一种纳米酶的制备方法及应用

本发明涉及生物检测，具体涉及一种纳米酶的制备方法及应用。

背景技术：

1、纳米酶具有催化效率高、大规模制备方便、易于长期储存等特点，广泛应用于生物和化学传感平台。纳米材料的单酶活性已被广泛报道，特别是类过氧化物酶(pod)活性。近年来，具有多酶活性的纳米材料参与多步/串联反应，每个酶负责一个反应步骤，从而实现多种化学物质的同时测定，引起了研究者们极大的兴趣。此外，多酶催化剂的协同作用提高了单一酶的催化效率。例如，co2v2o7具有类氧化酶(oxd)，pod和过氧化氢酶(cat)活性，2dmose2@pvp纳米片具有类cat，pod，超氧化物歧化酶(sod)和谷胱甘肽过氧化物酶(gpx)活性，nsc/co1-xs具有类oxd和pod活性。值得注意的是，与单酶活性相比，纳米材料多酶活性的潜在机制尚不清楚。然而，基于现有研究成果，可以肯定的是，具有多酶活性的新型纳米酶材料的开发具有优异的催化性能，在分析应用中具有巨大的潜力。

2、最近，各种钒基杂化材料(vox)的强大催化活性已被证明，使其成为多种实际应用的绝佳候选者。由于其多种氧化态(v2+，v3+，v4+，v5+)，vox易于形成具有多价态特性的纳米复合材料，这有助于缺陷位点的构建和纳米材料内电子的快速转移。因此，vox的这些优越特性为涉及催化显色反应的检测方法提供了巨大的应用潜力。由于其独特的结构特性，vox作为一种稳定性高、催化活性可调控的纳米酶在生物传感和显色分析方面有着极高的应用潜力。

3、复合纳米材料各组分之间的协同作用可以有效增强其类酶活性。层状多孔碳材料有利于增加活性位点的暴露和促进电子转移。多孔碳材料与金属氧化物纳米颗粒的结合可以增加纳米复合材料的比表面积，同时还可以作为扩散基底以防止其团聚。在碳材料中，氮掺杂碳纳米材料具有导电性高、比表面积大、易于功能化修饰等突出优势。因此，氮掺杂碳纳米材料被广泛应用于储能、催化和化学分析等领域。将具有多级多孔结构的碳材料与金属氧化物进行整合是提高纳米酶催化性能的有效策略。

4、因此，将vox与氮掺杂碳纳米材料进行复合开发出性能更好的纳米酶，并将其应用至生物和化学传感平台，在复杂药物和食品基质的tac量化分析中有着极高的应用潜力。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种低成本、操作简便、可视化的基于双酶活性3d-v2o5/nc纳米酶催化的快速比色检测tac的方法。

2、为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

3、一种纳米酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：

4、(1)将由草酸、偏钒酸铵和二氰胺制得的前驱体以1.5～5℃/min的加热速率在氮气气氛中加热至750～850℃，并于750～850℃下保温煅烧1.5～3h，得到vn/nc复合材料；

5、(2)将所述vn/nc复合材料以0.5～2℃/min的加热速率在空气气氛中加热至250～320℃，然后于250～320℃下继续加热6～10h，得到所述纳米酶。

6、优选地，步骤(1)中的煅烧温度为760～820℃，再进一步优选为790～810℃。

7、优选地，步骤(2)中的加热温度为260～300℃，再进一步优选为270～290℃。

8、优选地，步骤(1)中的加热速率为1.5～2.5℃/min，例如1.5℃/min、1.6℃/min、1.7℃/min、1.8℃/min、1.9℃/min、2.0℃/min、2.1℃/min、2.2℃/min、2.3℃/min、2.4℃/min、2.5℃/min。

9、优选地，步骤(2)中的加热速率为0.8～1.5℃/min，例如0.8℃/min、0.9℃/min、1.0℃/min、1.1℃/min、1.2℃/min、1.3℃/min、1.4℃/min、1.5℃/min。

10、优选地，所述草酸、偏钒酸铵和二氰胺的投料质量比为1：(0.2～0.8)：(8～15)，进一步优选为1：(0.4～0.6)：(8～12)。

11、优选地，所述前驱体的制备方法为：向草酸和偏钒酸铵的水溶液中加入二氰胺，在75～85℃下蒸干水分得到所述前驱体。

12、根据一些优选实施方式，在油浴中进行所述干燥。

13、本发明还提供一种纳米酶，所述纳米酶由上述制备方法制备得到，命名为3d-v2o5/nc纳米复合材料。

14、具体地，所述纳米酶的表面积为145～160m2/g；所述纳米酶的孔隙体积为0.2～0.35cm3 g-1；所述纳米酶的平均孔隙大小为5～8nm，所述纳米酶具有类过氧化氢酶和类氧化物酶双重活性。本发明还提供上述纳米酶在h2o2或tac定量检测传感平台中的应用。

15、本发明还提供一种tac定量检测方法，基于比色法测试tac，利用抗氧化物物质对“上述纳米酶+h2o2+tmb”显色体系的抑制作用。

16、所述定量检测方法为，具体包括：

17、(1)、构建显色体系：利用权利要求6或7所述的纳米酶的类过氧化氢酶活性催化h2o2分解产生o2，利用所述纳米酶的类氧化物酶活性催化o2产生·o2-，所述·o2-氧化tmb产色蓝色的oxtmb得到所述显色体系；

18、(2)、利用aa的还原性对所述显色体系的抑制效应，获得aa含量与颜色值间的线性关系；

19、(3)、利用待测样品对所述显色体系的抑制效应，将颜色值代入上述线性关系，以aa为抗氧化物模型化合物，mm/l aa为单位来量化tac。

20、具体地，所述反应为：将40～55mm h2o2、0.2～0.3mg/ml 3d-v2o5/nc、2～8mm tmb和待测样品加入ph为3～4的naac-hac缓冲液中，混合溶液在25～35℃下孵育10～30min。

21、所述检测方法基于智能手机检测平台，包括采用"thing identify"软件开发的基于智能手机的比色法应用。

22、将显色后的反应溶液滴加到黑色96孔板中，利用暗箱拍照装置和智能手机app“thing identify”对显色结果进行拍照及分析。构建基于智能手机可视化的比色检测方法。

23、总抗氧化能力(tac)可以通过检测抗氧化剂(如抗坏血酸aa)的含量来量化。aa为抗氧化物模型化合物，mm/l aa为单位来量化tac。本发明开发了3d-v2o5/nc纳米复合材料，实现了超细颗粒(～2.5nm)、多孔碳层、大比表面积(152.4m2/g)、n掺杂和异质结构。3d-v2o5/nc的强催化活性来自于双酶模拟活性(类过氧化氢酶活性和类氧化物酶活性)的协同效应。这种纳米酶呈现出比其单组分或前驱体(如vn/nc、nc、v2o5和vo2/g-c3n4)更高的催化活性。ros清除实验证实，·o2-在催化颜色反应中起到了关键作用。凭借3d-v2o5/nc纳米酶的活性和tmb作为显色底物，“3d-v2o5/nc+tmb+h2o2”的显色体系为tac提供了低检测限(0.03μm)和合适的回收率(93.0-109.5％)。此外，采用"thing identify"软件(app)开发了基于智能手机的比色法应用，以量化维生素c泡腾片和饮料(如果汁和茶)中的tac。与商业abts检测试剂盒相比，该比色传感器和智能手机检测平台为tac检测提供了更好或相当的分析性能。新开发的基于智能手机的比色平台具有几个突出的优势，如低成本、简单/快速的操作、便携性、户外使用的可行性，以及对医疗点应用的适应性。

24、本发明与现有技术相比具有如下优势：

25、使用本发明的制备方法制备的3d-v2o5/nc纳米复合材料具有超细颗粒、多孔碳层、大比表面积、n掺杂和异质结构。3d-v2o5/nc的强催化活性来自于双酶模拟活性(类过氧化氢酶活性和类氧化物酶活性)的协同效应。进一步地，凭借3d-v2o5/nc纳米酶的活性和tmb作为发色底物，“3d-v2o5/nc+tmb+h2o2”的显色体系为tac提供了低检测限和合适的回收率。本发明丰富了复合材料纳米酶的种类，为tac检测提供了更多的选择。