一种选择性去除白细胞同时保留血小板的滤材及其制备方法

1.本发明属于血液产品白细胞过滤技术领域，具体涉及一种选择性去除白细胞同时保留血小板的滤材及其制备方法。


背景技术：

2.输血在临床医学中是一种常见的医疗手段，最主要的目的是帮助一些有疾病的患者，手术中出血或者意外受伤大量出血的伤者恢复健康。而血液产品中白细胞的存在会引起许多相关的输血副反应(如非溶血性发热反应、承认呼吸窘迫正、血小板输注无效等)；其次血液中的白细胞还是病毒传播主要媒介物。因此，输血前去除血液产品中的白细胞是非常重要的。
3.白细胞过滤器的发展距今已有半个世纪左右，其制备方法和材料选择也随着科技的进步和发展而不断地革新。第三代白细胞过滤器出现于上世纪90年代，该类过滤器主要是通过在树脂类支撑网中间放置无纺布类材料制备而成。通常先对无纺布材料进行处理以增进其与血液之间的润湿性。由于第三代白细胞过滤器具有制备工艺简单且去白效率高等优势，目前国内外无论血液中心还是医院临床上大都采用这种过滤方法滤除血液中的白细胞，但不同公司和厂家生产的过滤器在滤芯材料的选择和使用上各有不同。
4.虽然，输血用的血液产品需要过滤去除白细胞，但是人们并不希望血液中的红细胞和血小板等其他细胞被滤除。然而，血小板的生理功能为：血管破裂时，血液流体力学发生改变，血小板可快速粘附在血管破裂处，迅速激活并释放其胞内的物质，快速激活凝血系统，形成凝块减少血液的损失。因此，血小板具有易粘附的特性，这导致在过滤白细胞时，血小板也非常容易黏附在滤材上而被除去。
5.因此，开发能够选择性地滤除白细胞而不会滤除血小板的滤材是本领域的重要课题。usp5895575中根据血液中血小板和白细胞的不同性质用水溶性多糖涂层聚醋无纺布和硝基纤维素薄膜得到的滤材可去除白细胞而保留血小板。usp4936998中介绍根据白细胞和血小板的表面电荷密度不同，用hema(甲基丙烯酸羟乙酯)和dhema共聚物涂层处理聚醋非织造布，使得白细胞吸附在滤材上而血小板通过。ep0559086中介绍了一种白细胞过滤器，制备糖苷甲基丙烯酸羟乙酯，在聚酯纤维表面通过自由基聚合交联糖苷甲基丙烯酸羟乙酯，二氧己烷和hema(引发剂偶氮二异丁氰，70℃4小时)，该过滤器根据血液中的血小板和白细胞的不同吸附性能对聚醋纤维进行涂层或共聚改性，对于血小板浓缩液(platelet concentrates，pc)具有很好的白细胞的去除率和血小板回收率。
6.虽然，这些滤材在对浓缩血小板的过滤中取得了很好的效果，能够同时兼有较高的白细胞去除率和血小板回收率。但是这些滤材只能适用于浓缩血小板样品，对于全血样品，由于其中血小板含量相对较低，因而仍然会有较高比例的血小板被滤材滤除，进而导致血小板的回收率无法达到国家相关标准要求。因此，目前血液中心通常将2u(400ml)全血分别制备成红细胞悬液，血浆和浓缩血小板三种成分血，然后分别去除白细胞。而且，2u全血制备的浓缩血小板仍然不能直接过滤，须汇集成一个治疗剂量(12u或者6袋400ml全血制备
的pc)后，才能过滤去除白细胞。只有此时，血小板回收率才能够大于85％，符合国家相关标准要求。
7.上述血液样品的处理过程中，受限于血小板回收率的问题，导致处理步骤复杂，使用滤材较多(需对三种成分血分别进行白细胞滤除)。因此，本领域亟需一种针对全血样品的白细胞滤材，能够在对全血样品的过滤中尽可能地滤除白细胞，并保留血小板。
8.四臂聚乙二醇及其衍生物是一类由四个聚乙二醇及其衍生物的分子链接枝在同一个季碳上形成的聚合物。现有技术中，这类化合物可通过交联等方式形成凝胶、胶束等，可用于载药(刘东红等，四臂聚乙二醇-聚丙交酯立体复合胶束及其药物传输性能)等用途。而目前，四臂聚乙二醇及其衍生物用于制备血液样品滤材的技术尚未见到有相关报道。


技术实现要素：

9.针对现有技术的问题，本发明提供一种选择性去除白细胞同时保留血小板的滤材及其制备方法，目的在于实现对全血的白细胞过滤。
10.一种选择性去除白细胞同时保留血小板的滤材，它是将如下重量份的原料交联在无纺布上得到的：四臂聚乙二醇胺化合物4-10份、交联剂1-4份；
11.其中，所述四臂聚乙二醇胺化合物是式ⅰ所示的化合物或其盐：
[0012][0013]
其中，n1、n2、n3和n4分别独立取自25-75。
[0014]
优选的，所述四臂聚乙二醇胺化合物的数均分子量为5000-20000。
[0015]
优选的，所述四臂聚乙二醇胺化合物的数均分子量为9000-11000。
[0016]
优选的，所述交联剂选自二醛类化合物。
[0017]
优选的，所述二醛类化合物选自戊二醛、丁二醛、己二醛中的一种或两种及以上的组合。
[0018]
优选的，所述无纺布为pbt无纺布、pet无纺布或pp无纺布。
[0019]
优选的，包括如下步骤：
[0020]
步骤1，将所述四臂聚乙二醇胺化合物配制成溶液a，交联剂配制成溶液b；
[0021]
步骤2，将所述无纺布加入所述溶液a；
[0022]
步骤3，将所述溶液b加入溶液a，进行交联，即得。
[0023]
优选的，步骤3中，所述交联的反应条件为25-80℃下反应2-12小时。
[0024]
本发明还提供上述滤材用于过滤全血中白细胞的用途。
[0025]
本发明中，“％wt”是指重量百分数，“％v”是指体积百分数。
[0026]
本发明通过将四臂聚乙二醇胺化合物与交联剂交联在无纺布表面，形成水凝胶涂层。按照这种方法制备的材料对白细胞具有很好的过滤效果，同时对血小板的过滤效果较弱。特别地，现有技术中，白细胞滤材只有用于对血小板浓度较高的浓缩血小板进行过滤时，才能够达到较好的血小板回收率。而本发明的滤材可直接用于对全血产品的过滤，血小板回收率可达到80％以上，制成的血液产品质量符合《全血及成分血质量要求》(gb18469-2012)。因此，本发明能够简化血液产品的加工步骤，降低加工成本，具有很好的应用前景。
[0027]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0028]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
[0029]
图1为滤材的扫描电镜图片，其中，a：原始pbt无纺布；b：实施例1制备的滤材；c：实施例2制备的滤材；d：实施例3制备的滤材；e：实施例4制备的滤材。
具体实施方式
[0030]
以下实施例和实验例中，未特别说明的试剂和材料均为市售品。以下实施例中，四臂聚乙二醇胺化合物用缩写“4armpeg”表示。四臂聚乙二醇胺化合物的结构式为：
[0031][0032]
其中，n1、n2、n3和n4分别独立取自25-75。
[0033]
实施例1选择性去除白细胞同时保留血小板的滤材
[0034]
使用电子天平准确称量1.000g 4armpeg(键凯科技，4arm-peg-nh2hcl，数均分子量2000da)，溶解在50ml水溶液中，得到2％wt的4armpeg溶液。20g pbt无纺布浸入上述100ml溶液中，加入0.5ml 50％v的戊二醛溶液(含戊二醛0.25g)，放入60℃干燥箱中交联3小时，反应结束后，使用蒸馏水清洗pbt无纺布，得到戊二醛交联4armpeg的pbt无纺布膜备用。
[0035]
实施例2选择性去除白细胞同时保留血小板的滤材
[0036]
使用电子天平准确称量1.000g 4armpeg(键凯科技，4arm-peg-nh2hcl，数均分子量5000da)，溶解在50ml水溶液中，得到2％wt的4armpeg溶液。20g pbt无纺布浸入上述
100ml溶液中，加入0.5ml 50％v的戊二醛溶液(含戊二醛0.25g)，放入60℃干燥箱中交联3小时，反应结束后，使用蒸馏水清洗pbt无纺布，得到戊二醛交联4armpeg的pbt无纺布膜备用。
[0037]
实施例3选择性去除白细胞同时保留血小板的滤材
[0038]
使用电子天平准确称量1.000g 4armpeg(键凯科技，4arm-peg-nh2hcl，数均分子量10000da)，溶解在50ml水溶液中，得到2％wt的4armpeg溶液。20g pbt无纺布浸入上述100ml溶液中，加入0.5ml 50％v的戊二醛溶液(含戊二醛0.25g)，放入60℃干燥箱中交联3小时，反应结束后，使用蒸馏水清洗pbt无纺布，得到戊二醛交联4armpeg的pbt无纺布膜备用。
[0039]
实施例4选择性去除白细胞同时保留血小板的滤材
[0040]
使用电子天平准确称量1.000g 4armpeg(键凯科技，4arm-peg-nh2hcl，数均分子量20000da)，溶解在50ml水溶液中，得到2％wt的4armpeg溶液。20g pbt无纺布浸入上述100ml溶液中，加入0.5ml 50％v的戊二醛溶液(含戊二醛0.25g)，放入60℃干燥箱中交联3小时，反应结束后，使用蒸馏水清洗pbt无纺布，得到戊二醛交联4armpeg的pbt无纺布膜备用。
[0041]
实施例5选择性去除白细胞同时保留血小板的滤材
[0042]
使用电子天平准确称量1.000g 4armpeg(键凯科技，4arm-peg-nh2hcl，数均分子量10000da)，溶解在50ml水溶液中，得到2％wt的4armpeg溶液。20g pbt无纺布浸入上述100ml溶液中，加入2ml 50％v的戊二醛溶液(含戊二醛1.000g)，放入60℃干燥箱中交联3小时，反应结束后，使用蒸馏水清洗pbt无纺布，得到戊二醛交联4armpeg的pbt无纺布膜备用。
[0043]
实施例6选择性去除白细胞同时保留血小板的滤材
[0044]
使用电子天平准确称量2.500g 4armpeg(键凯科技，4arm-peg-nh2hcl，数均分子量10000da)，溶解在50ml水溶液中，得到2％wt的4armpeg溶液。20g pbt无纺布浸入上述100ml溶液中，加入2ml 50％v的戊二醛溶液(含戊二醛1.000g)，放入60℃干燥箱中交联3小时，反应结束后，使用蒸馏水清洗pbt无纺布，得到戊二醛交联4armpeg的pbt无纺布膜备用。
[0045]
下面通过实验对本发明的技术方案作进一步的说明。
[0046]
实验例1滤材性能表征实验
[0047]
一、实验方法
[0048]
1)表面张力测定：
[0049]
对原始pbt无纺布和实施例1-4制备的滤材进行表面张力测定，对材料亲水性进行表征。分别配制不同浓度的氯化钠(1％-4.5％)及氯化钙(3％-5％)溶液，用液体自动表面张力仪检测溶液的表面张力。用注射器将不同浓度的液体滴在试样表面，以10min内液滴完全铺展的数目来进行衡量。静置10min，在第10min至11min内进行观察。如10min内10滴中至少有9滴浸湿多孔介质，则认为该种表面张力的液体浸湿了介质材料；反之，如10min内10滴中有2滴或更多的液滴未浸湿或不被吸收，则认为该种表面张力的液体不能浸湿该介质。例如，用纯水(其表面张力为72
×
10-5
n/cm)的液滴10滴滴在材料表面上，10min内有9滴浸湿了；而用表面张力75
×
10-5
n/cm的液滴10滴滴在材料表面上，10min内有3滴未浸湿，则该材料的临界表面张力按定义为73.5
×
10-5
n/cm。
[0050]
2)扫描电镜观察滤材表面形貌
[0051]
将原始pbt无纺布和实施例1至实施例4制备的滤材喷金后采用扫描电镜观察滤材的表面形貌。
[0052]
二、实验结果
[0053]
1、亲水性表征结果：在室温下，纯水的表面张力通常为72
×
10-5
n/cm，原始pbt无纺布的表面张力为48
×
10-5
n/cm。戊二醛交联4armpeg后形成的水凝胶涂层覆盖在到pbt无纺布的纤维表面，有助于提高材料的亲水性。由表1中的结果可知，pbt滤材经4arm peg改性后，表面张力较原始pbt显著提高，且随着4arm peg的分子量的增加，滤材表面张力增加，材料表面亲水性增加。这有助于提高血液过滤速度。
[0054]
表1原始pbt及改性滤材的表面张力结果
[0055][0056]
2、表面形貌表征结果：由图1看出，与原始pbt无纺布相比，4arm peg改性后的滤材纤维直径增粗，纤维表面有颗粒状附着物，纤维与纤维之间孔隙变窄。说明4arm peg交联后形成的水凝胶成功覆盖在到pbt无纺布的纤维表面。
[0057]
实验例2全血过滤实验
[0058]
一、实验方法
[0059]
将实施例1至实施例4制备的4种滤材分别装入直径为60mm白细胞过滤器的壳后，通过超声焊接过滤器，并连接pvc管路和血袋。每个血袋中装入200ml全血，在一米净压差下血液流过白细胞过滤器，流出的血液通过血袋收集。试验所用全血由德阳中心血站提供。
[0060]
各项参数的检测方法如下：
[0061]
1)血小板回收率计算方法
[0062]
血小板回收率(％)＝(过滤后血小板浓度
×
过滤后体积)/(过滤前血小板浓度
×
过滤前体积)
×
100
[0063]
通过五分类血细胞计数仪测定血小板过滤前后浓度，通过称重方式获取体积。
[0064]
2)白细胞去除率计算方法
[0065]
白细胞回收率(％)＝(过滤前白细胞浓度
×
过滤前体积-过滤后剩余白细胞浓度
×
过滤后体积)/(过滤前白细胞浓度
×
过滤前体积)
×
100
[0066]
通过五分类血细胞计数仪测定过滤前白细胞浓度，通过细胞计数板获取过滤后剩余白细胞浓度，通过称重方式获取体积。
[0067]
3)红细胞回收率计算方法
[0068]
红细胞回收率(％)＝(过滤后红细胞浓度
×
过滤后体积)/(过滤前红细胞浓度
×
过滤前体积)
×
100
[0069]
通过五分类血细胞计数仪测定红细胞过滤前后浓度，通过称重方式获取体积。
[0070]
4)溶血率计算方法
[0071]
本实验按照国家医药标准《一次性使用去白细胞滤器》yy-0329-2020中溶血率的测定方法实验。通过用体积分数为的0.9％的氯化钠注射液作为浸提介质制备去白细胞滤器器材或过滤材料的检验液与血液直接接触,测定红细胞释放的血红蛋白量以检测去白细胞滤器或过滤材料体外溶血程度。
[0072]
5)过滤时间
[0073]
过滤完200ml全血需要的时间。
[0074]
6)血液损失率计算方法
[0075]
血液损失率(％)＝(过滤前血液重量-过滤后血液重量)/(过滤前血液重量)
×
100
[0076]
通过称重方式获取血液重量。
[0077]
二、实验结果
[0078]
全血过滤结果：
[0079]
检测过滤前后的血液相关指标，结果见表2。
[0080]
表2
[0081][0082]
从表中各项性能来看，随着4arm peg分子量的升高，血小板回收率、白细胞去除率、红细胞回收率和血液损失率均表现为先升高后降低；溶血率和过滤时间表现为先降低后升高。即整体来看，滤材的过滤性能随着4arm peg分子量的升高呈现先增强后减弱的趋势。其中当4arm peg分子量为10000da时，制成的滤材具有最佳的过滤性能。过滤后的全血质量符合《全血及成分血质量要求》(gb18469-2012)。
[0083]
通过上述实施例和实验例可以看到，本发明提供了一种新的白细胞过滤滤材，采用该滤材可直接对全血进行过滤，血小板回收率可达到80％以上，制成的血液产品质量符合《全血及成分血质量要求》(gb18469-2012)。本发明可简化血液产品的加工流程、降低加工成本，具有很好的应用前景。