谷胱甘肽修饰的硫化亚铁纳米粒子的制备方法及其在葡萄糖检测中的应用

1.本发明属于生物分子检测技术领域，具体涉及一种谷胱甘肽修饰的硫化亚铁纳米粒子的制备方法及其在葡萄糖检测中的应用。


背景技术：

2.葡萄糖，化学式为c
12h12
o6，是人体中重要的能源物质，也是常用的化工原料和食品添加剂。天然葡萄糖均属于d构型，为右旋糖。葡萄糖的分布极其广泛，植物的各个组织，动物的血液以及天然蜂蜜中均含有葡萄糖。葡萄糖的用途也十分广泛，在食品中可作为食品添加剂；在医药中，可作为葡萄糖注射液或者作为制备多种维生素的基质；在工业生产中，常常以葡萄糖作为还原剂，例如，热水瓶胆镀银中使用葡萄糖作为还原剂。人体每天都需要摄入一定量的葡萄糖，它通过氧化反应释放热量，维持正常的生命活动。但摄入葡萄糖的含量与生命健康息息相关，摄入过量的葡萄糖会诱发糖尿病、心脏病、高血糖等疾病。因此，葡萄糖的定量检测在食品健康、临床医疗以及工业生产中都有着重要的意义。
3.目前检测葡萄糖的方法主要有比色法、电化学法、高效液相色谱法等，其中：高效液相色谱法样品预处理程序繁琐、仪器昂贵，成本高；电化学法是近年来应用最多的葡萄糖检测技术，具有操作简便、线性范围宽及灵敏度高的特点，但电化学法对检测物的选择性较差，需要特殊的电极和电化学仪器辅助检测，大多数电化学传感器的储存期较短，成本相对较高。
4.与电化学法相较，比色法具有成本低、显色时间短、现象明显、条件稳定、方便快捷，不需要特殊的电极和电化学仪器等突出优势，在分析检测领域中占据着越来越重要的地位。比色化学传感器是运用紫外-可见分光光度计或者光电比色计，以朗伯比尔定律为理论基础，确定样品中待测物质含量的一种简便的分析方法。比色化学传感器大致分为两类：一类是目视比色化学传感器，也就是人们使用眼睛观察，找到与样品溶液颜色相近的标准溶液，从而方便快捷地确定样品中待测物质的含量范围，但是由于人眼的分辨率不高，容易受到不同环境的影响，因此此种方法的准确度相对较低。另一种是分光光度法，利用物质在特定波长处吸光度的大小，根据朗伯比尔定律确定待测物质的含量大小，此种方法相对于目视比色法有较高的准确度。
5.葡萄糖氧化酶法(gox法)测定葡萄糖特异性强，检测时间短，环境友好，样品用量少，是比色法测定葡萄糖比较常用的方法。


技术实现要素：

6.为了克服上述现有背景技术的不足之处，本发明目的之一在于提供一种谷胱甘肽修饰的硫化亚铁纳米粒子的制备方法及其在葡萄糖检测中的应用。本发明通过谷胱甘肽修饰的硫化亚铁纳米粒子基于过氧化物酶性质，实现了对葡萄糖和灵敏性和选择性检测。
7.为实现上述目的，本发明通过下述技术方案实现：
8.一方面，本发明提供一种谷胱甘肽修饰的硫化亚铁纳米粒子的制备方法，包括：
9.s1、以去离子水为溶剂，将谷胱甘肽和无水氯化亚铁混合后，调整反应体系的ph，常温搅拌反应；
10.s2、向上述反应体系中滴加硫化钠水溶液，常温搅拌反应；
11.s3、将步骤s2中的产物经超滤、洗涤、冷冻干燥后，即可得到本发明谷胱甘肽修饰的硫化亚铁纳米粒子。
12.优选的，所述硫化亚铁纳米粒子的粒径为2.2-3.2nm。
13.优选的，所述谷胱甘肽、氯化亚铁和硫化钠的投料摩尔比为(2-4)：1：(4-8)。
14.进一步优选的，所述谷胱甘肽、氯化亚铁和硫化钠的投料摩尔比为4：1：8。
15.优选的，所述步骤s1中，调整反应体系的ph为8-10，在碱性条件下，谷胱甘肽中的巯基去质子化，与亚铁粒子配位形成络合物。
16.优选的，所述步骤s3中，产物采用截留分子量为30k的超滤管以5000-6000r/min转速离心5min，然后采用调整到同ph值的超纯水进行多次超滤洗涤。所得的硫化亚铁纳米粒子粒径为2.2-3.2nm，因其超小的粒径，而具有较大的比表面积和接触位点，提高了其催化性能。
17.另一方面，本发明还提供一种硫化亚铁纳米粒子的应用，所述硫化亚铁纳米粒子应用于葡萄糖的检测。
18.优选的，葡萄糖的检测方法包括：
19.(1)建立以葡萄糖浓度为横轴、紫外吸光度为纵轴的标准曲线；
20.(2)以3,3',5,5'-四甲基联苯胺作为染色剂、硫化亚铁纳米粒子作为催化剂，先通过葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖生成过氧化氢，再通过催化剂催化过氧化氢发生还原反应，产生羟基自由基将无色的3,3',5,5'-四甲基联苯胺氧化成显蓝色的3,3',5,5'-氧化态四甲基联苯胺；
21.(3)测定产物在652nm处的紫外吸光度，根据标准曲线确定葡萄糖的含量。
22.进一步优选的，建立标准曲线的方法为：
23.配置梯度浓度的葡萄糖标准溶液，向各葡萄糖标准溶液中加入葡萄糖氧化酶，室温下孵育30min；
24.向上述各反应体系中，依次添加醋酸盐缓冲液，硫化亚铁纳米粒子溶液和3,3',5,5'-四甲基联苯胺，混合均匀，室温孵育5min，测定各反应体系中的紫外吸收光谱，完成基于葡萄糖浓度和紫外吸光度的标准曲线的建立。
25.与现有技术相比，本发明取得的有益效果有：
26.本发明的制备方法，以对谷胱甘肽和无水氯化亚铁为起始原料，以去离子水作为反应媒介，避免了有机溶剂的使用，杜绝了污染环境的风险。
27.本发明的制备方法，在室温条件下即可完成反应，反应条件温和，且成本低。
28.本发明的制备方法，能够快速的制备出粒径分布均匀的硫化亚铁纳米粒子，工艺简单。
29.通过本发明方法制备的硫化亚铁纳米粒子(gsh-fes nps)能够用于检测葡萄糖的含量，检测速度快，准确度高。
附图说明
30.图1为本发明硫化亚铁纳米粒子(gsh-fes nps)的透射电子显微镜图。
31.图2为本发明gsh-fes nps的粒径分布统计图。
32.图3为本发明gsh-fes nps的eds图。
33.图4为本发明gsh-fes nps的紫外-可见光谱图。
34.图5为本发明gsh-fes nps的红外光谱图。
35.图6为h2o2+tmb、tmb+fes nps、h2o2+tmb+gsh-fes nps在500-800nm的紫外-可见光谱图。
36.图7为不同浓度的gsh-fes nps在500-800nm的紫外-可见光谱图。
37.图8为本发明gsh-fes nps在不同温度下的催化效率图。
38.图9为本发明gsh-fes nps在不同ph下的催化效率图。
39.图10为本发明gsh-fes nps在不同浓度的h2o2的反应速率图一。
40.图11为本发明gsh-fes nps在不同浓度的h2o2的反应速率图二。
41.图12为建立的标准曲线图。
42.图13为采用gsh-fes nps对葡萄糖的选择性检测结果图。
具体实施方式
43.为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明的优选实施方案进行描述，但是不能理解为对本发明的限制，仅作举例而已。
44.下述实施例中所述试验方法或测试方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均从常规商业途径获得，或以常规方法制备。
45.实施例1
46.本实施例提供一种谷胱甘肽修饰的硫化亚铁纳米粒子的制备方法，包括：
47.s1、将配体谷胱甘肽和无水氯化亚铁溶于去离子水中，投入反应烧瓶中，加入新配置的氢氧化钠溶液调整反应体系的ph＝8，常温搅拌0.5h；
48.s2、向上述反应体系中缓慢滴加硫化钠水溶液，常温搅拌2h，谷胱甘肽、氯化亚铁、硫化钠的物质的量比例为2：1：4；
49.s3、反应结束后将步骤s2的产物用截留分子量为30k的超滤管以5000r/min转速离心5min，稍后用调整到同ph的超纯水进行三次超滤洗涤；
50.s4、将提纯后的产物进行冷冻干燥48h，得到黑色的gsh-fes nps粉末。
51.tem表征得cu2s量子点粒径为2.2nm左右。
52.实施例2
53.本实施例提供一种谷胱甘肽修饰的硫化亚铁纳米粒子的制备方法，包括：
54.s1、将配体谷胱甘肽和无水氯化亚铁溶于去离子水中，投入反应烧瓶中，加入新配置的氢氧化钠溶液调整反应体系的ph＝9，常温搅拌0.5h；
55.s2、向上述反应体系中缓慢滴加硫化钠水溶液，常温搅拌2h，谷胱甘肽、氯化亚铁、硫化钠的物质的量比例为4：1：8；
56.s3、反应结束后将步骤s2的产物用截留分子量为30k的超滤管以55000r/min转速离心5min，稍后用调整到同ph的超纯水进行三次超滤洗涤；
nps+过氧化氢作为对照组，分别测定其在500-800nm的吸收光谱，结果见图6。从图中可以看出，过氧化氢在gsh-fes nps的催化下可以使得tmb变蓝，并在652nm处有个明显的紫外吸收峰。
79.2.不同浓度的gsh-fes nps的过氧化物酶活性测试
80.首先将1mg的gsh-fes nps溶于1ml的去离子水中，得到1mg/ml的gsh-fes nps溶液，然后将其配制成500pm，250ppm，100ppm，50ppm，25ppm，5ppm，的gsh-fes nps溶液。分别取40微升加入到含有120微升的hac-naac缓冲溶液，20微升的(10mm)tmb溶液，20微升的(10mm)过氧化氢溶液，反应5min后，用紫外-可见分光光度计测试其在500-800nm范围内的吸收光谱。用去离子水做空白对照，结果见图7。从图中可以发现，随着gsh-fes nps的浓度增加，oxtmb在652nm处的吸收峰越强。
81.3.不同温度和ph下的过氧化物酶活性测试
82.首先将1mg的gsh-fes nps溶于1ml的去离子水中，得到1mg/ml的gsh-fes nps溶液，然后取40微升加入到含有120微升的hac-naac缓冲溶液，20微升的(10mm)tmb溶液，20微升的(10mm)过氧化氢溶液，分别在不同的温度和ph条件下反应5min后，用紫外-可见分光光度计测试其在652nm处的吸光度值，结果见图8和图9。从图中可以看出，fes nps的过氧化物酶活性的最适温度和最适ph分别为40℃和4。
83.4.米氏常数的测试
84.首先将1mg的gsh-fes nps溶于1ml的去离子水中，得到1mg/ml的gsh-fes nps溶液，然后配制不同浓度的过氧化氢溶液，以备后续使用。取40微升加入到含有120微升的hac-naac缓冲溶液，20微升的(10mm)tmb溶液，20微升的(10mm)过氧化氢溶液，反应5min后，用紫外-可见分光光度计测试其在652nm处地吸光度值，计算出其反应速率，结果见图10和图11。从图中可以看出，gsh-fes nps的米氏常数和hrp相比小了一个数量级，和底物的亲和力更高。
85.三、gsh-fes nps检测葡萄糖
86.该部分的gsh-fes nps检测葡萄糖实验包括gsh-fes nps对不同浓度的葡萄糖检测和gsh-fes nps葡萄糖的选择性检测。
87.1.建立标准曲线：首先配制不同浓度的葡萄糖溶液，然后分别取20微升葡萄糖溶液，加入10微升的葡萄糖氧化酶溶液(1mg/ml)，在37℃下孵育30min，然后向其中加入含有120微升的hac-naac缓冲溶液，20微升的(10mm)tmb溶液，20微升的(1mg/ml)gsh-fes nps溶液，在37℃下反应5min，用紫外-可见分光光度计测试各反应体系在652nm处地吸光度值，完成基于葡萄糖浓度和紫外吸光度的标准曲线的建立，结果见图12。通过测定待测样品的吸光度值，即可确定葡萄糖的含量。
88.2.gsh-fes nps葡萄糖的选择性检测。
89.首先配制一定浓度的麦芽糖，果糖，半乳糖，谷氨酸，尿素，抗坏血酸溶液，然后分别取20微升，加入10微升的葡萄糖氧化酶溶液(1mg/ml)，在37℃下孵育30min，然后向其中加入含有120微升的hac-naac缓冲溶液，20微升的(10mm)tmb溶液，20微升的(1mg/ml)gsh-fes nps溶液，在37℃下反应5min，用紫外-可见分光光度计测试其在652nm处地吸光度值，用葡萄糖做对照组，结果见图13。从图中可以看出，在干扰物存在的条件下，对葡萄糖的检测影响不大。
90.以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。