一种核酸适配体有序功能化的亲和整体柱及其制备方法

本发明属于材料化学领域，具体涉及一种基于核酸适配体有序功能化的亲和整体柱及其制备方法。

背景技术：

1、核酸适配体碱基与界面材料之间存在相互作用，在纳米界面上的构象往往不能够得到很好的保持，这在很大程度上会影响核酸适配体功能的发挥。利用生物结合法如链霉亲和素-生物素、共价结合法和纳米金（aunps）法，作为核酸适配体的有效引入方式，得到了良好的发展，但是由于核酸序列的随机吸附性，使其在材料表面经常呈现无序分布。核酸适配体与aunps颗粒之间相互作用，已广泛应用于复杂样品中痕量物质的亲和识别。实现核酸适配体在aunps表面的有序分布，对于提高适配体亲和识别性能，具有重要意义。

2、纳米金负载核酸适配体整体柱目前主要采用盐老化的方法进行制备，其一般是先制备核酸适配体-纳米金复合物，再将复合物固载于整体柱上。chen等利用金纳米颗粒（gnp）为媒介固定了三种单官能化（胺，硫醇和羧基）和两种双官能化（胺和硫醇以及胺和羧基）杂化整体柱，以构建通用底物修饰gnps，制备的适配体亲和整体柱的负载密度高达2205.8 pmol·μl-1。yu等将apt@aunps复合物固定在具有丰富基团的（poss-pei）杂化整体柱上。lin等以纳米金粒子作为媒介，制备了系列核酸适配体亲和整体柱，实现了不同毒素如赭曲霉毒素a、玉米赤霉烯酮、双酚a等小分子目标物的特异性识别检测，且其覆盖密度高达3388-3636 pmol·μl-1。现有制备的亲和整体柱的适配体负载密度达到了较高水平，但是适配体的碱基对au表面有一定的吸附能力，难免会产生非特异性附着甚至在aunps表面呈现倒伏无序的状态，从而影响dna生物功能的有效利用。因此，实现适配体在柱的构象状态的有效调控和高效利用是目前研究的关键。

3、研究发现，dna电荷吸附是一种简单、直接且具有成本效益的模式。带负电荷（基于磷酸基团）的dna可以吸附到带正电荷的聚合物或支撑载体上，而利用聚腺嘌呤（polya）和纳米金表面较强的结合力，可实现dna分子在aunps表面的强烈附着，并可以屏蔽dna的其他碱基序列与纳米金间的非特异性吸附，有助于实现dna在纳米金表面的有效结合和自组装有序性。目前在亲和整体柱领域如何有效开展纳米金的双嵌dna修饰和有序性结构构筑等还没有报道，因此，有序控制整体柱微尺寸空间中dna序列的方向和构象仍然具有挑战性。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种核酸适配体有序功能化的亲和整体柱及其制备方法，其是基于光引发聚合反应，以烯基自由基原位聚合形成表面富含强阳离子正电荷的整体柱基质，继而以静电作用直接吸附带负电荷的纳米金@双嵌段dna复合纳米粒子，以形成纳米金@双嵌段dna自组装功能化的亲和整体柱。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、一种核酸适配体有序功能化的亲和整体柱，其是将含有聚腺嘌呤（poly-a）和核酸适配体（apt）的双嵌段dna修饰在表面带有羧基负电荷的纳米金（aunps）表面，形成覆盖密度可调控的核壳结构aunps@polya-apt复合纳米粒子，然后以该复合纳米粒子为功能探针，通过静电作用将其直接吸附在强阳离子聚合物构成的固定相基质表面，利用poly-a与纳米金的优先结合作用及dna链之间的空间位阻效应，实现核酸适配体在纳米金表面的直立有序排列，从而制得所述亲和整体柱。

4、进一步地，所述双嵌段dna的一端含有聚腺嘌呤（poly-a）序列、另一端为具有识别功能的核酸适配体（apt），其具体碱基序列为(a…a)ntttttgatcgggtgtgggtggcgtaaagggagcatcggaca，其中n=5~30。

5、进一步地，所述强阳离子聚合物是以季铵单体为离子化试剂、聚倍半硅氧烷为交联剂、2-恶唑啉酮类化合物为功能单体，在制孔剂和引发剂的辅助下，经光引发原位聚合形成。

6、进一步地，所述季铵单体具体为甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵（dmc），所述2-恶唑啉酮类化合物具体为2-乙烯基-4,4-二甲基-2-恶唑啉-5-酮（vdma），所述聚倍半硅氧烷具体为甲基丙烯酸酯接支的多面体低聚倍半硅氧烷；所述致孔剂由n,n-二甲基甲酰胺（dmf）和分子量10000的聚乙二醇（peg-10000）按质量比19:1组成；所述引发剂为安息香双甲醚。

7、所述亲和整体柱的制备方法包括以下步骤：

8、（1）aunps@polya-apt复合纳米粒子的制备：

9、将双嵌段dna加入ph为7.60、浓度为5 mm的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（hepes）缓冲液中，配制成含双嵌段dna 100 nm的hepes缓冲液；取上述含双嵌段dna的hepes缓冲液1.0 μl，与200 μl、10 nm的纳米金溶液室温混合孵育10 min，然后加入500 mm、ph为3.00的柠檬酸盐缓冲液，至混合溶液中柠檬酸盐的最终浓度为10 mm；然后在室温下反应3min后，加入500 mm hepes缓冲液以调整ph为7.60，继续室温孵育5-10 min后，离心洗涤三次，除去游离的核酸适配体，得到aunps@polya-apt复合纳米粒子，再将其分散在5mm的hepes缓冲液中，于4℃冰箱保存备用；

10、（2）整体柱基质的制备：

11、按比例称取季铵单体、2-恶唑啉酮类化合物和聚倍半硅氧烷，混合后加入致孔剂和引发剂，室温下涡旋振荡3 min后超声脱气10 min，使其形成均一溶液；然后将所得溶液注入乙烯化预处理好的石英毛细管中，两端密封后于365 nm紫外光辐照5 min进行聚合；反应完成后将制备好的整体柱取出，连接至液相色谱仪，用高压溶剂泵泵入甲醇冲洗除去残留物，得到表面富含季铵盐阳离子正电荷的交联聚合整体柱；

12、（3）亲和整体柱的制备：

13、往步骤（2）制备的整体柱中充满tris-hcl缓冲液，然后通过液相泵注入步骤（1）得到的aunps@polya-apt复合纳米粒子溶液，直至柱体由白色变成红棕色，末端流出的液体变成粉红色时停止注入，再分别用二次水和结合缓冲液清洗整体柱，除去未结合的复合物，制得aunps@双嵌段dna修饰的高亲和整体柱，置于4 ℃条件下保存。

14、进一步地，步骤（2）制备整体柱基质所用各组分的质量百分数为：季铵盐单体7.84%、聚倍半硅氧烷6.86%、2-恶唑啉酮类化合物4.90%、致孔剂78.4%、引发剂2.00%。

15、进一步地，步骤（2）所述结合缓冲液的ph为8.00，其含10 mmol/l tris-hcl、120mmol/l nacl、5 mmol/l kcl和20mmol/l cacl2。

16、本发明以含有聚腺嘌呤嵌段（poly-a）和核酸适配体（apt）的纳米金@双嵌段dna复合纳米粒子为功能探针，基于聚合物表面强阳离子直接对其进行吸附，以构成该亲和整体柱，同时由于poly-a与纳米金有优先结合作用以及dna链之间的空间位阻效应，可实现核酸适配体在纳米金表面直立有序排列，且纳米金@双嵌段dna复合纳米粒子在整体柱上的覆盖密度可通过调控poly a嵌段部分的a碱基数量进行调控（随着a碱基的数量增多，纳米金@双嵌段dna复合纳米粒子的修饰密度降低），从而可实现对目标物的高特异性识别。

17、本发明的显著优点在于：

18、针对单链线型核酸适配体在au表面会产生非特异性附着甚至呈现倒伏无序的状态，使核酸适配体在整体柱限域空间中构象状态难以有效调控和高效利用的限制，本发明提出了一种纳米金@双嵌段dna复合纳米粒子在整体柱微尺寸表面有序自组装的新技术。其基于整体柱基质表面上季铵盐阳离子的强静电结合作用，以实现纳米金@双嵌段dna复合纳米粒子的高效自组装；并基于聚腺嘌呤与纳米金表面的优先作用和dna链之间的空间位阻效应，实现纳米金@双嵌段dna复合纳米粒子上核酸适配体在纳米金表面直立有序排列，从而解决了限域空间中核酸适配体构象调控和高效利用的瓶颈问题。

19、与传统的共价键结合方法相比，本发明基于对核酸适配体的电荷直接吸附，其制备过程直接、快速、无需化学修饰，降低了适配体的合成成本，具有很好的经济效益，同时避免了双硫键的形成需要的活化步骤，具有制备简单、核酸适配体固定化效率高等优势；利用poly-a对纳米金表面进行饱和覆盖，可有效抑制dna在aunps表面的非特异性吸附；且可以通过简单调节poly-a嵌段的长度就可以控制其组装密度，为调控制备高性能的核酸适配体功能化亲和整体柱及应用提供了新途径。