1.本发明属于医用材料领域，涉及一种水凝胶的制备过程中的核心交联环节，尤其涉及三组分的交联应用，制作水凝胶过程中交联效率高、交联时间短，制得的水凝胶力学性能高，抑菌性好，透气性好的含氧化石墨烯的海藻酸钠水凝胶新型交联方法。
背景技术：
2.组织工程学通过将生物材料与特定的生物学活性细胞结合，构建具有功能活性的组织/器官，达到治疗目的。在众多应用于组织工程的有效生物材料中，海藻酸盐水凝胶作为一种可高负载水分的天然亲水性聚合网络，由于其与天然细胞外基质的成分具有类似大分子结构，可为各类组织细胞提供细胞外基质的仿生多孔微环境从而促进细胞活性，已成为组织工程生物材料的研究热门。海藻酸盐来自褐藻类海带提取碘后的副产物，来源丰富成本低廉，可在极其温和的条件下与二价钙离子发生离子交换反应，形成单元间离子桥，使其结构中的α-l-古洛糖醛酸单元发生堆叠交联形成水凝胶。由于海藻酸钠水凝胶制备容易且具有可在体内足够的细胞外基质，并且促进ii型胶原蛋白高表达，已被广泛应用于研究软骨细胞或椎间盘细胞的表型、组织和周转以及脂肪衍生的成体干细胞和骨髓衍生的间充质干细胞的分化等相关课题，可解决现有组织工程提供一种低成本、易制备、生物相容性高的仿生天然生物材料。
3.然而目前海藻酸钠水凝胶存在两个关键性问题尚未解决：1.由于交联网络结构单一，海藻酸盐水凝胶通常表现出机械强度差(大约100kpa)，且在植入后，易裂解造成植入体失效；2.由于海藻酸盐自身具有负电荷平衡，与大多数同样表面携带负电的蛋白质产生静电排斥，材料表面的细胞附着性差。并且在现有的海藻酸钠水凝胶应用制备过程中，都引入了有机溶剂或含有毒性的交联剂，既不符合绿色环保理念又增加了细胞毒性，并且交联时间较长，交联效率较低。
4.石墨烯，具有非常大的比表面积和大量的表面官能团，如羟基、羧基、环氧化物和碳基，对蛋白质具有极强的吸附能力，可增强材料界面与细胞的附着性，并且可进行各种功能化修饰。但是石墨烯具有较强的疏水性，亲水性差，因此在水为分散介质的体系中，石墨烯难以分散开，并极易团聚、分层，保存周期短。
5.同时，由于石墨烯与海藻酸钠电负性相同，石墨烯只能作为增强相与聚合物形成单网络结构，对于水凝胶的增强效果十分有限，因此，我们引入天然高分子壳聚糖，利用壳聚糖功能化并中和石墨烯电负性，与此同时，利用壳聚糖的高生物相容性，提高海藻酸钠水凝胶的细胞附着性。
技术实现要素：
6.为了解决现有海藻酸钠-壳聚糖水凝胶机械强度差，细胞附着性差，，并且交联时间较长，交联效率较低，不环保的缺陷，本发明提供了一种制备简单，交联效率高、交联时间短，无生物毒性，原料绿色环保的含氧化石墨烯的环保水凝胶的交联方法，制得的抑菌凝胶
力学性能高，抑菌性好，透气性好。
7.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
8.一种含氧化石墨烯的环保水凝胶的交联方法，包括以下步骤：
9.1)制备氧化石墨烯；
10.2)在去离子水中加入步骤1)制得的氧化石墨烯，超声分散，得到溶液a；
11.3)将氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾，溶于去离子水中，用盐酸调节溶液的ph值，配得到溶液b；
12.4)称取海藻酸钠粉末与壳聚糖粉末，充分混匀，得到混合粉末a；
13.5)将步骤4)的混合粉末a加入至步骤3)的溶液b中，随后加入步骤2)的溶液a，将整个体系进行加热并搅拌处理得到溶液c；
14.6)将步骤5)的溶液c注入容器中，使溶液c均匀覆盖容器表面；
15.7)称取碳酸钙粉末、硫酸钙粉末、氯化钙粉末充分混匀，得到混合粉末b；
16.8)将步骤7)的混合粉末b加入去离子水中，得到溶液d；
17.9)将覆盖溶液c的容器浸入溶液d中，随后取出，静置等待交联，得到含氧化石墨烯的环保水凝胶。
18.在本发明中，本发明通过天然高分子壳聚糖功能化并中和石墨烯电负性，制备仿生化石墨烯/壳聚糖单网络结构，控制微结构实现机械强度与孔隙率优化，再通过离子交联反应与海藻酸盐在原网络基础上实现自组装交联构建双网络壳聚糖/石墨烯/海藻酸盐水凝胶。利用石墨烯良好的蛋白质吸附功能及机械增强功能，解决海藻酸盐水凝胶自身功能缺陷，并且在制备过程中只采用壳聚糖这类成本低来源广的天然高分子材料，既解决了毒性与环保问题，又在水凝胶中促进石墨烯分散并与海藻酸钠形成双网络增强结构，提高了水凝胶的力学性能与抗裂解性能。同时由于石墨烯自身的抗菌功能，使水凝胶具有长期抑菌能力，达到长期控制病菌感染的作用。本发明制备了一种兼具高力学性能、抑制微生物生长、促进细胞附着、增殖和分化、制备方法简易、无生物毒性的水凝胶生物复合材料。
19.本发明使用碳酸钙粉末、硫酸钙粉末、氯化钙粉末的混合体系作为交联剂，制作水凝胶过程中交联效率高、交联时间短。
20.作为本发明的一种优选方案，步骤1)中，具体制备方法为：
21.a)将石墨粉分散在浓硫酸中，在磁子搅拌下加热80℃反应；
22.b)将步骤a)所得混合物转移至冰浴中，加入高锰酸钾，搅拌混匀反应12小时；
23.c)将步骤b)所得混合物加热，稀释，继续反应；
24.d)在步骤c)所得混合物中加入双氧水，迅速混合；
25.e)将步骤d)所得混合物离心，去除上清，用稀盐酸和去离子水清洗若干遍；
26.f)将步骤e)所得混合物用超声探头剥离，离心，得到上清液；
27.g)将步骤f)所得上清液进一步用超声探头超声，过滤，干燥得到氧化石墨烯固体。
28.在本技术方案中，步骤a)中，所述石墨粉和浓硫酸的质量体积比为1:20～1:25g/ml；和/或，所述浓硫酸的质量分数为97～99％；反应温度为室温15～35℃；反应时间为10～14h；
29.步骤b)中，所述高锰酸钾质量为3.5～4.5g；搅拌时间为0.5～1.5h；反应温度为30～50℃；反应时间为20～40min；
30.步骤c)中，所述加热温度为80～120℃；所述稀释终体积为90～110ml；所述反应时间为20～40min；
31.步骤d)中，所述加入的双氧水的体积分数为20-40％；所述加入双氧水的体积为5～15ml；所述加入双氧水混合后的溶液特征为迅速变成亮黄色；
32.步骤e)中，所述加入的稀盐酸的体积分数为2～8％；所述清洗若干遍后的溶液特征为呈中性；所述超声剥离的功率为200～600w；和/或，所述超声剥离的时间为10～50min；所述离心的转速为8000～12000rpm；和/或，所述离心的时间为20～40min；
33.步骤f)中，所述超声剥离的功率为400～600w；和/或，所述超声时间为1～3h；所述干燥时间为12h。
34.作为本发明的一种优选方案，步骤2)中，超声分散的次数为2-5次，每次超声分散的时间为15-25min，间隙时间为25-35min，超声功率为250-300w，溶液a中，氧化石墨烯的浓度为8-12mg/ml。
35.作为本发明的一种优选方案，步骤3)中，氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾与去离子水的质量比为8：0.2：1.44：0.24：1000，ph值为7-8。
36.作为本发明的一种优选方案，步骤4)中，海藻酸钠与壳聚糖的质量比为1：0.1～1：10。
37.作为本发明的一种优选方案，步骤5)中，按重量份数计，混合粉末a为2-20份，溶液b为94份，溶液a为0-20份；反应的温度为40-60℃，搅拌时间为2-12h。
38.作为本发明的一种优选方案，步骤7)中，碳酸钙、硫酸钙与氯化钙的质量比为1：0.1：0.1～1：10：10。
39.作为本发明的一种优选方案，步骤8)中，混合粉末b与去离子水的质量比为1：13～1：53。
40.作为本发明的一种优选方案，步骤9)中，覆盖溶液c的容器的浸入时间为0～60min；交联时间为2～12h。
41.作为本发明的一种优选方案，还包括步骤10)，交联完成后的水凝胶置于紫外灯下照射1-3h。
42.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
43.1)本发明的原料中壳聚糖成本低，来源广，解决了毒性与环保的问题，符合绿色环保的理念；
44.2)本发明利用氧化石墨烯的抗菌功能，使得水凝胶具有长期抑菌能力，达到长期控制病菌感染的作用；
45.3)本发明利用氧化石墨烯表面上丰富的羟基、羧基和环氧基等基团，通过氢键和化学键与亲水性基质形成一个良好的界面作用，水凝胶的溶胀性能会得以提高；此外，由于氧化石墨烯的机械性能，水凝胶的机械强度也得以提高；
46.4)本发明的三组分的交联应用，制作水凝胶过程中交联效率高、交联时间短；
47.5)本发明制得的水凝胶生物复合材料可应用于1)医疗美容领域，在开发伤口敷料和人工皮肤上具有较大的潜在价值；2)生物组织工程领域，可供开发人工植入软骨组织；3)载药和靶向运输领域，可为载药材料提供参考价值；4)药物包装领域，可作为内服药物胶囊材料进一步开发。
具体实施方式
48.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
49.实施例1
50.本实施例提供了一种含氧化石墨烯的环保水凝胶的交联方法，包括以下步骤：
51.(1)将石墨粉制备成氧化石墨烯，其包括：
52.a)以石墨粉和浓硫酸的质量体积比为1:23g/ml，将石墨粉分散在质量分数为98％的浓硫酸中，在磁子搅拌下25℃反应12h；
53.b)将步骤a)所得混合物转移至冰浴中，加入4g高锰酸钾，搅拌1h混匀，40℃加热反应30min；
54.c)将步骤b)所得混合物100℃加热，稀释为100ml，继续反应30min；
55.d)在步骤c)所得混合物中加入10ml体积分数为30％的双氧水，迅速混合，混合后溶液迅速变为亮黄色。
56.e)将步骤d)所得混合物离心，去除上清，用体积分数为5％的稀盐酸和去离子水清洗若干遍，最终得到的溶液呈中性；
57.f)将步骤e)所得混合物用功率为400w的超声探头剥离30min，在10000rpm的转速下离心30min，得到上清液；
58.g)将步骤f)所得上清液进一步用功率为520w的超声探头超声2h，过滤，干燥12h得到氧化石墨烯固体；
59.(2)称取适量氧化石墨烯在去离子水中超声分散，超声功率为285w，超声分散时间为每次20分钟，共3次，间歇时间为30分钟，最终得到均匀的10mg/ml的a溶液；
60.(3)将8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠、0.24g磷酸氢二钾，溶于1000g去离子水中，用盐酸调节溶液的ph值至ph＝7.4，配制成b溶液；
61.(4)按海藻酸钠：壳聚糖＝1：1的比例，称取海藻酸钠粉末与壳聚糖粉末，充分混匀，得到混合粉末a；
62.(5)将0.6g混合粉末a加入至9.4g的b溶液中，随后加入0.4g的a溶液，将整个体系进行50℃加热并搅拌8小时处理得到c溶液；
63.(6)将c溶液倒出至培养皿中，并均匀覆盖培养皿表面；
64.(7)按碳酸钙粉末：硫酸钙粉末：氯化钙粉末＝1：1.721：2.219，将碳酸钙粉末、硫酸钙粉末、氯化钙粉末充分混匀，得到混合粉末b；
65.(8)按混合粉末b：去离子水＝1：53的比例，将混合粉末b加入至去离子水中，配制得到d溶液；
66.(9)将覆盖c溶液的培养皿浸入d溶液中5min，随后取出，静置等待交联4h。
67.实施例2
68.本实施例提供了一种含氧化石墨烯的环保水凝胶的交联方法，包括以下步骤：
69.(1)将石墨粉制备成氧化石墨烯，其包括：
70.a)以石墨粉和浓硫酸的质量体积比为1:25g/ml，将石墨粉分散在质量分数为98％
的浓硫酸中，在磁子搅拌下35℃反应14h；
71.b)将步骤a)所得混合物转移至冰浴中，加入4.5g高锰酸钾，搅拌1.5h混匀，50℃加热反应40min；
72.c)将步骤b)所得混合物120℃加热，稀释为110ml，继续反应40min；
73.d)在步骤c)所得混合物中加入15ml体积分数为40％的双氧水，迅速混合，混合后溶液迅速变为亮黄色。
74.e)将步骤d)所得混合物离心，去除上清，用体积分数为8％的稀盐酸和去离子水清洗若干遍，最终得到的溶液呈中性；
75.f)将步骤e)所得混合物用功率为600w的超声探头剥离50min，在12000rpm的转速下离心40min，得到上清液；
76.g)将步骤f)所得上清液进一步用功率为600w的超声探头超声3h，过滤，干燥12h得到氧化石墨烯固体；
77.(2)称取适量氧化石墨烯在去离子水中超声分散，超声功率为285w，超声分散时间为每次20分钟，共3次，间歇时间为30分钟，最终得到均匀的10mg/ml的a溶液；
78.(3)将8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠、0.24g磷酸氢二钾，溶于1000g去离子水中，用盐酸调节溶液的ph值至ph＝7.4，配制成b溶液；
79.(4)按海藻酸钠：壳聚糖＝1：1的比例，称取海藻酸钠粉末与壳聚糖粉末，充分混匀，得到混合粉末a；
80.(5)将0.6g混合粉末a加入至9.4g的b溶液中，随后加入1g的a溶液，将整个体系进行50℃加热并搅拌8小时处理得到c溶液；
81.(6)将c溶液倒出至培养皿中，并均匀覆盖培养皿表面；
82.(7)按碳酸钙粉末：硫酸钙粉末：氯化钙粉末＝1：1.721：2.219，将碳酸钙粉末、硫酸钙粉末、氯化钙粉末充分混匀，得到混合粉末b；
83.(8)按混合粉末b：去离子水＝1：53的比例，将混合粉末b加入至去离子水中，配制得到d溶液；
84.(9)将覆盖c溶液的培养皿浸入d溶液中5min，随后取出，静置等待交联4h。
85.实施例3
86.本实施例提供了一种含氧化石墨烯的环保水凝胶的交联方法，包括以下步骤：
87.(1)将石墨粉制备成氧化石墨烯，其包括：
88.a)以石墨粉和浓硫酸的质量体积比为1:20g/ml，将石墨粉分散在质量分数为98％的浓硫酸中，在磁子搅拌下15℃反应10h；
89.b)将步骤a)所得混合物转移至冰浴中，加入3.5g高锰酸钾，搅拌0.5h混匀，30℃加热反应20min；
90.c)将步骤b)所得混合物80℃加热，稀释为90ml，继续反应20min；
91.d)在步骤c)所得混合物中加入5ml体积分数为20％的双氧水，迅速混合，混合后溶液迅速变为亮黄色。
92.e)将步骤d)所得混合物离心，去除上清，用体积分数为2％的稀盐酸和去离子水清洗若干遍，最终得到的溶液呈中性；
93.f)将步骤e)所得混合物用功率为200w的超声探头剥离10min，在8000rpm的转速下
离心20min，得到上清液；
94.g)将步骤f)所得上清液进一步用功率为400w的超声探头超声1h，过滤，干燥12h得到氧化石墨烯固体；
95.(2)称取适量氧化石墨烯在去离子水中超声分散，超声功率为285w，超声分散时间为每次20分钟，共3次，间歇时间为30分钟，最终得到均匀的10mg/ml的a溶液；
96.(3)将8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠、0.24g磷酸氢二钾，溶于1000g去离子水中，用盐酸调节溶液的ph值至ph＝7.4，配制成b溶液；
97.(4)按海藻酸钠：壳聚糖＝1：1的比例，称取海藻酸钠粉末与壳聚糖粉末，充分混匀，得到混合粉末a；
98.(5)将0.6g混合粉末a加入至9.4g的b溶液中，随后加入1.2g的a溶液，将整个体系进行50℃加热并搅拌8小时处理得到c溶液；
99.(6)将c溶液倒出至培养皿中，并均匀覆盖培养皿表面；
100.(7)按碳酸钙粉末：硫酸钙粉末：氯化钙粉末＝1：1.721：2.219，将碳酸钙粉末、硫酸钙粉末、氯化钙粉末充分混匀，得到混合粉末b；
101.(8)按混合粉末b：去离子水＝1：53的比例，将混合粉末b加入至去离子水中，配制得到d溶液；
102.(9)将覆盖c溶液的培养皿浸入d溶液中5min，随后取出，静置等待交联4h。
103.(10)交联完成的水凝胶置于紫外灯下照射2小时。
104.对比例1，与实施例1相同，唯一区别是交联剂组分不加入氯化钙粉末。
105.对比例2，与实施例1相同，唯一区别是交联剂组分只加入氯化钙粉末。
106.对实施例1制得的含氧化石墨烯的环保水凝胶，与对比例1与对比例2制得的水凝胶进行交联速率测试，结果见表1。
107.表1.交联时间检测
[0108][0109][0110]
由表1可见，在添加了氯化钙作为交联剂组分后，水凝胶的交联时间具有明显缩减。
[0111]
本发明的水凝胶通过氯化钙、硫酸钙、与碳酸钙三组分交联剂进行交联，其中壳聚糖促进石墨烯分散并与海藻酸钠形成双网络增强结构，并由于氧化石墨烯的存在，具有自组装多层多孔结构，表面可修饰多种形态的大分子，例如各类晶体，金属粒子，负载不同的功能因子。
[0112]
例如，本发明的水凝胶可负载由贻贝提取物与洋葱提取物为主的组合成分，用于祛疤与止痒；可负载生长因子，用于促进细胞修复与增殖。
[0113]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，
应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。