一种血液中脂蛋白的吸附材料及其制备方法和应用与流程

本技术涉及生物分离工程领域，更具体地说，它涉及一种血液中脂蛋白的吸附材料及其制备方法和应用。

背景技术：

1、细胞外囊泡(ev)是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，直径从30nm到1000nm不等。胞外囊泡主要由微囊泡(mv)和外泌体(exosome)组成，外泌体主要特指直径在30nm-100nm之间的细胞外囊泡，而微囊泡主要指直径在100nm-1000nm的细胞外囊泡。细胞外囊泡广泛存在于各种体液中，携带细胞来源的多种蛋白质、脂类、dna、mrna、mirna等等，并参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等过程。

2、由于细胞外囊泡的这些特性，使其具有作为检测靶标的特质，因此可以通过检测细胞外囊泡中的生物标志物来对疾病进行早期的筛查，如肿瘤的早期筛查或者神经系统疾病的早期筛查等。此外，细胞外囊泡由于其良好的靶向性，可以作为天然的药物载体，即可以将药物包裹在细胞外囊泡中，达到药物靶向传递的目的。

3、在细胞外囊泡应用中，需要对细胞外囊泡的进行纯化，其中应用最多的是外泌体的纯化以及部分微囊泡的纯化。在所有细胞外囊泡的纯化技术手段中，超速离心和凝胶排阻层析是最常用的两种技术手段。然而在细胞外囊泡的纯化过程中，极易发生脂蛋白的污染。

4、脂蛋白是一类由富含固醇脂、甘油三酯的疏水性内核和由蛋白质、磷脂、胆固醇等组成的外壳构成的球状微粒.脂蛋白对于哺乳动物细胞外脂质的包装、储存、运输和代谢起着重要作用，脂蛋白代谢异常(通常伴随着脂质组分和蛋白质组分的改变)与动脉硬化症、糖尿病、肥胖症以及肿瘤发生密切相关。

5、脂蛋白根据密度大小可分为：乳糜微粒、极低密度脂蛋白、中间密度脂蛋白、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白。

6、由于脂蛋白的种类复杂，并且其大小和密度与细胞外囊泡有很多相似之处，因此进行细胞外囊泡纯化的时候，很难将脂蛋白分离出去，从而导致外囊泡在纯化过程中容易受到脂蛋白的污染。

7、脂蛋白在血液中的浓度较高，高密度脂蛋白与低密度脂蛋白的浓度约为1015个颗粒/ml血液，而细胞外囊泡在血液中的浓度约为107-109个囊泡/ml血液。由于细胞外囊泡浓度远小于脂蛋白浓度，因此在细胞外囊泡的纯化过程中去除脂蛋白的污染非常困难。

8、目前常常采用下列几种手段来降低在细胞外囊泡纯化过程中的脂蛋白污染。

9、第一、通过采样时间和方式的控制

10、由于脂蛋白的代谢与进食的关系密切，有数据表明，在进食后3-4小时内乳糜微粒浓度增加了2倍。为了降低脂蛋白的污染，采用了事先筛选采血样本的方式。要求采血人群在采样前控制饮食，或者在进食后一定时间内采样。这种方式在临床应用中非常困难，降低了试剂应用的可行性。并且，即使是控制了采样的时间，也只能降低部分脂蛋白如乳糜微粒等的量，而无法消除纯化过程中脂蛋白的污染。另外该种方式在实际的临床应用中难以执行，检测人员无法确定待检患者的饮食情况，因此这种手段只能在特定的研究项目中应用。

11、第二、采用不同原理的纯化方式相结合

12、通常所用的纯化技术包括超速离心+凝胶排阻层析，即将血样按照常规的超速离心分离细胞外囊泡的方式，在＞100000×g的离心力下超速离心超过10小时，然后收集相应的细胞外囊泡层，将收集到的细胞外囊泡再通过凝胶排阻层析，按照颗粒大小进行分离纯化。通过两种不同的纯化手段的结合，可以大幅度减少细胞外囊泡中脂蛋白的污染。

13、上述纯化过程也可以按照不同的顺序进行，有研究者将血液样本先利用凝胶排阻层析进行细胞外囊泡分离，然后将收集到的细胞外囊泡再进行超速离心，在100000×g的离心力下超速离心20小时，可以纯化得到纯度较高的细胞外囊泡。

14、该种方式存在如下问题：1、时间消耗大，这两种纯化方式结合后的操作时间往往超过24小时，持续时间很长；

15、2、在纯化过程中细胞外囊泡的损失比较大，因为经过多次的样本转移，损失很大，回收率低；

16、3、即使两种方式相结合，也只能是有限度的降低脂蛋白的污染。

17、第三、吸附剂吸附

18、目前对于血液中脂蛋白的吸附剂，其主要针对血液中的低密度脂蛋白进行吸附和去除。常用的低密度脂蛋白吸附和去除技术主要包括下列几种方式：

19、1、以透析膜为载体，在载体上修饰配基进行吸附。透析膜包括聚枫膜、聚醚膜等，吸附配基主要是肝素。

20、2、以微球为载体，在载体上修饰配基进行吸附。这种形式的吸附材料种类众多，是主流的吸附剂形式。微球主要包括壳聚糖、纤维素或者聚乙烯醇的微球。常用的吸附配基有肝素、硫酸葡聚糖、酸性氨基酸等。也有通过磺酸基、磷酸基等配基修饰的方式进行吸附。

21、该种脂蛋白污染的消除方式存在下列缺点：

22、1、目前的脂蛋白吸附剂只能吸附某一类脂蛋白，其原因在于：目前的脂蛋白吸附材料主要应用于血液净化领域，主要目的是对高血脂症的治疗，用于治疗那些对于降血脂药物不敏感的高脂血症，因此目前的脂蛋白吸附剂主要针对的是血液中的低密度脂蛋白ldl，吸附的目的在于降低血液中低密度脂蛋白的浓度。

23、2、目前脂蛋白吸附材料特异性较差

24、目前的脂蛋白吸附材料，主要依赖在不同ph环境下，脂蛋白电荷性质与吸附材料的电荷相吸引和结合的方式进行吸附，而在同等环境下，血液中有多种组分可以与该吸附材料结合，从而导致吸附材料的特异性较差。

25、3、目前脂蛋白吸附材料结合量低，反应时间长

26、对于目前的脂蛋白吸附材料来说，血液与脂蛋白吸附材料的作用时间通常超过一个小时。且目前吸附材料的脂蛋白结合量通常较低，血液净化反应的时间较长。本发明所描述的血液细胞外囊泡的纯化场景，需要有较快的结合速度与结合效率。

27、基于上述问题，本技术提出了一种血液中脂蛋白的吸附材料及其制备方法和应用。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本技术提供一种血液中脂蛋白的吸附材料及其制备方法和应用。

2、第一方面，本技术提供一种血液中脂蛋白的吸附材料，采用如下的技术方案：

3、一种血液中脂蛋白的吸附材料，包括微球载体和微球载体上共价偶联的脂蛋白抗体。

4、优选的，所述微球载体包含但不限于琼脂糖凝胶微球、纤维素微球、聚苯乙烯微球和聚乙烯醇微球。

5、优选的，所述聚苯乙烯微球的制备方法如下：

6、a1.将稳定剂、表面活性剂溶解于去离子水中形成均匀溶液，得到水相；a2.将功能单体和交联剂溶于致孔剂中，并加入引发剂，制备油相；

7、a3.将a2制备的油相加入a1制备的水相中，进行聚合反应，在聚合反应完毕后，对所得物质进行抽滤洗涤以去除未反应的残余物，最终得到聚苯乙烯微球。

8、优选的，步骤a1中，所述稳定剂包含但不限于聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇，且稳定剂的质量百分比浓度为1％-10％，所述表面活性剂包括但不限于聚氧乙烯与聚氧丙烯的共聚物和脂肪酸酯类，且所述表面活性剂质量百分比浓度为1％-5％；

9、步骤a2中，所述功能单体与交联剂的摩尔数比例为2:1-8:1，功能单体、交联剂与致孔剂的用量比例为功能单体和交联剂的总体积与致孔剂体积的体积比例1:1-1:5，所述引发剂的摩尔数为功能单体与交联剂总摩尔数的1％-10％；

10、步骤a3中，油相与水相的体积比为1:2-1:10；聚合反应温度为20℃-100℃；聚合反应时间为1-20h。

11、优选的，所述微球载体的粒径在50μm-600μm。

12、优选的，所述微球载体的粒径在100μm-500μm。

13、优选的，所述微球载体的孔径在50nm-3000nm。

14、优选的，所述微球载体的孔径为150nm-1000nm。

15、优选的，所述脂蛋白抗体包含载脂蛋白ai抗体、载脂蛋白b100抗体、载脂蛋白b48抗体的一种或多种。

16、优选的，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

17、第二方面，本技术提供一种血液中脂蛋白的聚苯乙烯基质吸附材料的制备方法，采用如下的技术方案：

18、一种血液中脂蛋白的聚苯乙烯基质吸附材料的制备方法，包括如下步骤：

19、s1、制备微球载体；

20、s2、活化微球载体；

21、s3.将金黄色葡萄球菌蛋白a或者链球菌蛋白g溶解在修饰缓冲液中得到第二混合液；

22、s4.将第一混合液和第二混合液混合后在适当温度下反应得到反应产物，反应完成后用修饰缓冲液对反应产物进行洗涤；

23、s5.将s4洗涤后的反应产物用封闭缓冲液进行封闭，封闭后用修饰缓冲液重悬，得到第一复合液；

24、s6.将脂蛋白抗体溶解在偶联缓冲液中，得到第二复合液；

25、s7.将步骤第一复合液和第二复合液混合反应，反应结束后对反应产物进行洗涤，然后再用偶联缓冲液重悬；

26、s8.将辛二酸双(n-羟基琥珀酰亚胺酯)溶解在二甲基亚砜中，然后加入到步骤s7所得到的溶液中进行反应，反应得到的产物先用洗脱缓冲液洗涤，然后再用储存缓冲液洗涤后保存在储存缓冲液中，得到产品。

27、优选的，所述微球载体为聚苯乙烯微球载体，将s2中制备的微球载体加入至修饰缓冲液中，并在修饰缓冲液中加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺或n-羟基磺基琥珀酰亚胺进行反应，反应完成后洗涤数次并用修饰缓冲液重悬得到活化后的微球载体，修饰缓冲液为10-100mm mes缓冲液，其ph为5.5-7.5，修饰缓冲液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和n-羟基琥珀酰亚胺的用量为：每100mg微球载体悬浮在5-10ml修饰缓冲液中，并与10-120mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和10-120mgn-羟基琥珀酰亚胺进行反应，反应温度20℃-30℃；修饰缓冲液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和n-羟基磺基琥珀酰亚胺的用量为：每100mg微球载体悬浮在5-10ml修饰缓冲液中，并与10-120mg 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和10-120mg n-羟基磺基琥珀酰亚胺进行反应，反应温度20℃-30℃；

28、优选的，步骤s3中，金黄色葡萄球菌蛋白a或者链球菌蛋白g的用量与配基的摩尔数比为1:1-10:1，修饰缓冲液为10-100mm mes缓冲液，其ph为5.5-7.5；

29、步骤s4中，反应温度为20℃-30℃，反应时间2-4h，修饰缓冲液为10-100mm mes缓冲液，其ph为5.5-7.5；

30、步骤s5中，封闭缓冲液为20-120mm的tris-hcl缓冲液，其ph为7.5-8.5，修饰缓冲液为10-100mm mes缓冲液，其ph为5.5-7.5；

31、步骤s6中，偶联缓冲液为浓度为50mm-100mm的磷酸盐缓冲液，ph为6.5-8.5，抗体用量为：每100ug步骤s5中得到的微球载体，偶联50-1000ug抗体；

32、步骤s7中，反应温度为20℃-30℃，反应时间为30-60min；

33、步骤s8中，辛二酸双(n-羟基琥珀酰亚胺酯)在二甲基亚砜中的浓度为1mm-5mm，辛二酸双(n-羟基琥珀酰亚胺酯)、二甲基亚砜与s7中所得产物混合后辛二酸双(n-羟基琥珀酰亚胺酯)的终浓度为100-500um，反应温度为20℃-30℃，反应时间为30-60min；洗脱缓冲液为50-150mm的甘氨酸缓冲液，ph为2.0-3.0，储存缓冲液为50mm-60mm的磷酸盐缓冲液，ph为7.0-7.5。

34、第三方面，本技术提供一种脂蛋白吸附材料的应用，采用如下的技术方案：

35、一种脂蛋白吸附材料的应用，将吸附材料用于吸附血液中不同种类的脂蛋白，所述的脂蛋白包括但不限于高密度脂蛋白、低密度脂蛋白及乳糜微粒。

36、一种脂蛋白吸附材料的应用，将吸附材料结合凝胶排阻层析法或者超速离心法结合使用，以纯化血液中的细胞外囊泡。

37、综上所述，本技术具有以下有益效果：

38、1、本发明所述的脂蛋白吸附材料，能结合包括高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白以及乳糜微粒等不同种类的脂蛋白。

39、2、本发明所述的脂蛋白吸附材料，能特异性的结合不同种类的脂蛋白，而对血液中其它组分无非特异的结合。

40、3、本发明所述的脂蛋白吸附材料，采用了定向共价偶联技术，相对于常规的偶联技术，大幅度提高了吸附材料的结合效率。

41、4、将本发明所述的脂蛋白吸附材料应用于血液细胞外囊泡纯化过程中，可大幅减少血液脂蛋白的污染，且能快速去除血液中的脂蛋白，大幅度的节省纯化时间。进而大幅度节省细胞外囊泡整体纯化时间。