、经修饰的碱基和/或经修饰的糖磷酸酯骨架。

33、在一些实施方案中，所述mrna不包含核苷酸修饰。

34、在一些实施方案中，纯化mrna的回收量为每单一批至少10g、20g、50g、100g、250g、500g、1kg、5kg、10kg、50kg或100kg。在一个实施方案中，纯化mrna的回收量为每单一批至少250g。在另一个实施方案中，纯化mrna的回收量为每单一批至少500g。在一个特定实施方案中，纯化mrna的回收量为每单一批至少1kg。在一些实施方案中，以导致产率为至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或约100％的量回收总纯化mrna。在一些实施方案中，以导致产率为约80％至约100％的量回收总纯化mrna。在一些实施方案中，以导致产率为约90％至约99％的量回收总纯化mrna。在特定实施方案中，以导致产率为至少约90％的量回收总纯化mrna。

35、在一些实施方案中，所述纯化mrna的纯度在约60％与约100％之间。在一些实施方案中，所述纯化mrna的纯度在约80％与99％之间。在一些实施方案中，所述纯化mrna的纯度在约90％与约99％之间。

36、在一些实施方案中，所述纯化mrna的完整性为至少约80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，所述纯化mrna的完整性为或大于约95％。在一些实施方案中，所述纯化mrna的完整性为或大于约98％。在特定实施方案中，所述纯化mrna的完整性为或大于约99％。

37、在一些实施方案中，其中所述纯化mrna在不经进一步纯化的情况下具有临床级纯度。在一些实施方案中，在不进行选自以下的进一步纯化的情况下实现所述临床级纯度：高效液相色谱(hplc)纯化、基于配体或结合的纯化、切向流过滤(tff)纯化和/或离子交换色谱。

38、在一些实施方案中，如通过毛细管电泳确定的，所述纯化mrna包含5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、1％或更少的蛋白质污染物或者基本上不含蛋白质污染物。在一些实施方案中，如通过高效液相色谱(hplc)确定，所述纯化mrna包含小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％的盐污染物或者基本上不含盐污染物。在一些实施方案中，如通过高效液相色谱(hplc)确定，所述纯化mrna包含5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、1％或更少的短流产性转录物污染物或者基本上不含短流产性转录物污染物。在一些实施方案中，如通过毛细管电泳确定的，所述纯化mrna的完整性为95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、或者99％或更多。

39、在一些实施方案中，所述一种或多种蛋白质和/或短流产性转录物污染物包括ivtmrna合成中使用的酶试剂。在特定实施方案中，所述酶试剂包括聚合酶(例如，t7 rna聚合酶或sp6 rna聚合酶)、dna酶i、焦磷酸酶和加帽酶。

40、在一些实施方案中，本发明的方法还去除了长流产性rna种类、双链rna(dsrna)、残留质粒dna、残留溶剂和/或残留盐。在一些实施方案中，所述短流产性转录物污染物包含小于15个碱基。在一些实施方案中，所述短流产性转录物污染物包含约8-12个碱基。在一些实施方案中，本发明的方法还去除了rna酶抑制剂。

41、在另一方面，本发明提供了通过本发明的任一种方法获得的纯化mrna。

42、在另一方面，本发明提供了一种组合物，所述组合物包含通过本发明的任一种方法获得的纯化mrna。在一些实施方案中，所述组合物进一步包含至少一种药学上可接受的赋形剂。

43、在另一方面，本发明提供了一种用于治疗疾病或障碍的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用通过本发明的任一种方法获得的纯化mrna或包含纯化mrna的组合物。

44、在另一个方面，本发明提供了通过本发明的任一种方法获得的纯化mrna或包含纯化mrna的组合物，用于疗法。

45、在另一方面，本发明提供了一种用于纯化mrna的方法，所述方法包括以下步骤：i)在第一器皿中提供包含沉淀mrna的悬浮液，其中所述沉淀mrna包含来自所述mrna的制造中的一种或多种蛋白质和/或短流产性转录物污染物；ii)在第二器皿中提供洗涤缓冲剂；iii)将所述第一器皿的内容物转移到包括过滤器的过滤离心机中，其中所述转移以相对于所述过滤离心机的过滤器的表面积的约5升/min/m2至约25升/min/m2(例如，约15升/min/m2)的速率发生，同时所述过滤离心机以第一离心机速度运行使得所述沉淀mrna保留在所述过滤离心机的过滤器上；iv)将所述第二器皿的内容物转移到所述过滤离心机中，其中所述转移以相对于所述过滤离心机的过滤器的表面积的约5升/min/m2至约25升/min/m2(例如，约15升/min/m2)的速率发生，同时所述过滤离心机保持以所述第一离心机速度运行，从而用所述洗涤缓冲剂洗涤保留在所述过滤离心机的过滤器上的沉淀mrna；以及v)从所述过滤离心机的过滤器上回收所洗涤的沉淀mrna。

46、在一些实施方案中，第一离心机速度施加小于1300g的重力(g)。

47、在本发明方法的一些实施方案中，通过泵送进行步骤(iii)和(iv)中的转移。在一些实施方案中，通过与第一和第二器皿可操作连接的单个泵进行步骤(iii)和(iv)中的泵送。

48、在本发明方法的一些实施方案中，一个或多个阀门控制从第一器皿和第二器皿的转移。

49、在本发明方法的一些实施方案中，经由样品进料口将第一器皿的内容物和第二器皿的内容物转移到过滤离心机。

50、在本发明方法的一些实施方案中，在步骤(v)之后，将过滤离心机的过滤器用包含1％10n naoh的注射用水冲洗。

51、在本发明方法的一些实施方案中，所述包含沉淀mrna的悬浮液包含助滤剂。

52、在本发明方法的一些实施方案中，所述方法进一步包括：i)使步骤(v)中回收的包含助滤剂的所洗涤的沉淀mrna溶解；ii)将来自步骤(i)的溶解的mrna以相对于过滤离心机的过滤器的表面积的约5升/min/m2至约25升/min/m2(例如，约15升/min/m2)的速率转移到一个或所述过滤离心机中，其中所述过滤离心机包括用于保留助滤剂的过滤器；以及iii)通过离心从过滤离心机收集溶解的纯化mrna。

53、在本发明方法的一些实施方案中，通过过滤离心机的样品进料口进行转移。

54、在本发明方法的一些实施方案中，步骤(iii)包括经由过滤离心机的样品排出口收集溶解的纯化mrna。

55、在一个进一步的方面，本发明提供了一种用于纯化mrna的系统，其中所述系统包括：a)用于接收沉淀mrna的第一器皿；b)用于接收洗涤缓冲剂的第二器皿；c)用于接收洗涤的沉淀mrna和/或用于使沉淀mrna溶解的水性介质的第三器皿；d)过滤离心机，所述过滤离心机包括：

56、i)过滤器，其中所述过滤器的布置和尺寸设置为保留沉淀mrna和/或助滤剂，并且使溶解的mrna通过；

57、ii)样品进料口；和

58、iii)样品排出口；

59、e)用于接收纯化mrna的第四器皿，其中所述器皿与过滤离心机的样品排出口连接；f)泵，所述泵被配置为以相对于过滤离心机的过滤器的表面积的约5升/min/m2至约25升/min/m2(例如，约15升/min/m2)的速率引导流过所述系统；其中所述第一器皿、所述第二器皿和所述第三器皿与所述泵的输入端可操作连接，并且其中所述过滤离心机的样品进料口与所述泵的输出端连接；以及g)一个或多个阀门，所述一个或多个阀门被配置为阻止从第一、第二和第三器皿的同时流动。

60、在本发明系统的一些实施方案中，所述系统进一步包括数据处理设备，所述数据处理设备包括用于控制所述系统进行本发明的任何方法的装置。在一些实施方案中，所述数据处理设备是(a)包括指令的计算机程序，或者(b)包括指令的计算机可读存储介质。

61、在一个进一步的方面，本发明还提供了一种组合物，所述组合物包含在无菌的不含rna酶的容器中的相对浓度为约1:1:10的10-1000g mrna、两亲性聚合物和助滤剂。

62、在本发明组合物的一些实施方案中，所述两亲性聚合物包括分子量为约2000-10000g/mol；4000-8000g/mol或约6000g/mol的peg(例如，peg-6000)。在一些实施方案中，所述两亲性聚合物包括mteg。在一些实施方案中，所述助滤剂是基于纤维素的。

63、本发明的各个方面详细描述于以下章节中。章节的使用不意在限制本发明。每个章节可以适用于本发明的任何方面。在本技术中，除非另外陈述，否则“或”的使用意指“和/或”。