一种基于SERS检测技术的过滤式微流控细菌芯片及使用方法

一种基于sers检测技术的过滤式微流控细菌芯片及使用方法
技术领域
1.本发明涉及生化检测技术领域，具体涉及一种基于sers检测技术的过滤式微流控细菌芯片及使用方法。


背景技术：

2.致病菌感染引发的传染性疾病，在世界范围内对公众健康构成巨大威胁，因此对病原菌进行快速、灵敏的检测和识别，以避免和减少对环境、食品的污染和细菌感染，已成临床诊断和食品监控等领域迫切需求。
3.传统细菌培养法是细菌鉴定的金标准方法，准确度高，但耗时长，通常需要2-5天，不能满足细菌快速检测的需求。一些新的细菌检测方法如聚合酶链反应(pcr)和酶联免疫吸附试验(elisa)，尽管缩短了检测时间，但需要特殊昂贵的设备并配备训练有素的专业人员，测试成本较高，也难以实现现场快速检测。因此，如何实现高灵敏度、高特异性快速识别病原体是目前急需解决的技术难题。
4.近年来，表面增强拉曼技术(sers)由于具有操作简单、检测速度快，灵敏度高、细菌指纹谱图信息丰富，已成为一种有应用前景的细菌快速检测技术。然而，由于激光拉曼仪器的光斑很小，在sers检测前，必须将细菌富集并捕获于sers基底上。因此，存在样品预处理过程繁琐、耗时长，且细菌易污染等问题。将微流控芯片的在线分离、富集与sers技术的原位、高灵敏度、高特异性检测结合，为细菌检测提供一种闭环控制式的检测环境，可避免细菌污染，成为目前细菌检测的研究热点。但是，目前基于sers检测技术的微流控细菌芯片依然存在微通道内集成有序sers基底时，集成难度大、制备成本高、灵敏度低及细菌富集捕获效率不高等问题。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于sers检测技术的过滤式微流控细菌芯片及使用方法，解决了现有技术中微通道内集成有序sers基底时，集成难度大、制备成本高、灵敏度低及细菌富集捕获效率不高等问题，可实现样品中细菌的分离和膜过滤捕获和sers原位检测。在微孔滤膜上的纳米增强材料，通过两个进样通道通入反应液，原位集成纳米增强颗粒，具有很好的均匀性和sers灵敏度。
6.为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
7.本发明公开了一种基于sers检测技术的过滤式微流控细菌芯片，包括加样区和与加样区连通的分离区，所述分离区的末端连通有分流区，所述分流区分别连通有废液口ⅰ和螺旋分离区，所述螺旋分离区的末端分别连通废液口ⅱ和过滤检测腔。
8.优选的，所述过滤检测腔内设置有微孔滤膜，所述螺旋分离区的末端与微孔滤膜的上层区域连通；所述过滤检测腔的一侧连通有废液口ⅲ，所述废液口ⅲ与微孔滤膜的下层区域连通。
9.优选的，所述过滤检测腔的一侧连通有进样区，在所述微孔滤膜上原位合成有纳
米增强基底的检测单元。
10.优选的，所述加样区包括数个加样口和分别与加样口连通的加样通道，所述分离区包括分离通道，数个所述加样通道汇合后与分离通道连通，所述分离通道的两侧呈对称设置的锯齿形。
11.优选的，所述螺旋分离区包括螺旋通道，所述螺旋通道由外圈向中心盘绕，盘绕到中心后再从中心向外圈盘绕，形成双螺旋通道。
12.优选的，所述分离通道与螺旋通道连通，所述废液口ⅱ与螺旋通道的内侧连通，所述过滤检测腔与螺旋通道的外侧连通。
13.优选的，所述分流区包括数个分流通道，其中一个所述分流通道连通所述废液口ⅰ，其余所述分流通道汇合后连通所述螺旋通道。
14.优选的，所述进样区包括数个进样口和分别与进样口连通的进样通道，其中一个所述进样通道与过滤检测腔连通，其余所述进样通道汇合后连通有混合通道，所述混合通道与过滤检测腔连通。
15.优选的，包括上层芯片和下层芯片，所述加样区、分离区、分流区、废液口ⅰ、螺旋分离区、废液口ⅱ均设置在上层芯片上，所述过滤检测腔包括对称设置在上层芯片和下层芯片相对应的板面上的上检测槽和下检测槽，所述进样区与上检测槽连通，所述废液口ⅲ与下检测槽连通。
16.相应的，一种基于sers检测技术的过滤式微流控细菌芯片的使用方法，包括以下步骤：
17.(1)将所述上层芯片和下层芯片合并后通过夹具固定，在进样区注入纳米增强材料的反应液，在所述微孔滤膜上原位合成有纳米增强基底的检测单元；
18.(2)在所述加样区加入生物样本，所述生物样本流过分离区，杂质从废液口ⅰ排出，其余样液通过分流区进入到螺旋分离区，截留生物样本中的细菌，杂质从废液口ⅱ排出；
19.(3)将截留的生物样本中的细菌冲入到微孔滤膜上，用拉曼光谱仪检测细菌的sers信号。
20.优选的，所述夹具包括对称设置在芯片长度方向两侧的第一竖板，所述第一竖板的侧面上横向设置有第一固定夹板和设置在第一固定夹板上方的第一活动夹板，所述第一活动夹板上贯穿设置有将第一固定夹板和第一活动夹板固定的固定件；
21.所述芯片宽度方向的两侧设置有第二竖板，所述第二竖板的侧面上设置有第二固定夹板和设置在第二固定夹板上方的第二活动夹板，所述第二固定夹板和第二活动夹板的中心处横向且对称设置有支撑板，所述第二固定夹板和第二活动夹板的侧壁上、位于支撑板的两侧分别设置有卡块，所述第一固定夹板和第一活动夹板宽度方向上的侧壁上设置有与卡块适配的卡槽。
22.本发明具备以下有益效果：
23.1.本发明利用分离通道形成的多孔流与双螺旋通道的惯性分离作用将样品中的细菌与其它颗粒分离，然后将螺旋通道聚集的细菌通入过滤检测腔，将细菌过滤到具有高灵敏度和高度均匀sers基底的微孔滤膜，可以实现细菌的原位、特异性检测。本发明将多孔流单元(分离通道)与螺旋分选单元(螺旋通道)相连，形成两级分选，有利于提高细菌分离效率。
24.2.本发明设置了2-3个与微孔滤膜上层区域直接相连的进样通道，专用于通入sers基底制备液，既可实现滤膜上sers基底的原位、可控制备，又能避免在pdms通道内生成纳米颗粒，芯片由pdms加工制作，其里面的微通道也可以叫pdms通道。
25.3.本发明通过在微流控细菌芯片上构建多孔流和双螺旋两级惯性分离道及集成有纳米增强基底的微孔滤膜，实现了样品中细菌的分离和捕获，结合拉曼检测检测获得细菌光谱信息，判断样品是否存在细菌污染，不仅能够有效的缩短细菌检测时长，可以在30分钟内快速检测和细菌，检测成本较低，同时利用细菌光谱的特异性，能够识别细菌种类。
附图说明
26.图1为本发明芯片结构示意图；
27.图2为上层芯片的仰视图；
28.图3为图2中a局部放大图；
29.图4为图2中b局部放大图；
30.图5为第一竖板和第二竖板相邻一侧配合后的结构示意图(只展示部分配合的状态，其余几侧配合的方式相同，不带固定件)；
31.图6为第一竖板以及与第一固定夹板和第一活动夹板的连接示意图；
32.图7为第二竖板以及与第二固定夹板和第二活动夹板的连接示意图；
33.图8为固定件在第一活动夹板上的示意图；
34.图9为固定件将第一活动夹板和第一固定夹板固定后的示意图；
35.图10为微孔滤膜上负载纳米银的sem图；
36.图11为拉曼光谱仪检测后的sers谱图；
37.图12为细菌在芯片上的sem图；
38.图中：废液口ⅰ1、废液口ⅱ2、微孔滤膜3、废液口ⅲ4、加样口5、加样通道6、分离通道7、螺旋通道8、分流通道9、进样口10、进样通道11、混合通道12、上层芯片13、下层芯片14、上检测槽15、下检测槽16、第一竖板17、第一固定夹板18、第一活动夹板19、第二竖板20、第二固定夹板21、第二活动夹板22、支撑板23、卡块24、卡槽25、第一滑块26、第一滑槽27、第二滑块28、第二滑槽29、螺柱30、固定套31、螺纹套32、通孔33、凹槽34、第一挡板35、缺口36、第二挡板37。
具体实施方式
39.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
40.若未特别指明，实施举例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
41.1.参考图1～图4所示，本发明公开了一种基于sers检测技术的过滤式微流控细菌芯片，包括加样区和与加样区连通的分离区，分离区的末端连通有分流区，分流区分别连通有废液口ⅰ1和螺旋分离区，螺旋分离区的末端分别连通废液口ⅱ2和过滤检测腔。其中，过
滤检测腔内设置有微孔滤膜3，微孔滤膜为现有技术，通过购买即可获得。微孔滤膜3将过滤检测腔分为上下两个区域。螺旋分离区的末端与微孔滤膜3的上层区域连通；过滤检测腔的一侧连通有废液口ⅲ4，废液口ⅲ4与微孔滤膜3的下层区域连通，主要是通过通道将废液口ⅲ4与微孔滤膜3的下层区域连通。
42.进一步的，为了能够在微孔滤膜上原位合成sers基底，在过滤检测腔的一侧连通有进样区，从而在微孔滤膜3上原位合成有纳米增强基底的检测单元。其中，进样区与过滤检测腔的上层区域连通，从而使试剂通过进样区进入到过滤检测腔内的微孔滤膜上。
43.进一步的，加样区包括数个加样口5和分别与加样口5连通的加样通道6，分离区包括分离通道7，数个加样通道6汇合后与分离通道7连通，分离通道7的两侧呈对称设置的锯齿形。本发明中，加样口5和加样通道6的数量相同，一个加样口对应一个加样通道。加样口5至少设置1～3个，本实施例中设置有2个，加样通道6的入口宽度为300～1000μm，高50～100μm。对于分离通道7可理解为由多个相互分离的菱形构型的单元组成，具体形状参考图3所示。本实施例中，分离通道7的菱形构型单元的数量优选为20～80个。
44.进一步的，螺旋分离区包括螺旋通道8，螺旋通道8由外圈向中心盘绕，盘绕到中心后再从中心向外圈盘绕，形成双螺旋通道。具体可参考图2所示，可理解为螺旋通道8由直径最大处向直径最小处盘绕，绕到中心后，再向直径最大处盘绕，在反向盘绕时，螺旋通道从最开始盘绕的通道之间的间隙处向外盘绕，从而构成的双螺旋通道。螺旋通道8的宽度为100～300μm，高度为50～100μm，螺旋圈数为2～10圈。
45.进一步的，分离通道7与螺旋通道8连通，螺旋通道8设置有两个出口。废液口ⅱ2与螺旋通道8的内侧连通，过滤检测腔与螺旋通道8的外侧连通。需要说明的是：这里的内侧指的是朝向螺旋通道8弯曲方向的位置，外侧指的是靠近芯片边缘处的位置，即废液口ⅱ2与螺旋通道8弯道的内壁面连通，过滤检测腔(上层区域)与弯道的外壁面连通。
46.进一步的，分流区包括数个分流通道9，其中一个分流通道9连通废液口ⅰ1，其余分流通道9汇合后连通螺旋通道8。本实施例中，分流通道9优选为设置3个，其中一个连通废液口ⅰ1，另外两个汇合后连通螺旋通道8，且连接液口ⅰ1的分流通道位于另外两个分流通道之间。参考图1、2所示，另外两个分流通道9的形状带有转角，转角的数量根据需要进行设置。
47.进一步的，进样区包括数个进样口10和分别与进样口10连通的进样通道11，其中一个进样通道11与过滤检测腔连通，其余进样通道11汇合后连通有混合通道12，混合通道12与过滤检测腔的上层区域连通。需要说明的是：本实施例中，进样口10优选为设置3个，进样通道11与进样口10数量相同，且分别连通。混合通道12为连续的s形通道，用于将不同的试剂进行混合反应。
48.进一步的，微孔滤膜上纳米增强材料的制备过程为：以30μl～200μl/min的流速从进样口10(通过进样通道与过滤检测腔直接连通的进样口)通入0.001～0.05m的sncl2溶液，1～2min，待溶液抽干后；以30μl～200μl/min的速度从进样口10(与混合通道12连通的其中一个进样口)通入0.00001～0.0005m agno3(或氯金酸)溶液1～2分钟，然后通入去离子水冲洗进样通道，上述步骤可以重复2～5次，以生成密集的ag(或au)纳米种子；然后，同时分别从进样口10(与混合通道12连通的其中一个进样口)通入0.05～0.2m的agno3溶液，进样口10(与混合通道12连通的另外一个进样口)进样0.05～0.2m的抗坏血酸，经混合通道12后，进入微孔滤膜反应区(过滤检测腔的上层区域)，反应2～30min，反应结束后用去离子
水冲洗干净，制备得到在微孔滤膜上原位集成有纳米增强基底的sers检测单元。sncl2溶液的添加能够增加纳米银和微孔滤膜的结合力，让纳米银长的滤纸上。具体的：氯化亚锡起到敏化作用，滤纸上吸附一层sn
2+
后水洗，生成微溶于水的凝胶状物质sn2(oh)3cl，在含ag
+
的化学沉积液中，sn
2+
将ag
+
还原成金属银，成为后续银sn
2+
(aq)+2ag
+
→
sn
4+
(aq)+2ag(s)。金属金的生成原理也是如此。
49.更进一步的，参考图1所示，本发明所公开的芯片包括上层芯片13和下层芯片14，加样区、分离区、分流区、废液口ⅰ1、螺旋分离区、废液口ⅱ2均设置在上层芯片13上，过滤检测腔包括对称设置在上层芯片13和下层芯片14相对应的板面上的上检测槽15和下检测槽16，进样区与上检测槽15连通，废液口ⅲ4通过通道与下检测槽16连通。上检测槽15和下检测槽16的形状大小相同，微孔滤膜的形状与检测槽的形状大小相同，用以将上、下检测槽隔离开，且在放置时注意位置对齐。废液口ⅲ4贯穿开设在上层芯片13上，并部分开设在下层芯片14上，同时，通道也开设在下层芯片上连通下检测槽和废液口ⅲ4。本实施例中，在加样口、进样口和各废液口上均连接硅胶管最为入口和出口，便于进样和排液。芯片的材料为现有材料，主要含有pdms(聚二甲基硅氧烷)。
50.2.参考图5～图9所示，本发明公开了一种基于sers检测技术的过滤式微流控细菌芯片的使用方法，包括以下步骤：
51.(1)将上层芯片13和下层芯片14合并后通过夹具固定，在进样区注入纳米增强材料的反应液，在微孔滤膜3上原位合成有纳米增强基底的检测单元；
52.(2)在加样区加入生物样本，生物样本流过分离区，杂质从废液口ⅰ1排出，其余样液通过分流区进入到螺旋分离区，截留生物样本中的细菌，杂质从废液口ⅱ2排出；
53.(3)将截留的生物样本中的细菌冲入到微孔滤膜3上，用拉曼光谱仪检测细菌的sers信号。
54.进一步的，夹具包括对称设置在芯片长度方向两侧的第一竖板17，第一竖板17的侧面上横向设置有第一固定夹板18和设置在第一固定夹板18上方的第一活动夹板19，第一活动夹板19上贯穿设置有将第一固定夹板18和第一活动夹板19固定的固定件。
55.需要说明的是：第一固定夹板18和第一活动夹板19大小相同，且相互平行，第一固定夹板18设置在第一竖板17侧壁上靠近其底部，最好是与第一竖板的底部齐平。第一活动夹板19在第一竖板17上可上下移动。具体的：第一活动夹板19与第一竖板17对应的壁上设置有至少一个呈t形的第一滑块26，而第一竖板17的侧壁上设置有与第一滑块26适配的第一滑槽27，本实施例中，第一滑块和第一滑槽优选为分别设置2个，且靠近第一活动夹板和第一竖板的两侧设置。第一竖板设置有两个，主要用于固定芯片(长层芯片和下层芯片)长度方向的两侧。通过上下移动第一活动夹板19从而使其能够固定不同厚度的芯片。
56.进一步的，在芯片宽度方向的两侧设置有第二竖板20，第二竖板20主要用于对芯片宽度方向进行夹紧固定。第二竖板20的侧面上设置有第二固定夹板21和设置在第二固定夹板21上方的第二活动夹板22，第二固定夹板21和第二活动夹板22相互平行，且第二固定夹板21与第二竖板20的底面齐平。第二固定夹板21和第二活动夹板22的中心处横向且对称设置有支撑板23，第二固定夹板21上的支撑板23主要用于支撑芯片的边缘，第二活动夹板22上的支撑板23主要用于压紧芯片。第二固定夹板21和第二活动夹板22的侧壁上、位于支撑板23的两侧分别设置有卡块24，参考图5、7所示，第一固定夹板18和第一活动夹板19宽度
方向上的侧壁上设置有与卡块24适配的卡槽25。卡槽25和卡块24的设置使得第一活动夹板向下(向第一固定夹板)方向运动时，会带着第二活动夹板向下运动，从而实现对芯片的4侧边进行夹紧固定。
57.需要说明的是：支撑板23的厚度与第二固定夹板和第二活动夹板相同，且两个支撑板23大小相同对称设置。第二活动夹板22能够沿着第二竖板20上下移动，具体的：在第二活动夹板22与第二竖板20对应的侧壁上设置有至少一个呈t形的第二滑块28，在第二竖板20的侧壁上设置有与第二滑块适配的第二滑槽29。第二滑块和第二滑槽优选为设置两个，靠近第二活动夹板和第二竖板的两侧设置。
58.进一步的，固定件包括贯穿第一活动夹板19的螺柱30，螺柱30的底端部分插入到第一固定夹板18内，位于第一活动夹板19上方的螺柱30上套设有固定套31，固定套31的底部设置有带内螺纹并与螺柱30适配的螺纹套32，螺纹套32套设在螺柱30上，螺纹套32插入设置在第一活动夹板19上。需要说明的是：固定套31可选择性的设置有内螺纹，并与螺柱30适配，使固定套和螺纹套与螺柱之间通过螺纹连接固定。同时，在旋拧固定套31时，固定套带着螺纹槽朝向第一固定夹板方向运动，进而带着第一活动夹板向下运动，最终实现第一活动夹板将芯片固定在第一固定夹板上。同时可理解为：在第一活动夹板19上设置有供螺纹套32穿过的通孔33，第一固定夹板的板面上设置有与通孔33对应的凹槽34，且螺柱30的一端伸进凹槽内，避免螺柱的底端在第一固定夹板上移位或倾斜。固定件将第一固定夹板和第一活动夹板固定后的状态见图9所示。
59.进一步的，为了避免夹具在对芯片进行固定前，上层芯片和下层芯片出现错位没有对齐的情况，在第一固定夹板18上竖直设置有相互平行且与第一竖板17垂直的第一挡板35，两个第一挡板35相互平行，两个第一挡板35之间的距离即为芯片的长度。第一挡板35的顶部贯穿第一活动夹板19，即第一活动夹板19上设置有供第一挡板35穿过的缺口36。同理，在第二固定夹板21上竖直设置有与第二竖板20平行的第二挡板37。第二挡板37的顶部贯穿第二活动夹板22，即第二活动夹板22上设置有供第二挡板37穿过的方形孔，使第一活动夹板19带着第二活动夹板22上下移动时，沿着第一挡板35和第二挡板37上下移动。
60.进一步的，第一竖板17和第二竖板20以及设置在竖板上的固定夹板和活动夹板配合后的状态见图5所示。此时，第一挡板35和第二挡板37位于同一平面上，而第二挡板的长度和两个第一挡板的宽度会大于芯片的宽度，因为挡板和支撑板23会分别沿着缺口和方形孔上下移动，这就意味着第一挡板的宽度，要小于第二活动夹板的宽度，第二挡板的长度会小于设置在第二活动夹板上的支撑板的长度，但是这并不影响上层芯片和下层芯片的边缘对齐固定。
61.为了能够适应不同尺寸的芯片，可根据实际情况将挡板和固定夹板之间设置成可拆卸式的，在支撑板上设置多个方形孔，在第二活动夹板上设置多个缺口，挡板和第一固定夹板以及支撑板的设置方式可通过凹槽进行配合，根据如何可根据实际情况进行设置即可。本发明中固定件设置在第一活动夹板靠近其两端的位置，如图5所示，避免固定件影响芯片。采用本发明所公开的夹具能够更好的对芯片进行固定，能有效的避免上层芯片和下层芯片漏液。
62.下面结合具体的实施例对本发明进行进一步的阐述。
63.1.微孔滤膜上纳米增强材料的原位制备
64.以100μl/min的流速从进样口10(通过进样通道与过滤检测腔直接连通的进样口)通入0.02m的sncl2溶液，1min，待溶液抽干后，用少量去离子水冲洗，把多余的cl离子洗掉；以100μl/min的速度从进样口10(与混合通道12连通的其中一个进样口)通入0.5mm agno3溶液1min，然后通入去离子水冲洗进样通道，上述步骤可以重复3次，以生成密集的ag纳米种子；用少量去离子水冲洗，把多余的cl离子洗掉，然后，同时分别从进样口10(与混合通道12连通的其中一个进样口)通入0.05m的agno3溶液，进样口10(与混合通道12连通的另外一个进样口)进样0.2m的抗坏血酸，经混合通道12后，进入微孔滤膜反应区(过滤检测腔的上层区域)，反应2min，反应结束后用去离子水冲洗干净，制备得到在微孔滤膜上原位集成有纳米增强基底的sers检测单元，其电镜扫描图如图10所示。
65.2.基于本发明上述芯片的细菌检测方法
66.用恒流注射泵，从其中一个加样口5通入1～10ml样品，另外一个加样口5通入鞘液(为现有试剂，通过购买即可获得)，待样品进样结束后。以负压的方式(负压的大小根据实际情况进行选择即可)从所有加样口和进样口继续通入无菌pbs溶液，以将细菌冲到滤膜的末端，然后用便携式拉曼光谱仪检测细菌的sers信号。其中，样品选择活菌浓度分别为1
×
102cuf/ml的大肠杆菌、粪肠球菌、沙门氏菌添加到无菌饮料中，用拉曼光谱仪检测后的sers谱图见图11所示，电镜扫描图见图12所示，图中的条状物为细菌。
67.在本发明的描述中，需要理解的是，术语“纵向”、“横向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
68.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。