包埋在大孔支架中的酶形成的介孔集合的制作方法
【专利说明】包埋在大孔支架中的酶形成的介孔集合
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2012年10月5日提交的美国临时申请号61/710，110和2013年2月21日提交的美国临时申请号61/767，477的优先权，两个申请的全部内容通过引用并入本申请。
[0003]关于联邦赞助研宄的声明
[0004]本发明是在东北太阳经费组织(Northeast Sun Grant Initiative)的合同中规定的政府资助下在康奈尔大学进行的，该合同号为美国运输部资助#DT0S59-07-G-00052。政府拥有本发明的部分权益。
[0005]发明背景
[0006]过氧化物酶(EC 1.11.1)在生物系统中广泛存在，并且形成了氧化还原酶子亚类，所述氧化还原酶亚类将过氧化氢(H2O2)还原成水，从而氧化多种类型的芳香化合物，范围从苯酚到芳香胺。过氧化物酶的反应循环相当复杂，起始于通过H2O2活化亚铁血红素以形成两电子活化的化合物I (N.C.Veitch, Phytochemistry, 2004，65，249)。通过氧化有机底物，化合物I的一个电子被还原，以形成比静息状态多一个电子的化合物II。第二次还原使酶恢复到其静息状态以开始新的循环。总体而言，每消耗一分子的过氧化氢，则生成两个芳香自由基，并且所述芳香自由基在次级反应中容易反应。
[0007]过氧化物酶对底物抑制高度敏感，通常由H2O2引起，所述抑制可以形成酶的可逆的无活性形式(化合物III)。产物抑制也可以阻止酶活性。因此，与过氧化物酶相关的复杂的动力学限制了它在很多方法和生物方法中的应用。增加这个家族和其他家族的酶的活性和其对不同工艺条件的耐受性可以改善其目前的用途，并且也为其在新用途中的应用创造条件。
[0008]发明简述
[0009]本申请发现，由与磁性纳米颗粒(MNP)自体组装的酶(特别是产生自由基(FRP)的酶，例如辣根过氧化物酶(HRP))所组成的生物纳米催化剂(BNC)具有增强的酶活性。具体而言，本申请发现，跟游离酶或者不含酶的磁性纳米颗粒簇相比，酶与磁性纳米颗粒的自体组装簇通常具有更快的酶周转(turnover)和更低的酶抑制。另外，本申请还发现MNP的大小和磁性影响BNC的形成，并且最终影响其结构，所有这些都对所包封的酶的活性有很大影响。特别是由于其在各种反应条件下具有令人惊讶的顺应力，本申请所述BNC可以作为改良的酶试剂或催化试剂用于当前使用其他此类试剂的情形，并且其也可进一步用于酶尚未被考虑或尚未被发现适用的其他应用。
[0010]本申请所述应用不同于传统方法，传统方法依赖于通过复杂的生物化学将蛋白质结合在表面改良的颗粒上，通常以酶的活性和反应效率为代价。通过本方法，只有当酶与MNP紧密结合时，如作为初级(primary)MNP微晶与过氧化物酶的自体组装簇(聚集)时，酶动力学才被实质性(substantially)改变。在生物相关的底物浓度下，所得的BNC的整体活性可以优选地比游离酶或MNP的活性高出若干个数量级。
[0011]在一个方面，本发明涉及在磁性纳米颗粒或其簇中包埋(即包封)了酶的组合物。在特定实施方式中，组合物是磁性纳米颗粒和一种酶或者一组酶(例如FRP酶类)的介孔的成簇集合。介孔的成簇集合具有包埋了酶的介孔。在其他实施方式中，前述成簇组合物包含磁性纳米颗粒，在其表面上包被有贵金属例如金。
[0012]在其他实施方式中，前述磁性纳米颗粒(BNC)的介孔聚集物掺入到大孔支架中，以形成具有第一级和第二级集合的分级催化剂集合。大孔支架可以构造成微米大小的磁性颗粒的集合，或者可以是并非从颗粒构建的连续支架，或者甚至是两者组合。这样得到酶功能化的高度大孔和介孔的磁性固体的组合，这样有利于固定任何具有小的扩散性底物和产物的酶。由于至少存在BNC，所以整个分级催化剂集合是磁性的。
[0013]就连续的大孔支架而言，在第一组实施方式中，BNC掺入的连续大孔支架是磁性的。由于由磁性聚合物组合物组成和/或由于其中包埋了不属于BNC的磁性颗粒(如不与酶结合的磁性纳米颗粒或微粒)，连续的大孔支架可以是磁性的。在第二组实施方式中，BNC掺入的连续支架是非磁性的；然而，由于其中至少存在掺入的BNC，所以包含非磁性支架的整个分级催化剂集合仍然是磁性的。
[0014]本发明还涉及用于生成上述包埋酶的磁性纳米颗粒的方法。在一些实施方式中，首先制备磁性纳米颗粒或其聚集物，然后在其中吸附酶。在其他实施方式中，通过在存在酶的条件下组装单分散的磁性纳米颗粒来生成包埋酶的磁性纳米颗粒组合物，由此通过自体组装机制将酶包埋在MNP的簇中。
[0015]本发明也涉及用于生成上述分级催化剂集合的方法，在所述分级催化剂集合中，磁性纳米颗粒(BNC)的介孔聚集物被掺入到连续的或颗粒状的大孔支架中。在所述方法中，BNC在溶液中与大孔支架接触，从而将BNC基本上(substantially)包埋进入大孔支架的大孔中。在连续大孔支架的特定情况中，连续的大孔支架可以通过模板法来生成，所述模板法包括(i)生产复合物(composite)，所述复合物包含在其中包埋了牺牲模板剂的支架前体材料，和(ii)选择性除去牺牲模板剂以便在连续的前体材料中产生大孔。在更具体的实施方式中，模板法包括溶剂模板化法，其中在支架前体材料中包埋的溶剂被用作模板剂。将含有包埋了溶剂的支架前体材料的复合物冷却，直到所包埋的溶剂冷冻形成溶剂晶体，然后通过蒸发或升华来除去冰冻的溶剂以生成支架前体材料中的大孔。当溶剂是水时，溶剂模板法可以被视为冰模板化法。
[0016]在其他方面，本发明涉及使用上述包埋酶的磁性纳米颗粒组合物的方法。在特定的实施方式中，包埋酶的磁性纳米颗粒组合物用于解聚木质素的方法、从水中除去芳香族污染物的方法、通过自由基机理将单体聚合生成聚合物的方法、烯烃环氧化作用的方法、苯酚的卤化反应的方法、在溶液中抑制微生物的生长和功能的方法以及将二氧化碳转化为甲醇的方法。
[0017]在其他方面，本发明涉及在包含磁性颗粒(例如任意的BNC或其分级催化剂集合)的液相化学反应中增加空间时间收率和/或总周转数量，从而促进化学反应的方法。在所述方法中，将其中包含磁性颗粒的液相化学反应置于具有选定磁性强度、在液相化学反应中的相对位置和相对运动的多个磁场中，从而在空间上限制所述磁性颗粒，其中所述多个磁场的磁性强度、相对位置和相对运动是由电流被适当地控制或调整的电磁体系统所提供。
[0018]由于包含了掺入到大孔构架中的BNC的整体分级集合具有较大的尺寸和整体磁性(mass magnetizat1n)，所以包含酶的BNC可以更加容易地被外部磁场所捕获，因此更容易从反应介质中除去。简化的移除进一步允许对催化剂更方便的重新利用。本申请所述分级组装的催化剂的另一个益处是，较大的尺寸有助于保留酶的活性。另外，当置于用于除去BNC或增强反应的磁场中时，与磁性微粒表面结合的BNC不容易发生过量聚集。
[0019]附图简述
[0020]图1A、IB:形成包含BNC的分级催化剂集合的第一级集合，所述BNC由磁性纳米颗粒的介孔聚集物与辣根过氧化物酶组成(图1A)，以及通过将BNC掺入到由冰模板化的纤维素组成的大孔支架中来形成第二级集合(图1B)。
[0021]图2A、2B:单螺旋(图2A)和双螺旋(图2B)磁性捕捉的排布，特别用于水的治理和/或芳香族化合物的自由基聚合。
[0022]图3:用于计算机可编程控制器的排布的电子线路图，所述控制器用于独立控制六个电磁体或者三电磁体的两个阵列。
[0023]图4:用于图3中所提供的电子排布的控制输入(“Ctrlnp”)组件的示例性微控制器。
[0024]图5:图片显示了 H2O2对DMP氧化速度的影响，所述氧化是在丙二酸盐缓冲液(50mM)中，pH 3.5时，由2.5nM锰过氧化物酶、不同浓度的Au_M60及其BNC所催化的。为了方便，X轴是1gltl刻度。BNC(金包被的纳米颗粒)增加了锰过氧化物酶的活性，并且降低了抑制。
[0025]图6:图片显示了 H2O2对DMP氧化速度的影响，所述氧化是在丙二酸盐缓冲液(50mM)中，pH 3.5时，由2.5nM通用过氧化物酶、不同浓度的Au_M60及其BNC所催化的。为了方便，X轴是1gltl刻度。BNC(金包被的纳米颗粒)增加了通用过氧化物酶的活性，并且降低了抑制。
[0026]图7A，7B:光谱显示了将锰过氧化物酶和通用过氧化物酶用于生物质原料(混合的草)的木质素解聚。图7A显示了水可溶性木质素单体和聚合体的稀释校正的光谱属性。图7B显示了生物质对照校正的光谱。使用25mM MnP和VeP (50mM总共的酶)和400 μ g.ml—1的Au-MNP来形成BNC。使用0.2mM H 202开始反应，并且孵育24小时。BNC增加了芳香族化合物从生物质中的释放。
[0027]图8A-8C:光谱显示了存在葡萄糖氧化酶时，将锰过氧化物酶和通用过氧化物酶用于生物质原料(混合的草)的木质素解聚。葡萄糖氧化酶在存在葡萄糖时生成过氧化氢。针对不同的过氧化物酶-氧化酶摩尔比，12小时时生物质水解液校正的光谱。使用各25nM的锰过氧化物酶和通用过氧化物酶-15 μ g.1iir1Au-MNP来形成BNC。图8A:葡萄糖氧化酶是 6.125nM(4A:比例是 4);图 8B:12.5nM(4B:比例是 2)，和图 8C:25nM(4C:比例是 I)。BNC可以容纳原位氢生成系统以增加芳香族化合物从生物质中的释放，并且使用葡萄糖作为氧化剂。
[0028]图9:图片显示了辣根过氧化物酶的BNC集合在磁铁矿微粒上模板化以形成分级大孔催化剂，用于包括苯酚的治理和芳香族化合物的化学转化等应用。
[0029]图10:图片显示了使用BNC和BMC、在苯酚和H2O2等摩尔浓度(ImM)、室温下12小时后，除去苯酚的程度。误差条是三次重复的标准偏差。BNC为形成介孔催化剂而在微粒上的模板化对BNC的活性没有害处。
[0030]图11A、11B:柱状图显示了在除去苯酚的五次循环中([苯酚]=[H2O2] = ImM ；室温下反应时间2小时；[HRP] = 30nM，[MNP] = 60ug/ml)，在每次循环之后，催化剂重新使用的表现。图1lA 是[MMP]/[MNP]/[HRP] = 20:2:1，并且图1lB 是[MMP]/[MNP]/[HRP]=160:2:1ο误差条是三次重复的标准偏差。分级结构使得催化剂可以重复使用若干次循环。
[0031]图12Α、12Β:两种不同比例BNC以及在磁铁矿微粒上模板化的辣根过氧化物酶BNC的扫描电子显微镜(SEM)图片。BNC在微粒表面上的组装是由磁性相互作用所驱动的自体组装过程。
[0032]图13:图片显示了磁性反应器的V型构造；电磁体成对设置并且以1-2的方式循环。使用电磁体(管状9.6x16.7mm、系列Ε-66-38，加利福尼亚州磁传感器系统公司(Magnetic Sensor Systems))、简单微控制器以及在微控制器和电磁体之间的接口电路来设计原型系统。电磁体装载在定制台上(custom stand)，使得其可以按照多种配置方案置于小的生物反应器的侧面，所述生物反应器由0.5cm横截面的一次性UV透明塑料小杯(micro-cuvette)组成。
[0033]图14:图片显示了磁性反应器的I型构造；电磁体成对设置并且以1-1的方式循环。粉红色表示通过使用高效的基于辣根过氧化物酶的磁性催化剂，从苯酚和氨基芘合成醌亚胺。这个反应显示了苯酚的除去，以及色素、颜料、芳香和精细化学品的合成。
[0034]图15:图片显示了使用BNC通过氧化聚合来除去苯酚。苯酚分子被氧化成可相互聚合的苯氧基。这个反应表征了芳香族化合物的治理和通过氧化偶合的聚合。
[0035]图16:图片显示了用于水处理的磁性反应器的集成。
[0036]图17:图片显示了用于将自由基的生成和聚合解偶联的磁性反应器的内核。
[0037]发明详述
[0038]在一方面，本发明涉及包含酶的组合物，所述组合物包含吸附一种或多种酶的磁性纳米颗粒的介孔聚集物，其中所述一种或多种酶可以包含或不包含产生自由基的酶(FRP) ο吸附酶的磁性纳米颗粒的集合在本申请中也称为“生物纳米催化剂”或“BNC”。本申请所用术语“吸附”旨在与术语“结合” “与……结合”或者“与……聚集”意思相同，只要附着的模式在其使用条件下或者在为后续使用而储存的条件下阻止酶从磁性纳米颗粒释放或者使这种释放基本上最小化。BNC或其贵金属包被的形式也可以吸附到(如位于)大孔支架的表面，所述大孔支架可以是下文所述的磁性微粒的集合和/或任意的连续大孔支架。
[0039]BNC包含的介孔是磁性纳米颗粒之间的间质空间。酶可以位于磁性纳米颗粒上的任意位置，例如在BNC的表面和/或包埋进入BNC的介孔中的至少一部分。本申请所用术语“磁性”包括全部种类的可用的磁性属性，包括永久磁性、超顺磁性、顺磁性、铁磁性和亚铁磁性。
[0040]磁性纳米颗粒或BNC的尺寸是纳米级，即通常不大于500nm。本申请所用术语“尺寸”可以指，当磁性纳米颗粒大约或基本上是球形时，磁性纳米颗粒的直径。当磁性纳米颗粒不是大约或基本上的球形(如基本上是卵形或不规则形)时，术语“尺寸”可以指磁性纳米颗粒的最长维度或三个维度的平均值。术语“尺寸”也可以指磁性纳米颗粒群的尺寸的平均值(即“平均尺寸”)。在不同的实施方式中，磁性纳米颗粒的尺寸精确地为、大约为、至多为或小于例如 500nm、400nm、300nm、200nm、lOOnm、50nm、40nm、30nm、25nm、20nm、15nm、10nm、5nm、4nm、3nm、2nm或lnm，或者由任意两个上述示例性尺寸所限定的范围中的尺寸。
[0041]在BNC中，可以把单独的磁性纳米颗粒认为是具有上述任意尺寸的初级纳米颗粒(即初级微晶)ANC中的纳米颗粒聚集物在尺寸上大于纳米颗粒，并且通常具有至少5nm的尺寸(即二级尺寸)。在不同的实施方式中，聚集物的尺寸精确地为、大约为、至少为、大于、至多为、或小于例如 5nm、8nm、10nm、12nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、lOOnm、150nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm 或 800nm，或者由任意两个上述示例性尺寸所限定的范围中的尺寸。
[0042]通常，初级和/或聚集的磁性纳米颗粒或其BNC具有尺寸的分布范围，即它们在尺寸上通常是分散的，或者分散较窄或者分散较宽。在不同的实施方式中，初级或聚集物尺寸的任意范围可以构成初级或聚集物尺寸的总范围的主要部分或次要部分。例如，在一些实施方式中，初级颗粒尺寸的特定范围(例如至少1、2、3、5或10nm，和至多15、20、25、30、35、40、45或50nm)或者聚集物颗粒尺寸的特定范围(例如至少5、10、15或20nm，和至多50