一种用于外泌体分离的尺寸排阻层析分离柱的制备方法与流程

1.本发明涉及用于分离外泌体的尺寸排阻层析分离柱的制备方法。
技术背景
2.外泌体(exosome)是由细胞内囊泡结构释放到细胞外的一种膜性囊泡，直径约40-160nm(平均直径为100nm)。由于质膜和多囊泡体之间融合的结果，外泌体样囊泡通过胞吐作用被分泌到胞外空间。外泌体样囊泡被脂质双层分为内部和外部，可以包含细胞的许多成分，包括dna、rna、脂质、代谢物、细胞质和细胞表面蛋白。外泌体的主要功能是进行细胞间信息交流，一般是通过传递膜表面或腔内的生物分子来进行细胞间信号传递，从而调节细胞的正常生理功能。此外，外泌体中含有多种疾病的生物标志物，利用外周血中大量存在的外泌体有望实现癌症、病毒感染等疾病的早期诊断，是目前学界的研究热点。
3.目前针对外泌体的分离方法有超速离心、密度梯度离心，超滤，尺寸排阻层析，多聚物沉淀法以及亲和捕捉法等。尺寸排阻层析(size exclusion chromatography ,sec)利用球状凝胶内的筛孔，使不同大小的分子在通过不同的路径流经填料，从而在不同时间段被洗脱：大分子无法进入凝胶筛孔，运行较短路径，较早被洗脱；较小的分子可进入凝胶内的筛孔，运行较长路径，洗脱时间较长。这种分离方法可有效分离外泌体与血清中存在的高丰度蛋白质，并且减少对复杂仪器设备的依赖性。


技术实现要素：

4.本发明目的在于提供一种用于外泌体分离的尺寸排阻层析分离柱的制备方法。该分离柱可以用于细胞培养液上清、血浆、尿液等液体样本中外泌体的分离。本发明方法可减少了外泌体分离过程的耗时，减少分离过程中高丰度蛋白质和其他杂质的污染，并且不需要复杂的仪器设备，如超高速离心机，大大降低了成本。
5.本发明目的通过以下方案实现：一种用于外泌体分离的尺寸排阻层析分离柱的制备方法，包括以下步骤：s1. 材料准备：准备包括分离柱，上顶盖，下口塞，筛板，烧杯，移液器，一次性滴管、装填柱，专用管架，装填用凝胶，无水乙醇，去离子水等所需用具；并配置75%乙醇溶液，用于灭菌，20%乙醇溶液，用作缓冲液；s2. 材料清洗：清洗分离柱、装填柱、上顶盖和下口塞；将之置于干净的大烧杯中用75%乙醇溶液浸泡10min消毒，然后在20%乙醇溶液中浸泡，超声20min，浸泡10min，37
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烘干备用；注意套袋避免灰尘；清洗筛板：75%乙醇溶液浸泡10min消毒，20%乙醇溶液浸泡，脉冲式超声3次，每次20min，间隔10min，目的是排空气泡。20%乙醇溶液浸泡过夜，使用前再次超声20min；注意套袋避免灰尘；
s3. 凝胶装填：（1）20%乙醇溶液浸润分离柱、上顶盖和下口塞；（2）装下筛板：用20%乙醇溶液冲洗柱子内壁，然后装下筛板；用装填柱将下筛板缓慢推进至底部，注意避免划破柱子内壁；待下筛板固定好之后，盖上下口塞，缓慢拿出装填柱；注意一定要缓慢，防止气泡的产生；加满20%乙醇溶液，取下下口塞，让乙醇自然流出，这是为了排尽装下筛板过程中产生的气泡；随后关闭下出口，柱内留少许（0.5cm）乙醇；（3）装填凝胶（8-10cm）：制备前2h平衡至室温，装填速度0.5ml/min，可用玻璃棒引流，或者使用滴管沿着柱体内壁缓慢滴，避免产生气泡；顶部加满乙醇，装填完成后，自然沉降到稳定状态，至少3h；期间可以调整装填凝胶的含量，改变后需再次稳定；（4）打开下出口，柱内的乙醇溶液自然流出排尽，凝胶再次稳定后，关闭下出口；（5）缓慢添加20%乙醇溶液填满上部空间，打开下出口；注意一定要慢，不能打破凝胶的稳定状态，到缓冲液（20%乙醇溶液）能够稳定流出，即系统稳定状态，然后关闭下出口；（6）用同样的方式，装上筛板，缓慢推进；（7）打开下出口，自然沉降，稍稍下压筛板2-3mm；（8）关闭下出口，自然沉降，若上部还有空间，再加20%乙醇溶液，预留0.5cm空间，不要加满，顶盖封口；（9）做好标记，4℃冰箱保存。
6.步骤s1所述尺寸排阻层析采用的凝胶填料为sepharose cl-2b，其性状为：颗粒直径60～200μm，对球形蛋白质的分离范围为70,000-40
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7.步骤s1所述尺寸排阻层析采用的凝胶填料为sepharose cl-4b，其性状为：颗粒直径45～165μm，对球形蛋白质的分离范围为60,000-20
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8.步骤s1所述尺寸排阻层析采用的凝胶填料为sepharose cl-6b，其性状为：颗粒直径44～165μm，对球形蛋白质的分离范围为10,000-4
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9.步骤s1所述尺寸排阻层析柱的柱床体积为10～12ml。
10.步骤s2所述尺寸排阻层析采用缓冲液为20%乙醇溶液。
11.所述缓冲液溶液经0 .22μm滤膜过滤。
12.该分离柱可以用于细胞培养液上清、血浆、尿液等液体样本中外泌体的分离。本发明方法可减少了分离过程的耗时，减少分离过程中高丰度蛋白质和其他杂质的污染，并且不需要复杂的仪器设备，大大降低了成本。本发明方法具以下优点：1. 原料成本低，制备流程相对简单;2 .采用本发明提供的sec分离柱可从样品中快速分离外泌体，不需要超高速离心机等专用设备，分离操作简单；3 . 采用本发明提供的sec分离柱可在保持外泌体完整形态及功能的前提下，分离得到高纯度外泌体；4 . 采用本发明提供的sec分离柱可去除样品中游离蛋白质，且对游离蛋白质承载力强；5 . 采用本发明提供的sec分离柱分离过程不引入非样品来源的杂质。
附图说明
13.图1 制备好的sec分离柱；图中标号说明：1——分离柱；11——凝胶填充区；2——上顶盖；3——下口塞；4、5——上、下筛板。
具体实施方式
14.以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。实施例中所用的原料如无特殊说明，均可从常规商业途径得到。
15.实施例1sec分离柱,如图1所示，包括分离柱1、上顶盖2、下口塞3，在分离柱1有凝胶填充区11，在凝胶填充区11的上、下有上筛板4下筛板5，按下述步骤制备：s1. 材料准备仪器准备：包括分离柱1、上顶盖2、下口塞3和上、下筛板4、5；操作工具：烧杯、移液器、一次性滴管、装填柱和/或专用管架；材料准备：装填用凝胶sepharose cl-2b，无水乙醇，去离子水等，并配置75%乙醇溶液，用于灭菌；20%乙醇溶液，用作缓冲液；s2. 材料清洗清洗分离柱1、装填柱、上顶盖2和下口塞3，将之置于干净的大烧杯中用75%乙醇溶液浸泡10min消毒；然后，在缓冲液20%乙醇溶液中浸泡，超声20min，浸泡10min，37℃烘干备用，注意套袋避免灰尘；清洗筛板：在消毒液75%乙醇溶液浸泡10min消毒；在缓冲液20%乙醇溶液浸泡，脉冲式超声3次，每次20min，间隔10min，目的是排空气泡。20%乙醇溶液浸泡过夜，使用前再次超声20min，注意套袋避免灰尘；s3. 凝胶装填（1）用缓冲液20%乙醇溶液浸润分离柱1、上顶盖2和下口塞3；（2）装下筛板5：用缓冲液20%乙醇溶液冲洗分离柱1内壁，然后装下筛板5，用装填柱将下筛板5缓慢推进至分离柱1底部内，并避免划破分离柱1的内壁，待下筛板5固定好之后，盖上顶盖2和下口塞3，拿出装填柱（注意一定要缓慢，防止气泡的产生）加满缓冲液20%乙醇溶液，取下下口塞3，让缓冲液自然流出，排尽装下筛板5过程中产生的气泡，随后关闭下出口，分离柱1内留少许如0.5cm缓冲液；（3）装填凝胶：将凝胶sepharose cl-2b装至8-10cm深度，制备前2h平衡至室温，装填速度0.5ml/min左右，为防气泡，可用玻璃棒引流，或者使用滴管沿着分离柱1的内壁缓慢滴入；在顶部加满乙醇，装填完成后，自然沉降不少于3h到凝胶柱呈稳定状态，期间如果调整装填凝胶的含量，改变后需再次稳定；（4）打开下出口，柱内的乙醇自然流出排尽，凝胶再次稳定后，关闭下出口；（5）缓慢添加缓冲液20%乙醇溶液填满上部空间，打开下出口，并防止打破凝胶的稳定状态，到缓冲液能够稳定流出，即系统稳定状态，然后关闭下出口；（6）装上筛板4：用装下筛板5同样的方式，缓慢推进上筛板4；
（7）打开下出口，体系自然沉降后，稍稍下压筛板2-3mm；（8）关闭下出口，体系自然沉降后，若分离柱1上部还有空间，再加缓冲液至预留0.5cm高度的空间后，用上顶盖封口；（9）做好标记，4℃冰箱保存备用。
16.本实施例中，尺寸排阻层析采用的凝胶填料为sepharose cl-2b，其性状为：颗粒直径60～200μm，对球形蛋白质的分离范围为70,000-40
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17.尺寸排阻层析柱的柱床体积为10～12ml。
18.实施例2sec分离柱，结构与实施例1相同，按下述步骤制备：s1. 材料准备仪器准备：包括分离柱1、上顶盖2、下口塞3和上、下筛板4、5；工具准备：烧杯、移液器、一次性滴管、装填柱和/或专用管架；材料准备：装填用凝胶sepharose cl-4b、无水乙醇和去离子水，并配置消毒液75%乙醇溶液，用于灭菌；缓冲液20%乙醇溶液；s2. 材料清洗清洗分离柱1、上顶盖2、下口塞3和操作工具装填柱，将其置于干净的大烧杯中用75%乙醇溶液浸泡消毒10min；然后，在缓冲液20%乙醇溶液中浸泡，超声20min，浸泡10min，37℃烘干，防尘（如可意套袋避免灰尘）备用；清洗筛板：75%乙醇溶液浸泡消毒10min后，在缓冲液20%乙醇溶液浸泡，脉冲式超声3次，每次20min，间隔10min，排空气泡，缓冲液20%乙醇溶液浸泡过夜，使用前再次超声20min，并套袋防尘；s3. 凝胶装填（1）用缓冲液20%乙醇溶液浸润分离柱1、上顶盖2和下口塞3；（2）装下筛板5：用缓冲液冲洗分离柱1子内壁后，装下筛板5，用装填柱将下筛板5缓慢推进至分离柱1的底部内，并避免划破内壁，待下筛板5固定好后，盖上下口塞3，缓慢拿出装填柱加满缓冲液20%乙醇溶液后，取下下口塞3，让缓冲液自然流出，以排尽装下筛板5过程中产生的气泡，随后，关闭下出口，分离柱1内留0.5cm左右高度的缓冲液；（3）装填凝胶：凝胶sepharose cl-4b装填8-10cm；制备前2h平衡至室温，装填速度0.5ml/min，用玻璃棒引流，或用滴管沿着分离柱1内壁缓慢滴入，以避免产生气泡，在分离柱顶部加满乙醇，装填完成后，自然沉降不少于3h，至体系稳定状态，如果调整装填凝胶的含量，改变后需再次稳定；（4）打开下出口，柱内的乙醇溶液自然流出排尽，凝胶再次稳定后，关闭下出口；（5）缓慢添加20%乙醇溶液填满上部空间，打开下出口。（注意一定要慢，不能打破凝胶的稳定状态）到缓冲液（20%乙醇溶液）能够稳定流出，即系统稳定状态，然后关闭下出口。
19.（6）装上筛板4：用装下筛板5同样的方式，缓慢推进上筛板4；（7）打开下出口，体系自然沉降，稍稍下压筛板2-3mm；（8）关闭下出口，体系自然沉降，若上部还有空间，再加缓冲液20%乙醇溶液，预留0.5cm高度的空间，上顶盖2封口；
（9）做好标记，4℃冰箱保存，备用。
20.本实施例尺寸排阻层析采用的凝胶填料为sepharose cl-4b，其性状为：颗粒直径45～165μm，对球形蛋白质的分离范围为60,000-20
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21.实施例3sec分离柱的制备s1. 材料准备仪器准备：包括分离柱1、上顶盖2、下口塞3和上、下筛板4、5；工具准备：烧杯、移液器、一次性滴管、装填柱和/或专用管架；材料准备：装填用凝胶sepharose cl-6b、无水乙醇和去离子水，并配置消毒液75%乙醇溶液，用于灭菌；缓冲液20%乙醇溶液；s2. 材料清洗清洗分离柱1、上顶盖2和下口塞3，以及操作工具装填柱，将其置于干净的大烧杯中用75%乙醇溶液浸泡消毒10min后，在缓冲液20%乙醇溶液中浸泡，超声20min，浸泡10min，37℃烘干，套袋防灰备用；清洗筛板：用75%乙醇溶液浸泡消毒10min，缓冲液20%乙醇溶液浸泡，脉冲式超声3次，每次20min，间隔10min，以排空气泡，20%乙醇溶液浸泡过夜，使用前再次超声20min，注意套袋避免灰尘。
22.s3. 凝胶装填 （1）缓冲液20%乙醇溶液浸润分离柱1、上顶盖2和下口塞3；（2）装下筛板5：用20%乙醇溶液冲洗分离柱1内壁，然后装下筛板5；用装填柱将下筛板5缓慢推进至分离柱1底部内，避免划破分离柱1内壁；待下筛板5固定好后，盖上下口塞3，用装填柱缓慢加满缓冲液20%乙醇溶液，取下下口塞3，让缓冲液自然流出，以排尽装下筛板5过程中产生的气泡，随后关闭下出口，分离柱1内留少许（0.5cm）乙醇溶液；（3）装填凝胶：装填凝胶sepharose cl-6b至8-10cm，制备前2h平衡至室温，装填速度0.5ml/min，用玻璃棒引流，或者使用滴管沿着分离柱1内壁缓慢滴入，以免产生气泡，顶部加满乙醇，装填完成后，自然沉降不少于3h，到体系稳定状态，期间需要调整装填凝胶的含量，改变后需再次稳定；（4）打开下出口，柱内的乙醇溶液自然流出排尽，凝胶再次稳定后，关闭下出口；（5）缓慢添加缓冲液20%乙醇溶液填满分离柱内1的上部空间，打开下出口，到缓冲液能够稳定流出，即系统稳定状态后，关闭下出口；（6）装上筛板4：用装下筛板5同样的方式，缓慢推进上筛板4；（7）打开下出口，体系自然沉降，稍稍下压上筛板2-3mm（8）关闭下出口，体系自然沉降，若上部还有空间，再加缓冲液20%乙醇溶液，预留0.5cm空间，上顶盖2封口；（9）做好标记，4℃冰箱保存备用。
23.本实施例中，尺寸排阻层析采用的凝胶填料为sepharose cl-6b，其性状为：颗粒直径44～165μm，对球形蛋白质的分离范围为10,000-4
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