一种用于超微量样品处理的微液滴反应器及使用方法

本发明涉及微流控生化分析，具体涉及一种用于超微量样品处理的微液滴反应器及使用方法。

背景技术：

1、如何对超微量(微克级以下)的生化样品进行处理与表征，一直是生化分析领域的一个重要挑战。随着单细胞分析等高精度生化分析技术的发展，被分析的样品量越来越小，常规的离心管、试管等反应容器已经无法适应超微量样品的处理过程。相比之下，液滴微流控技术可以利用互不相溶的两液相产生分散的微液滴来进行实验操作，液滴体积通常在纳升至皮升水平，特别适用于一些珍贵样品的分析检测。微液滴反应具有样品消耗少、交叉污染小、试剂混合快、反应速率高、操作准确性好、可重复性高等多种优点，目前已广泛应用于单细胞分析、酶分析、蛋白质分析、核酸分析等多个生化分析领域。

2、目前的液滴微流控技术主要是通过施加一定的外力，破坏水油两相之间存在的张力平衡来生成微液滴，主要包括t型通道法、流动聚焦法、共流聚焦法、电场驱动法、光控法、微型阀驱动法等。

3、例如公告号为cn105363503b的专利说明书中公开了一种多组分微液滴微流控芯片，它由依次叠置的封盖层、疏水芯片层、亲水芯片层和基底层构成，其中，所述封盖层包含5个试剂入口，即1个水相a入口2个所述封盖层的水相b入口，以及2个油相入口；所述疏水芯片层为聚焦流式微通道结构，包含1个水相a引入通道、2个油相引入通道和1个油包水型微液滴生成腔室，它们由1个十字交叉聚焦流微液滴生成通道连通；还包含2个所述疏水芯片层的水相b入口，与封盖层相配合；所述亲水芯片层为聚焦流式微通道结构，包含1个微液滴引入通道、2个水相b引入通道和1个油包水型多组分微液滴生成腔室，它们由1个十字交叉聚焦流油包水型多组分微液滴生成通道连通；所述基底层包含1个油包水型多组分微液滴收集出口。

4、上述方法可以灵活便捷地生成大量稳定的微液滴，也可以通过液滴的分裂、融合、内部混合、捕获等操作实现样品提取、试剂添加等多种生化反应操作。但是，由于这些方法大多需要利用矿物油、氟油等有油相溶液分散液滴，所以可能会导致部分亲脂性样品溶于油中，造成样品损失。并且，在提取微液滴中的反应物时，也不可避免地会引入少量油相溶液，不仅会干扰液相色谱等分析仪器的分离，还会降低高分辨质谱系统的电喷雾效率，从而影响样品的鉴定与分析。

5、因此，发展一种无油相介入、操作灵活的微液滴反应器，并在微液滴内原位进行连续的多步反应处理，对于超微量样品的精准生化分析具有十分重要的意义。

技术实现思路

1、本发明的一个目的在于提供一种用于超微量样品处理的微液滴反应器，该反应器基于密封片的灵活开合实现微液滴多步反应过程，不引入矿物油等污染物，可兼容液相色谱、质谱等常见分析仪器。

2、一种用于超微量样品处理的微液滴反应器，包括：

3、反应容器，用于承载样品微液滴；

4、试剂，置于所述反应容器内用于保持湿度；

5、密封片，用于密封所述反应容器；

6、固定器，用于保证所述密封片与所述反应容器密封贴合；

7、温度控制器，置于所述反应容器底部用于调控反应容器内温度。

8、作为优选，所述反应容器采用离心管、进样瓶容器的盖子、多孔板或微孔芯片等面阵板材，以简单易得、成本低廉、与样品和试剂无相互作用为宜。进一步优选，在样品数量较少时，使用低蛋白质吸附离心管的管盖作为反应容器，在样品数量较多时，使用多孔板作为反应容器。

9、作为优选，所述试剂采用去离子水、碳酸氢铵溶液或磷酸盐缓冲溶液。通常具有低于样品溶液的离子浓度，主要用于在加热时优先蒸发，维持反应容器内的饱和蒸气压，保持湿度，抑制样品液滴的过度快速蒸发。

10、作为优选，所述密封片采用透明胶带、硅胶垫片、封口膜或锡纸。进一步优选，使用透明胶带作为密封片，使用滚轮结构自动封合与开启密封片。

11、作为优选，所述固定器采用金属重块、塑料卡扣或夹子。进一步优选，使用金属重块通过重力压住密封片，避免密封片在升温过程中由于反应容器内压力升高而脱离。

12、作为优选，所述温度控制器采用加热片、制冷片、恒温箱或烘箱。进一步优选，组合使用加热片和制冷片构成温度控制器。

13、本发明的一个目的在于提供一种基于上述微液滴反应器进行超微量样品多步生化反应的方法，所述方法包括以下步骤：

14、(1)使用液体操纵探针向反应容器中央滴加纳升级的样品和试剂，或从中吸取部分反应液，在原位进行一步或多步反应；

15、(2)在远离样品反应液滴的反应容器内部边缘滴加保湿试剂，并在多步反应过程中依据需求补充保湿试剂；

16、(3)在每个反应步骤前后，开启密封片以加入试剂或吸出反应液，封合密封片以密闭反应容器；

17、(4)固定密封片，对样品反应环境进行温度控制。

18、本方法具有样品与试剂消耗少、反应效率高、反应损失小、无试剂污染等优点，适用于微量样品分析、单细胞分析、蛋白质分析与核酸分析等领域，尤其适用于单细胞蛋白质组学分析领域。

19、在反应容器内部边缘滴加保湿试剂，主要目的是提高反应空间内的湿度，避免纳升级反应液滴的过快蒸发。优选地，可滴加2.5～10微升去离子水。根据拉乌尔定律(raoult's law)，在相同温度下，保湿试剂的饱和蒸气压高于含有更高溶质浓度的样品反应溶液，所以在反应容器内部蒸气压达到样品反应溶液的饱和蒸气压后，保湿试剂会由于尚未达到饱和蒸气压而继续蒸发，从而保护了样品液滴在高温等极端条件下不被蒸干，样品液滴中的反应物始终保持高浓度离子状态，具有较高的反应效率和较低的吸附与相变损失。实践证明，低溶质浓度的去离子水液滴可以有效地代偿样品液滴的蒸发。

20、开启和封合密封片的方式，包括且不限于胶带封合、挤压封合等。优选地，可使用宽度略大于反应容器开口直径的透明胶带封合，使用滚轮按压透明胶带促进封合完整，滚轮可由电机驱动以实现自动化操作。使用透明胶带封合不仅成本低廉、操作简便，而且可以实时观察样品的反应状态，并根据水雾的大小评估反应器密封效果。

21、固定密封片的方式，包括且不限于使用重力压住、用夹子夹住等，主要目的是避免在加热、反应等过程中反应容器内气压升高导致的密封片漏气。优选地，可以用重物压住密封片。

22、本发明的有益效果：

23、(1)本发明中的微液滴反应器可以在没有油相介入的情况下维持液滴形态，既能保持微量样品高效反应所需的微体积，又不会造成亲脂性溶质损失，而且不会引入油相污染，能够兼容液相色谱、质谱等常用的分析仪器。

24、(2)本发明中的微液滴反应器可以灵活便捷地开启与闭合，可以根据实际需要自由地添加试剂，或者吸取反应溶液，非常适合样品量少、反应步骤多、需要实时监测反应进程的长链条复杂反应过程，尤其适用于超微量样品的生化分析过程。

25、(3)本发明中的液滴保湿方法可以有效降低样品溶液的蒸发，即使在高温条件下，也能保障样品液滴不蒸干，使得样品溶液始终保持高活性、高离子浓度的溶液反应状态。相比于常规的反应器，不仅大幅提高了样品反应效率，而且降低了样品的表面吸附与相变损失。

26、(4)由于使用批量生产的常规反应容器，甚至使用常规操作中废弃不用的离心管盖构建反应器，所以成本低廉，容易根据实际应用场景选择合适的材料构建匹配的微液滴反应器，也容易利用阵列化结构和自动化系统提升样品分析的通量与自动化水平。