一种类多酶活性的负载银纳米颗粒的银基金属有机框架纳米酶及其制备和应用

本发明属于纳米材料的合成与应用领域，具体涉及一种类多酶活性的负载银纳米颗粒的银基金属有机框架纳米酶及其制备和应用。

背景技术：

1、金属有机框架(mofs)是由有机配体和金属离子作为次级结构单元通过自组装形成的材料，是一种具有周期性网络结构的结晶多孔无机-有机杂化材料。因其突出的设计灵活性、优异的表面积和拓扑结构的多样性，在气体吸附/分离、催化、传感、色谱分离和储能等领域展现出广泛的潜在应用。目前，mofs的研究重点已经从早期的合成转向对其性能优化提升和应用场景拓展。在纳米酶研究领域，mofs因其独特的性能也展现出其他传统材料无法比拟的优势。与天然酶相比，mofs材料不仅可以为纳米酶提供更多的活性位点，赋予其优异的类酶催化活性，还具有成本低、制备简单、稳定性和耐用性高的优势。

2、目前报道的mof纳米酶大多只具有单酶模拟活性，而具有多酶模拟活性的mof材料报道较少，且其制备方法复杂，条件要求较高。与类单酶活性的纳米酶相比，类多酶活性纳米酶具有许多优异的性能，包括协同效应、级联反应以及根据不同环境中体现不同的响应活性等，使其在实践中具有更广泛的应用。基于此，本发明以2-甲基咪唑作为有机配体，以三乙胺作为去质子化试剂并提供碱性环境，以甲醇作为溶剂以及银离子的还原剂，利用去质子化的2-甲基咪唑与银离子的配位作用得到银基金属有机框架；同时在碱性条件下，巧妙利用甲醇将吸附于银基金属有机框架表面的银离子还原成银纳米颗粒，制备了一种负载银纳米颗粒的银基金属有机框架纳米酶。本发明的制备方法简便易行，合成条件温和，无需高温高压即可以在室温下直接合成，无需昂贵仪器。该纳米酶可同时展现出类氧化物酶、类过氧化物酶、类漆酶三种不同的模拟酶活性，在不同的响应场景中实现简单快速低成本的多目标比色检测，在生物分析、比色传感等领域具有十分重要的应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种具有类多酶活性的负载银纳米颗粒的银基金属有机框架(agnps@ag-mof)纳米酶，并实现不同的应用场景下的比色检测应用。本发明采用去质子化的方式提高金属有机框架上银离子与氮原子的配位键强度，并通过还原剂甲醇在碱性条件下还原银离子在银基金属有机框架上原位生成银纳米颗粒，实现agnps@ag-mof纳米酶的制备。一方面，利用2-甲基咪唑的咪唑环上具有可去质子化的氨氮，通过三乙胺与2-甲基咪唑的质子抽提反应去除氨氮上的质子使其带有负电荷，从而增强银离子与氨氮的配位能力。同时，2-甲基咪唑是一个具有π-π共轭系统的分子，改变共轭体系中的电子分布可以增强氮原子的配位能力。本发明利用较弱极性的溶剂(甲醇)，减少溶剂对氮原子周围电子的吸引作用，从而增加咪唑环上氮原子的电子密度，使得氮原子更容易与银离子进行lewis碱-lewis酸的配位作用，增强2-甲基咪唑与银离子之间的配位能力，并提高材料的类酶活性。另一方面，甲醇在碱性条件下会生成醇盐，并作为银离子的还原剂，在银基金属有机框架上将银离子原位还原，生成银纳米颗粒；银基金属有机框架上原位生成的银纳米颗粒进一步提高该材料的类酶活性。agnps@ag-mof纳米酶可以直接氧化底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)为蓝色的氧化产物oxtmb，展现类氧化物酶活性；可以在过氧化氢(h2o2)的存在下，将底物2,2’-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(abts)快速氧化为绿色产物abts·+，展现过氧化物酶活性；还可以将酚类物质2,4-二氯苯酚(2,4-dcp)催化成2,4-二氯苯醌，并与4-氨基安替比林(4-aap)形成粉红色偶联产物，展现类漆酶活性。

2、本发明提出了一种负载银纳米颗粒的银基金属有机框架纳米酶的温和制备方法，并展示了新型纳米酶的多酶活性，进一步开拓了金属有机框架材料在生物分析和比色检测等领域的应用。

3、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

4、负载银纳米颗粒的银基金属有机框架纳米酶的制备方法，包括以下步骤：

5、(1)以2-甲基咪唑为有机配体，以甲醇作为溶剂(溶剂甲醇同时也作为下一步骤中银离子的还原剂)，以三乙胺作为去质子化试剂并提供还原反应所需的碱性环境，配制去质子化的2-甲基咪唑甲醇溶液。

6、(2)配制与去质子化的2-甲基咪唑甲醇溶液相同浓度的硝酸银水溶液，再将等量的硝酸银水溶液缓慢滴入到去质子化的2-甲基咪唑甲醇溶液中，不断搅拌直至加入完全，在室温下避光反应2-24小时，得到均匀的乳白色悬浊液；随后离心，得到的固体产物分别用水和乙醇各洗涤3次，在60℃真空干燥箱中干燥24小时，得到agnps@ag-mof纳米酶。

7、负载银纳米颗粒的银基金属有机框架纳米酶的多酶活性展示：

8、(1)类氧化物酶活性：以agnps@ag-mof作为纳米酶，加入显色底物tmb，溶液由无色变为蓝色，结合紫外可见吸收光谱，展现其类氧化物酶活性。具体步骤如下：将50μlagnps@ag-mof分散液(最终浓度为25μg/ml)和50μl tmb溶液(最终浓度为0.5mm)加到1900μl乙酸-乙酸钠(hac-naac)溶液(12mm，ph 5.0)中，混合均匀，在20℃下反应20分钟，同时分别将tmb溶液、agnps@ag-mof分散液作为对照组，利用紫外可见吸收光谱仪记录波长在650nm处(氧化tmb(oxtmb)的特征峰位置)的吸光度值。通过结果发现对照组溶液均未变蓝，只有当agnps@ag-mof、tmb同时存在时溶液变为蓝色，且在650nm处出现特征吸收峰，证明了agnps@ag-mof纳米酶具有类氧化物酶活性。

9、(2)类过氧化物酶活性：以agnps@ag-mof作为纳米酶，在h2o2的存在下，加入显色底物abts，溶液由无色变为绿色，结合紫外可见吸收光谱，展现其类过氧化物酶活性。具体步骤如下：将100μl agnps@ag-mof分散液(最终浓度为20μg/ml)、50μlabts溶液(最终浓度为0.5mm)和50μl h2o2溶液(最终浓度为0.1mm)加到1800μlhac-naac溶液(10mm，ph 3.0)中，混合均匀，在37.5℃下反应40分钟，同时分别将abts溶液、h2o2溶液+abts溶液、agnps@ag-mof分散液+abts溶液、h2o2溶液+agnps@ag-mof分散液作为对照组，利用紫外可见吸收光谱仪记录波长在414nm处(abts·+的特征峰位置)的吸光度值。通过结果发现对照组溶液均未变绿，只有当agnps@ag-mof、h2o2、abts同时存在时溶液变为绿色，且在414nm处出现特征吸收峰，证明了agnps@ag-mof纳米酶具有类过氧化物酶活性。

10、(3)类漆酶活性：以agnps@ag-mof作为纳米酶，加入酚类物质2,4-dcp以及显色底物4-aap后，溶液由无色变为粉红色，结合紫外可见吸收光谱，展现其类漆酶活性。具体步骤如下：将100μlagnps@ag-mof分散液(最终浓度为250μg/ml)、200μl 2,4-dcp溶液(最终浓度为2.5mm)和200μl4-aap溶液(最终浓度为0.6mm)加到1500μl4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)溶液(20mm，ph 6.0)中，混合均匀，在40℃下反应30分钟后，离心取上清液，同时分别将2,4-dcp溶液、2,4-dcp溶液+agnps@ag-mof分散液、4-aap溶液、4-aap溶液+agnps@ag-mof分散液作为对照组，利用紫外可见吸收光谱仪记录波长在510nm处(粉红色偶联产物的特征峰位置)的吸光度值。通过结果发现对照组溶液均未变成粉红色，只有当agnps@ag-mof、2,4-dcp、4-aap同时存在时溶液变为粉红色，且在510nm处出现特征吸收峰，证明了agnps@ag-mof纳米酶具有类漆酶活性。

11、本发明的显著优点在于：

12、①相较于传统的纳米复合材料，本发明提供的负载银纳米颗粒的银基金属有机框架纳米酶制备简单、成本低廉、不需昂贵仪器、易于推广；

13、②本发明提供的负载银纳米颗粒的银基金属有机框架纳米酶可在不同条件下通过不同底物在不同使用场景中展现不同的类酶活性，使纳米酶的实际使用场景不再单一；

14、③本发明提供负载银纳米颗粒的银基金属有机框架纳米酶可结合比色检测等方法，实现其在生物分析、比色传感等领域的广泛应用。