一种超高密度球形核酸及制备方法

本发明涉及生物纳米材料合成，特别涉及一种超高密度球形核酸及其制备方法。

背景技术：

1、球形核酸(sna)是一种多价核酸-纳米颗粒偶联物，最初由金核和dna壳层组成，表现出与纳米颗粒和dna所衍生的不同特性，这种定义良好的纳米结构可作为生物/化学传感、治疗、分子诊断、成像和dna可编程组装的新标签。这些极具前景的应用对sna制备工艺的简单性、高效性、多功能性和可扩展性提出了更高的挑战。

2、纳米颗粒表面配体形成的静电双分子层和密集的表面堆积往往给dna偶联带来很大的困难。现有的主要是采用盐老化方法来屏蔽金纳米颗粒(aunps)与dna之间的电荷斥力。然而，这个方法很耗时，需要两天以上时间才能避免盐诱导的aunps聚集。

3、为了克服这个局限，目前开发了一些先进的合成方法，如有人报道了低ph值和冷冻快速高效合成sna的方法(zhang x,servos m r,liu j.instantaneous andquantitative functionalization of gold nanoparticles with thiolated dna usinga ph-assisted and surfactant-free route[j].journal of the american chemicalsociety,2012,134(17):7266-9.liu b,liu j.freezing directed construction ofbio/nano interfaces:reagentless conjugation,denser spherical nucleic acids,and better nanoflares[j].journal of the american chemical society,2017,139(28):9471-4.)即分别在ph＝3和低温冷冻融化的条件下，实现aunps表面dna的快速修饰。也有开发了一种基于正丁醇瞬间脱水的快速合成snas的方法(hao y,li y,song l,etal.flash synthesis of spherical nucleic acids with record dna density[j].journal of the american chemical society,2021,143(8):3065-9.)，即利用正丁醇萃取诱发的瞬间脱水效应，产生均匀混合且高度浓缩的脱水dna/aunps“固溶体”，实现dna的高密度修饰。

4、此处，还有研究利用微波辅助加热干燥法(huang m,xiong e,wang y,et al.fastmicrowave heating-based one-step synthesis of dna and rna modified goldnanoparticles[j].nature communications,2022,13(1))和蒸发干燥法(ye y,hao y,yem,et al.evaporative drying:a general and readily scalable route to sphericalnucleic acids with quantitative,fully tunable,and record-high dna loading[j].small,2022,18(24).)实现了dna或rna高负载的snas合成。上述snas合成方法均是基于物理空间的压缩，并通过脱水来增加其局部浓度，以实现快速和高密度的偶联。但这些方法需要在有机试剂、高温、低温或酸性的条件进行，而且dna的偶联密度较低、均一性较差。因此，有必要提出了一种高密度、高均一性、绿色的sna制备方法。

技术实现思路

1、鉴于以上现有技术存在的缺点，本发明的目的在于提供一种超高密度球形核酸及其制备方法，解决上述现有技术的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种超高密度球形核酸的制备方法，其包括如下步骤：

4、s1、配置核酸溶液和金属纳米胶溶液；

5、s2、将核酸溶液与金属纳米胶溶液混合后置于声悬浮反应器中进行反应，声悬浮成悬浮液滴后，核酸分子致密偶联在纳米颗粒的表面形成纳米粒子；

6、s3、将步骤s2得到的纳米粒子经重悬、离心洗涤，去除未偶联的核酸分子，得到球形核酸。

7、进一步方案，步骤s1中核酸溶液是将核酸溶解在去离子水中形成的浓度为10-100μm的溶液。

8、更进一步方案，所述核酸的核苷酸碱基序列的5’端修饰有偶联基团；

9、所述碱基为腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶中的一种或多种；所述偶联基团为巯基、羧基、氨基或硅烷中的一种。

10、优选的，所述核苷酸碱基序列的长度为10-100bp。

11、进一步方案，所述金属纳米胶溶液是将金属纳米粒子分散于水相中形成的，所述金属纳米胶溶液的浓度为1-150nm。

12、更进一步方案，所述金属纳米粒子为金、银或铜中的一种；

13、金属纳米粒子的形态包括纳米球、纳米棒、纳米立方体、纳米八面体中的一种或多种；

14、金属纳米粒子的粒径尺寸为5-60nm。

15、优选的，所述金纳米胶溶液的制备方法如下：

16、采用还原法将haucl4合成为金纳米粒子，重复还原后得到各种不同粒径的金纳米粒子；将合成液经离心浓缩后分散于水相，形成金纳米胶溶液；所述还原法包括柠檬酸根还原法、柠檬酸根/单宁酸还原法和盐酸羟胺还原法。

17、进一步方案，步骤s2中核酸与金属纳米粒子的摩尔数比为200:1-5000:1；

18、所述声悬浮反应器的功率为2-100mw、反应时间为5-60min；悬浮液滴数为1-20滴。

19、进一步方案，步骤s3中离心洗涤的离心转速为3000-20000rpm、时间为50-60min；

20、离心洗涤的次数为2-4次，洗涤溶剂为去离子水或pbs缓冲溶液。

21、本发明的另一个发明目的是提供一种经上述制备方法所制备的球形核酸。

22、声悬浮反应器是市购装置，其是一种使流体和固体颗粒在声场中悬浮的装置。声悬浮是利用声场驻波与物体的相互作用产生竖直方向的悬浮力以克服物体的重量，使液滴在空间中悬浮，没有固-液或固-气界面，100％克服了边界效应，最大限度地减少了固体表面的物理化学效应，在多功能悬浮组装体的合成中具有巨大应用潜力。利用声悬浮声场驻波悬浮含有核酸和金属纳米溶胶的混合溶液的液滴，在声波产生的胶体表面重构和无损富集蒸发协同作用下，金属纳米颗粒上的配体会脱落，同时偶联致密的核酸分子，得到具有超高密度修饰的球形核酸。

23、本发明采用声悬浮反应器将核酸分子溶液与金属纳米胶溶液进行反应形成以金属纳米粒子作为内核、核酸分子为外壳的核壳结构，核酸分子致密偶联在金属纳米颗粒的表面。

24、本发明利用声悬浮声场驻波在声悬浮反应器中将核酸和金属纳米溶胶的混合溶液声悬浮成悬浮液滴。再基于声波产生无损富集蒸发和胶体表面重构的协同作用，避免了边界效应，克服了金属纳米粒子与核酸分子的静电排斥作用。使核酸分子和金属纳米粒子在物理空间上被压缩，局部浓度不断增加，同时金属纳米颗粒上的配体分子在超声作用下被剥离，从而金属纳米粒子与核酸上的巯基形成稳定的共价键，在其表面偶联一层高密度的核酸分子，使制得的球形核酸具有更高的偶联密度和更好的偶联均一性。

25、与现有的冷冻法和正丁醇脱水法相比，本发明制备的球形核酸的修饰密度更高，均一性更好，且偶联后的球形核酸的粒径分布向大尺寸移动，其平均尺寸从15.7nm增加到37.8nm。从而扩大了球形核酸在生物/化学传感、治疗、分子诊断及成像等领域的应用范围。

26、本发明的制备方法无需有机试剂、高温或低温等苛刻条件，实现了绿色、简易制备。