一种蛋白纯化镍柱重生方法及系统与流程

1.本发明属于镍柱再生领域，涉及镍柱重生方法和用于镍柱重生的系统。


背景技术：

2.ni-nta his-tag蛋白纯化镍柱是以高度交联的6％琼脂糖凝胶为基质，可实现高产量，高纯度的his标记蛋白的纯化。但多次蛋白纯化后，蛋白质在纯化镍柱上的不可逆吸附使柱效降低，柱压逐渐升高，交换容量降低，因此，需要对镍柱进行彻底清洗，以便其在以后的工作中能更好的发挥作用，即镍柱重生。
3.在实现本发明过程中，发明人发现现有技术中至少存在如下技术问题中的一个问题：
4.a、现有技术镍柱重生不彻底，影响蛋白纯化效果，并大大降低了镍柱使用寿命；
5.b、镍柱重生过程繁复，且步骤重复度高，时间较长，导致实验效率降低；
6.c、镍柱重生需要反复定量、定速清洗，每一个步骤均需要人工操作，人工镍柱重生过程无法达到精准重生。
7.现有技术中，出现了使用蛋白酶酶解蛋白质的方式对色谱柱进行再生，该方法虽然取得了较好的再生效果，但是，该方法再生时间长，再生效率较低，应用范围有限。


技术实现要素：

8.鉴于此，本发明目的在于提供一种ni-nta his-tag蛋白纯化镍柱的重生方法。
9.本发明的另一目的在于提供一种重生ni-nta his-tag蛋白纯化镍柱的设备系统。
10.发明人通过长期的探索和尝试，以及多次的实验和努力，不断的改革创新，为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种蛋白纯化镍柱重生方法，将重生液置于密闭管网，所述密闭管网内无气体，通过所述密闭管网顺次向待重生的镍柱均速注入预设量的去离子水、氯化钠溶液、去离子水、edta溶液、去离子水、氢氧化钠溶液、去离子水、nicl2溶液、去离子水，完成镍柱重生。
11.根据本发明蛋白纯化镍柱重生方法的一个事实方式，每种重生液单次注入预设量为5～10个ni柱体积。
12.根据本发明蛋白纯化镍柱重生方法的一个事实方式，重生液注入速度为2～3ml/min。
13.根据本发明蛋白纯化镍柱重生方法的一个事实方式，所述氢氧化钠溶液浓度为0.5m；所述氯化钠溶液浓度为0.5m；所述edta溶液浓度为50mm、nicl2溶液浓度为100mm。
14.本发明还提供了一种蛋白纯化镍柱重生系统，用于对蛋白纯化镍柱重生，包括密闭管网，所述密闭管网内无气体，所述密闭管网包括重生液端和镍柱端，重生液端连接重生液注入装置；所述镍柱端连接待重生的镍柱。
15.根据本发明蛋白纯化镍柱重生系统的一个实施方式，所述重生液注入装置包括去离子水注入装置、氯化钠溶液注入装置、edta溶液注入装置、氢氧化钠溶液注入装置和
nicl2溶液注入装置；所述密闭管网包括去离子水输入管、氯化钠溶液输入管、edta溶液输入管、氢氧化钠溶液输入管和nicl2溶液输入管；去离子水输入管连接去离子水注入装置，氯化钠溶液输入管连接氯化钠溶液注入装置，edta溶液输入管连接edta溶液注入装置，氢氧化钠溶液输入管连接氢氧化钠溶液注入装置，nicl2溶液输入管连接nicl2溶液注入装置；去离子水输入管、氯化钠溶液输入管、edta溶液输入管、氢氧化钠溶液输入管和nicl2溶液输入管通过六通管连接；六通管连接出液管，所述出液管连接镍柱。
16.根据本发明蛋白纯化镍柱重生系统的一个实施方式，所述六通管包括主管节，所述主管节上，沿重生液流向依次设置有去离子水输入管连接管、氯化钠溶液输入管连接管、edta溶液输入管连接管、氢氧化钠溶液输入管连接管、nicl2溶液输入管连接管和出液管连接管。
17.根据本发明蛋白纯化镍柱重生系统的一个实施方式，所述六通管的各输入管连接管上均安装有单向阀管，所述单向阀管包括管体，所述管体内设置有凸环和阀膜，所述凸环上设置有流道，所述阀膜中部设置有能够封闭或开启所述流道的膜片，所述阀膜上还设置有膜孔。
18.根据本发明蛋白纯化镍柱重生系统的一个实施方式，所述出液管上还连接有排气管；还包括管路选择器，所述管路选择器包括一壳体，所述壳体上设置有供出液管和排气管穿过的管孔，所述壳体内设置有内腔，所述内腔内滑动装配有闸板，所述闸板上设置有开口方向相反的供出液管通过第一u形孔和供排气管通过的第二u形孔，第一u形孔和第二u形孔的开口方向平行于闸板滑动方向；所述壳体上还设置有通孔，所述通孔垂直于所述管孔；所述闸板上设置有螺孔，所述螺孔的中心线与所述管孔的轴心线重合；所述管路选择器还包括驱动机构，所述驱动机构包括电机和螺杆，所述螺杆与所述电机的动力输出轴连接；所述螺杆穿过所述通孔，与所述螺孔配合。
19.根据本发明蛋白纯化镍柱重生系统的一个实施方式，还包括远程控制装置；所述去离子水注入装置、氯化钠溶液注入装置、edta溶液注入装置、氢氧化钠溶液注入装置和nicl2溶液注入装置均为带注射器的注射泵，所述去离子水、氢氧化钠溶液、氯化钠溶液、edta溶液和nicl2溶液分别储存于相应注射器中；所述注射泵包括中央控制器，所述中央控制器与所述远程控制装置信号连接。
20.与现有技术相比，上述技术方案中的一个技术方案具有如下优点：
21.a)相同条件下，使用后的镍柱通过本发明方法重生后，能够纯化更多的蛋白，蛋白纯化效果与新柱相当。本发明方法使旧柱脱镍彻底，稳定镍柱的电导和ph，紫外280、260均能够回归基线，通过挂镍使镍柱的性能得到完整恢复。
22.b)本发明蛋白纯化镍柱重生方法利用无气体的密闭管网进行重生，避免镍柱内出现气泡，保障柱效率。
23.c)使用本发明蛋白纯化镍柱重生系统对镍柱进行再生，可以精准控制各种重生液的注入量和注入速度，避免人工再生出现操作失误。
24.d)通过本发明再生方法和系统达到镍柱精准重生，即在对镍柱清洗过程中做到恒速、恒量，因此对镍柱损伤技校，重生更加彻底，大大提高了提高镍柱重生效率以及镍柱的使用寿命。
25.e)本发明再生系统结构简单，成本低廉，可基于现有成熟的医疗仪器，即智能注射
泵或智能注射泵系统，在密闭管网中，按序向镍柱注入各重生液即可完成镍柱的再生。
附图说明
26.为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
27.图1是本发明蛋白纯化镍柱重生系统一较佳实施例的结构示意图。
28.图2是本发明蛋白纯化镍柱重生系统一较佳实施例中五通阀剖视结构示意图。
29.图3是本发明蛋白纯化镍柱重生系统一较佳实施例中单向阀管前视结构示意图。
30.图4是图3中a-a剖视示意图。
31.图5是管路选择器剖视示意图。
32.图6是壳体立体结构示意图。
33.图7是滑板立体结构示意图。
34.图8是使用过的ni柱与重生后ni柱核酸u260值对比图。
35.图9是使用过的ni柱与重生后ni柱蛋白u280值对比图。
36.图中标记分别为：
37.100镍柱，
38.110第一注入装置，
39.111第一输入管，
40.120第二注入装置；
41.121第二输入管，
42.130第三注入装置，
43.131第三输入管，
44.140第四注入装置，
45.141第四输入管，
46.150第五注入装置，
47.151第五输入管，
48.161出液管，
49.162排气管，
50.200六通管，
51.201第一连接管，
52.202第二连接管，
53.203第三连接管，
54.204第四连接管，
55.205第五连接管，
56.206第六连接管，
57.300单向阀管，
58.310凸环，
59.311流道，
60.320阀膜，
61.321膜孔，
62.322膜片，
63.400远程控制装置，
64.500管路选择器，
65.510壳体，
66.511管孔，
67.512内腔，
68.513通孔，
69.520闸板，
70.521第一u形孔，
71.522第二u形孔，
72.523螺孔，
73.530电机，
74.531螺杆。
具体实施方式
75.下面结合附图与一个具体实施例进行说明。
76.为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。
77.应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中可以不对其进行进一步定义和解释。
78.实施例1
79.本实施例中所描述的蛋白纯化镍柱重生方法，所述镍柱为ni-nta his-tag蛋白纯化镍柱。将重生液置于密闭管网，所述密闭管网内无气体，保证重生过程中无气体进入镍柱内，通过所述密闭管网顺次向待重生的镍柱均速注入以下重生液：
80.(1)水洗：以稳定流速2.5ml/min、向镍柱注入5个柱体积的去离子水，
81.(2)以稳定流速2.5ml/min、向镍柱注入5个柱体积的0.5m氯化钠溶液，
82.(3)水洗：以稳定流速2.5ml/min、向镍柱注入5个柱体积的去离子水，
83.(4)脱镍：以稳定流速2.5ml/min、向镍柱注入5个柱体积的50mm edta溶液，
84.(5)水洗：以稳定流速2.5ml/min、向镍柱注入5个柱体积的去离子水，
85.(6)再生：以稳定流速2.5ml/min、向镍柱注入5个柱体积的0.5m氢氧化钠溶液，
86.(7)水洗：以稳定流速2.5ml/min、向镍柱注入5个柱体积的去离子水，
87.(8)挂镍：以稳定流速2.5ml/min、向镍柱注入5个柱体积的100mm nicl2溶液，
88.(9)水洗：以稳定流速2.5ml/min、向镍柱注入10个柱体积的去离子水，
89.完成镍柱重生。
90.本实施例中，重生液的流速可以通过微量泵进行稳定注入，也可以利用注射器、丝杠传动机构和电机实现重生液恒速注入。可通过流量计、计时器、或行程开关等现有技术手段进行重生液体积定量。可通过配置电磁开关实现远程控制。或通过实施例2所述系统来实现。
91.实施例2
92.本实施例所描述的蛋白纯化镍柱重生系统，用于对包括ni-nta his-tag蛋白纯化镍柱在内的蛋白纯化镍柱重生。当重生液如实施例1所示，则本系统用于执行实施例1所述蛋白纯化镍柱重生方法。
93.参加图1至图7。本实施例所述蛋白纯化镍柱重生系统包括密闭管网，所述密闭管网内无气体，所述密闭管网包括重生液端和镍柱端，重生液端连接重生液注入装置；所述镍柱端连接待重生的镍柱100。
94.所述重生液注入装置包括第一注入装置110、第二注入装置120、第三注入装置130、第四注入装置140和第五注入装置150；所述密闭管网包括第一输入管111、第二输入管121、第三输入管131、第四输入管141和第五输入管151。第一输入管111连接第一注入装置110，第二输入管121连接第二注入装置120，第三输入管131连接第三注入装置130，第四输入管141连接第四注入装置140，第五输入管151连接第五注入装置150；第一输入管111、第二输入管121、第三输入管131、第四输入管141和第五输入管151通过六通管200连接；六通管200连接出液管161，所述出液管161连接镍柱100。
95.所述六通管200包括主管节，所述主管节上，沿重生液流向依次设置有第一连接管201、第二连接管202、第三连接管203、第四连接管204、第五连接管205和第六连接管206。
96.所述六通管200的各输入管连接管上均安装有单向阀管300，重生液只能从注入装置向镍柱方向流动，不能从一注入装置流向另一注入装置。所述单向阀管300包括管体，所述管体内设置有凸环310和阀膜320，所述凸环310上设置有流道311，所述阀膜320中部设置有能够封闭或开启所述流道311的膜片322，所述阀膜320上还设置有膜孔321。本实施例中，膜片322平行于凸环310设置，单向阀关闭状态下，膜孔321通过凸环310封闭。膜片322两端的压差使膜片322贴合流道311，单向阀关闭；膜片322两端的压差使膜片322与流道311分离，单向阀开启，液体顺次通过流道311、膜孔321。为避免重生液对镍柱内的基质造成破坏性重新，重生系统管道内的压力较小，通过设置膜片322，可以在微压作用下实现单向阀的开启或关闭。
97.所述出液管161上还连接有排气管162；还包括管路选择器500，所述管路选择器500包括一壳体510，所述壳体510上设置有供出液管161和排气管162穿过的管孔511，所述壳体510内设置有内腔512，所述内腔512内滑动装配有闸板520，所述闸板520上设置有开口方向相反的供出液管161通过第一u形孔521和供排气管162通过的第二u形孔522，第一u形孔521和第二u形孔522的开口方向平行于闸板520滑动方向；所述壳体510上还设置有通孔513，所述通孔513垂直于所述管孔511；所述闸板520上设置有螺孔523，所述螺孔523的中心线与所述管孔511的轴心线重合；所述管路选择器500还包括驱动机构，所述驱动机构包括电机530和螺杆531，所述螺杆531与所述电机530的动力输出轴连接；所述螺杆531穿过所述
通孔513，与所述螺孔523配合。
98.还包括远程控制装置400；所述第一注入装置110、第二注入装置120、第三注入装置130、第四注入装置140和第五注入装置150均为带注射器的注射泵，所述去离子水、氢氧化钠溶液、氯化钠溶液、edta溶液和nicl2溶液分别储存于相应注射器中；所述注射泵包括中央控制器，所述中央控制器与所述远程控制装置400信号连接。
99.本实施例中，所述重生液为去离子水、氯化钠溶液、edta溶液、氢氧化钠溶液、nicl2溶液。第一注入装置110为去离子水注入装置，第二注入装置120为氯化钠溶液注入装置，第三注入装置130为edta溶液注入装置；第四注入装置140为氢氧化钠溶液注入装置，第五注入装置150为nicl2溶液注入装置。第一输入管111为去离子水输入管，第二输入管121为氯化钠溶液输入管，第三输入管131为edta溶液输入管，第四输入管141为氢氧化钠溶液输入管，第五输入管151为nicl2溶液输入管。第一连接管201为去离子水输入管连接管，第二连接管202为氯化钠溶液输入管连接管，第三连接管203为edta溶液输入管连接管，第四连接管204为氢氧化钠溶液输入管连接管，第五连接管205为nicl2溶液输入管连接管，第六连接管206为出液管连接管。
100.实施例3
101.为进一步说明本发明ni柱重生效果，以下通过具体实施方式进行说明。实验材料：使用过的ni柱(使用次数10次，每次时长约2h)一根，使用过的ni柱(使用次数5次，每次时长约2h)一根；蛋白样品：hpv16 mbp-e6蛋白，akta蛋白纯化仪，蛋白收集管。
102.1、ni柱重生
103.使用实施例1所述方法和实施例2所述系统对使用过10次的ni柱进行重生。
104.2、纯化蛋白及蛋白量计算
105.对比使用过的5次ni柱和重生后的ni柱，分别重复两次实验。
106.按照以下步骤进行蛋白纯化及蛋白量计算。
107.(1)将ni柱安装在akta纯化系统内。
108.(2)平衡缓冲液：ph8.0的50mm tris缓冲液含0.15m nacl，含20mm咪唑。
109.洗脱缓冲液：
110.①
ph8.0的50mm tris缓冲液含0.15m nacl，含50mm咪唑。
111.②
ph8.0的50mm tris缓冲液含0.15m nacl，含100mm咪唑。
112.③
ph8.0的50mm tris缓冲液含0.15m nacl，含300mm咪唑。
113.(3)样品蛋白过柱，流出ft，取样ft。
114.(4)用20倍柱体积平衡缓冲液洗去未吸附的蛋白样品，流速1-2ml/min，直到流出液的uv260与uv280的值都降至最低时，开始使用洗脱缓冲液洗脱柱子上吸附的蛋白。
115.(5)用50mm,100mm,300mm咪唑浓度分阶段洗脱柱子，洗脱5-10个柱体积左右，蛋白吸附较多，则洗脱液用量则较大，流速1-2ml/min，4ml/管收集。
116.(6)仪器自带软件检测uv260与uv280的值，导出后做统计分析。对比结果参加图8和图9。
117.图8(a)为使用过5次的ni柱核酸uv260值，图8(b)为重生后的ni柱核酸uv260值，图8(c)为两种ni柱核酸uv260值差异分析，未重生的ni柱uv260pre＝290.9
±
42.04；重生后的ni柱uv260post＝459.5
±
45.03。uv260pre峰值为672.089，uv260post峰值为928.677。图9
(a)为使用过5次的ni柱蛋白uv280值，图8(b)为重生后的ni柱蛋白uv280值，图8(c)为两种ni柱蛋白uv280值差异分析，未重生的ni柱uv280pre＝491.6
±
51.64；重生后的ni柱uv280post＝710.8
±
67.44。uv280pre峰值为969.754，uv280post峰值为1478.88。
118.试验证明，重生后的ni柱对蛋白纯化效果显著提升，纯化效果与新柱相同，还原度达到100％。
119.在本发明的描述中，在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
120.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。