多步分离方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及纯化多不饱和脂肪酸（PUFA)及其衍生物的改进的色谱分离方法。特 别是，本发明涉及采用混合溶剂系统的改进的色谱分离方法。
【背景技术】
[0002] 脂肪酸（特别是PUFA)及其衍生物是生物学上重要分子的前体，它们在调节诸如 血小板聚集、炎症和免疫反应等生物学功能中起着重要作用。因此，PUFA及其衍生物可在 治疗上可用于治疗广泛的病理病症，这病理病症包括CNS病症、包括糖尿病性神经病变的 神经病变、心血管疾病、包括炎性皮肤疾病的全身免疫系统和炎症病症。
[0003] 在诸如蔬菜油和海洋油等天然进料中发现PUFA。然而，这些PUFA经常以饱和脂肪 酸和许多其他杂质的共混物存在于这些油中。因此，在营养性应用或药物性应用之前，应该 对PUFA进行所需纯化。
[0004] 不幸的是，PUFA极易被破坏。因此，当在氧存在下加热时，它们易于发生异构化反 应、过氧化反应和低聚反应。因此，难以通过PUFA产物的分离和纯化来制备纯脂肪酸。即 使在真空条件下蒸馏也可能导致不可接受的产物降解。
[0005] 色谱分离技术为本领域技术人员所众所周知。涉及固定床系统和模拟或真实的移 动床系统的色谱分离技术均为本领域技术人员所熟悉。
[0006] 在常规的固定床色谱系统中，其组分待分离的混合物渗透通过容器。该容器一般 是圆柱形的，并且通常被称为柱。该柱含有对流体表现出高渗透率的多孔材料的填料（一 般称为固定相）。混合物中各组分的渗透速度取决于该组分的物理性质，从而使得组分选 择性地依次从柱中出来。因此，一些组分趋向于牢固地固定到固定相，并且因此将缓慢地渗 出，然而其他组分趋向于薄弱地固定并更快速地从柱中出来。已经提出许多不同的固定床 色谱系统，并且这些固定床色谱系统均被用于分析目的和工业生产目的。
[0007] 模拟和真实的移动床色谱是本领域技术人员所熟悉的已知技术。操作原理涉及液 体洗脱剂相和固体吸附剂相的逆流移动。该操作允许溶剂的最小用量，从而使得该方法经 济可行。已经发现这种分离技术在不同领域中的若干应用，这些领域包括碳氢化合物、工业 化学品、油、糖和API。
[0008] 因此，模拟移动床系统由串联连接在一起的含有吸附剂的若干独立的柱组成。洗 脱剂沿第一方向通过这些柱。在系统中原料和洗脱剂的注入点和已分离组分的收集点依靠 一系列阀门而周期性地切换。整体效应将模拟含有固体吸附剂的移动床的单个柱的操作， 固体吸附剂沿洗脱剂流向的逆流方向移动。因此，如常规的固定床系统中的，模拟移动床系 统由含有洗脱剂从中通过的固体吸附剂的固定床的柱组成；但在模拟移动床系统中，该操 作达到模拟连续逆流移动床的程度。
[0009] 参照图1，示出了典型的模拟移动床色谱设备。通过考虑被分成多段（section) (更精确地说，从柱的底部到顶部被分成四个重叠的子区域Ι、Π 、ΙΙΙ和IV)的含有固定相 S的竖直的色谱柱来解释模拟或真实移动床色谱分离方法的概念。借助于泵P在底部的IE 处引入洗脱剂。在子区域II和子区域III之间的IA+B处引入待分离的组分A和B的混合 物。在子区域I和子区域II之间的SB处收集主要含有B的提取物，并且在子区域III和 子区域IV之间的SA处收集主要含有A的提余物。
[0010] 在模拟移动床系统的情况下，通过引入点和收集点相对于固体相的移动来引起固 定相S的模拟向下移动。在真实移动床系统的情况下，通过多个色谱柱相对于引入点和收 集点的移动来引起固定相S的模拟向下移动。在图1中，洗脱剂向上流动，并且混合物A+B 注入到子区域II和子区域III之间。组分将根据它们与固定相的色谱相互作用（例如在 多孔介质上的吸附）而移动。对固定相表现出较强的亲和力的组分B (运动较慢的组分） 将会较慢地被洗脱剂夹带并且将会由延迟地跟随着洗脱剂。对固定相表现出较弱的亲和力 的组分A (运动较快的组分）将会容易地被洗脱剂夹带。如果恰当地估计和控制参数的合 适设置（特别是在每个子区域中的流速），那么将在子区域III和子区域IV之间收集对固 定相展示较弱亲合性的组分A作为提余物，并且在子区域I和子区域II之间收集对固定相 展示较强亲合性的组分B作为提取物。
[0011] 因此，应当理解的是，示意性示出在图1中的常规的移动床系统仅限于二元分级。
[0012] 在下列若干专利中描述了用于模拟移动床色谱的方法和装置，这些专利包 括：US2985589、US3696107、US3706812、US3761533、FR-A-2103302、FR-A-2651148 和 FR-A-2651149,通过引用将这些专利的全文并入本文中。该主题还在Ganetsos和Barker 编辑的"Preparative and Production Scale Chromatography''，Marcel Dekker Inc, New York, 1993中得以充分论述，通过引用将其全文并入本文中。
[0013] 真实移动床系统在操作上类似于模拟移动床系统。然而，不是借助于阀门系统来 变换进料混合物和洗脱剂的注入点以及被分离的组分的收集点，而是使一系列吸附单元 (即，柱）相对于进料点和排出点进行物理移动。再者，操作达到模拟连续的逆流的移动床 的程度。
[0014] 在以下若干专利中描述了真实移动床色谱的方法和装置，这些专利包括： US6979402、US5069883和US4764276,通过引用将这些专利并入本文中。
[0015] PUFA产物的纯化特别有挑战性。因此，用于制备PUFA产物的许多合适的原料是极 其复杂的混合物，该极其复杂的混合物含有大量在色谱设备中具有非常相似的保留时间的 不同组分。因此，非常难以将某些PUFA与这些原料分离。然而，特别是对于药物应用和营 养食品应用来讲，需要高纯度的PUFA产物。因此，当需要高纯度PUFA产物时，历史上已经 使用了蒸馏。然而，如上所讨论，使用蒸馏作为用于难以处理的PUFA的分离技术具有显著 的缺点。
[0016] 已公布的国际专利申请W0-A-2011/080503,其全部内容通过引用而被并入本文， 公开了一种从进料混合物有效地且以非常高纯度的方式回收PUFA产物的SMB分离方法。 然而，已经发现，难以在不使用大体积的含水醇溶剂的情况下从进料混合物有效地移出C18 脂肪酸，特别是α-亚麻酸（ALA)和/或γ-亚麻酸（GLA)。因为许多药物和食用油的规格 需要这些脂肪酸的含量低，所以有效地除去C18脂肪酸是有利的。例如，在日本使用的某些 油规格需要小于Iwt %的ALA含量。
[0017] 于是，需要一种可以从进料混合物高效地回收PUFA产物，同时最小化所得产物中 存在的C18脂肪酸（例如ALA和/或GLA)的色谱分离方法。
【发明内容】
[0018] 现已惊奇地发现，可以通过使用混合溶剂体系由可商购的原料（诸如鱼油）有效 地纯化具有低含量的C18脂肪酸的PUFA产物（例如ALA和/或GLA)。
[0019] 因此，本发明提供了一种从进料混合物回收多不饱和脂肪酸（PUFA)产物的色谱 分离方法，包括：
[0020] (a)在第一色谱分离步骤中，使用水和第一有机溶剂的混合物作为洗脱剂来纯化 所述进料混合物，以获得中间产物；以及
[0021] (b)在第二色谱分离步骤中，使用水和第二有机溶剂的混合物作为洗脱剂来纯化 所述中间产物，以获得所述PUFA产物，
[0022] 其中，所述第二有机溶剂与所述第一有机溶剂不同，并且具有与所述第一有机溶 剂的极性指数相差介于〇. 1和2. 0之间的极性指数，
[0023] 其中，所述PUFA产物不是α -亚麻酸（ALA)，γ -亚麻酸（GLA)，亚油酸，ALA甘油 单酯、二酯或三酯，GLA甘油单酯、二酯或三酯，亚油酸甘油单酯、二酯或三酯，ALA Ci~C 4烷 基酯、GLA Ci~C 4烷基酯或者亚油酸C C 4烷基酯，或者它们的混合物。
[0024] 还提供了 一种由本发明的方法获得的PUFA产物。
[0025] 还提供了一种包含能由本发明的方法获得的PUFA产物的组合物。
【附图说明】
[0026] 图1示出用于分离二元混合物的模拟或真实的移动床方法的基本原理。
[0027] 图2示出将EPA与运动较快的杂质和运动较慢的杂质（即，极性较大的杂质和极 性较小的杂质）分开的包括两个模拟或真实的移动床方法的色谱分离步骤。
[0028] 图3示出将DHA与运动较快的杂质和运动较慢的杂质（即，极性较大的杂质和极 性较小的杂质）分开的包括两个模拟或真实的移动床方法的色谱分离步骤。
[0029] 图4示出将EPA与运动较快的杂质和运动较慢的杂质（即，极性较大的杂质和极 性较小的杂质）分开的包括两个模拟或真实的移动床方法的色谱分离步骤。
[0030] 图5示出将DHA与运动较快的杂质和运动较慢的杂质（即，极性较大的杂质和极 性较小的杂质）分开的包括两个模拟或真实的移动床方法的色谱分离步骤。
[0031] 图6示出将EPA与运动较快的杂质和运动较慢的杂质（即，极性较大的杂质和极 性较小的杂质）分开的包括两个模拟或真实的移动床方法的色谱分离步骤。
[0032] 图7示出将DHA与运动较快的杂质和运动较慢的杂质（即，极性较大的杂质和极 性较小的杂质）分开的包括两个模拟或真实的移动床方法的色谱分离步骤。
[0033] 图8示出将EPA与运动较快的杂质和运动较慢的杂质（即，极性较大的杂质和极 性较小的杂质）分开的包括两个模拟或真实的移动床方法的色谱分离步骤。
[0034] 图9示出将EPA与运动较快的杂质和运动较慢的杂质（即，极性较大的杂质和极 性较小的杂质）分开的包括两个模拟或真实的移动床方法的色谱分离步骤。
[0035] 图10示出可以执行包括两种模拟或真实的移动床方法的色谱分离步骤的三种方 式。
[0036] 图11示出将EPA与运动较快的杂质和运动较慢的杂质（即，极性较大的杂质和极 性较小的杂质）分开的色谱分离步骤。
[0037] 图12示出由使用甲醇作为第一有机溶剂的本发明的方法的第一分离步骤所产生 的中间产物的GC-FAMES迹线（trace)。
[0038] 图13示出由使用乙腈作为第二有机溶剂的本发明的方法的第二分离步骤所产生 的PUFA产物的GC-FAMES迹线。
[0039] 图14示出由使用乙腈作为第一有机溶剂的本发明的方法的第一分离步骤所产生 的中间产物的GC-FAMES迹线。
[0040] 图15示出由使用甲醇作为第二有机溶剂的本发明的方法的第二分离步骤所产生 的PUFA产物的GC-FAMES迹线。
[0041] 图16示出含有55wt% EPA乙酯的常规进料混合物的GC-FAMES迹线。
【具体实施方式】
[0042] 在本发明最一般的意义上，本发明提供了一种从进料混合物回收多不饱和脂肪酸 (PUFA)产物的色谱分离方法，包括：
[0043] (a)在第一色谱分离步骤中，使用水和第一有机溶剂的混合物作为洗脱剂来纯化 所述进料混合物，以获得中间产物；以及
[0044] (b)在第二色谱分离步骤中，使用水和第二有机溶剂的混合物作为洗脱剂来纯化 所述中间产物，以获得所述PUFA产物，
[0045] 其中，所述第二有机溶剂与所述第一有机溶剂不同，并且具有与所述第一有机溶 剂的极性指数相差介于〇. 1和2. 0之间的极性指数。
[0046] 如本文所用的，术语"PUFA产物"是指包含通常具有营养或药物重要性的一种或多 种多不饱和脂肪酸（PUFA)和/或其衍生物的产物。通常，PUFA产物是单种PUFA或其衍生 物。或者，PUFA产物是两种或更多种PUFA或其衍生物的混合物。
[0047] 术语"多不饱和脂肪酸"(PUFA)是指含有多于一个双键的脂肪酸。这种PUFA为本 领域技术人员所周知。如本文所用的，PUFA衍生物是甘油单酯、二酯或三酯，酯，磷脂，酰胺， 内酯或盐的形式的PUFA。优选甘油单酯、二酯和三酯以及酯。更优选甘油三酯和酯。进一 步更优选酯。酯通常为烷基酯，优选C 1-C 6的烷基酯，更优选C1-C 4的烷基酯。酯的实例 包括甲酯和乙酯。最优选乙酯。
[0048] 通常，PUFA产物是至少一种ω-3或〇-6PUFA或者其衍生物，优选至少一种 〇-3PUFA或者其衍生物。
[0049] 〇-3PUFA的实例包括二十碳三烯酸（ETE)、二十碳四烯酸（ETA)、二十碳五烯酸 (EPA)、二十二碳五烯酸（DPA)和二十二碳六烯酸（DHA)。优选EPA、DPA和DHA。最优选EPA 和 DHA。
[0050] co-6PUFA的实例包括二十碳二烯酸、二高-γ-亚麻酸（DGLA)、花生四烯酸（ARA)、 二十二碳二烯酸、肾上腺酸以及二十二碳五（ω-6)烯酸。优选ARA和DGLA。
[0051] 优选地，PUFA产物是EPA、DHA、它们的衍生物或它们的混合物。典型的衍生物包 括EPA和DHA的甘油单醋、二酯和三酯；以及EPA和DHA的醋，优选烷基醋，诸如C 1- C 4烷 基醋。
[0052] 更优选地，PUFA产物是EPA、DHA或它们的衍生物。典型的衍生物包括EPA和DHA 的甘油单酯、二酯和三酯；以及EPA和DHA的酯，优选烷基酯，诸如Ci~C 4烷基酯。
[0053] 更优选地，PUFA产物是二十碳五烯酸（EPA)、二十二碳六烯酸（DHA)、EPA甘油三 酯、DHA甘油三酯、EPA乙酯或者DHA乙酯。
[0054] 特别优选地，PUFA产物是EPA、DHA、EPA乙酯或DHA乙酯。
[0055] 在一个实施方式中，PUFA产物是EPA和/或EPA乙酯（EE)。
[0056] 在另一个实施方式中，PUFA产物是DHA和/或DHA乙酯（EE)。
[0057] 在又一个实施方式中，PUFA产物是EPA和DHA和/或EPA EE和DHA EE的混合物。
[0058] 在最优选的实施方式中，第二分离步骤中获得的PUFA产物是EPA或EPA衍生物， 例如EPA乙醋；并且所获得的纯度大于90wt%，优选大于95wt%，更优选大于97wt%，更加 优选大于98wt %，仍更优选大于98. 4wt %。优选地，第二步骤中获得的PUFA产物是EPA或 EPA衍生物，例如EPA乙醋，并且所获得的纯度介于98wt%和99. 5wt%之间。
[0059] 通常，除了所述PUFA产物，在本发明的色谱分离方法中收集另外的次要PUFA产 物。优选地，PUFA产物是EPA或其衍生物，并且另外的次要PUFA产物是DHA或其衍生物。
[0060] 在本发明的进一步的实施方式中，该方法配置为收集PUFA产物，该PUFA产物是 EPA和DHA或它们的衍生物的浓缩混合物。因此，使用含有EPA、DHA、比EPA和DHA极性更 大的组分以及比EPA和DHA极性更小的组分的进料混合物。
[0061] 通常，PUFA产物含有小于lwt%的α -亚麻酸（ALA)、ALA甘油单酯、二酯和三酯以 及ALA C1-C4烷基酯杂质。更通常，PUFA产物含有小于Iwt %的杂质，该杂质是ALA及其 衍生物。典型的ALA衍生物是如上面关于PUFA衍生物所定义的。
[0062] 通常，PUFA产物含有小于lwt%的γ-亚麻酸（GLA)，GLA甘油单酯、二酯和三酯以 及GLA C1-C4烷基酯杂质。更通常，PUFA产物含有小于Iwt%的杂质，该杂质是GLA及其 衍生物。典型的GLA衍生物如上文关于PUFA衍生物所定义的。
[0063] 通常，PUFA产物含有小于lwt%的C18脂肪酸杂质，C18脂肪酸甘油单酯、二酯和 三酯杂质以及C18脂肪酸烷基酯杂质。更通常，PUFA产物含有小于Iwt %的杂质，该杂质是 C18脂肪酸及其衍生物。典型的C18脂肪酸衍生物是如上文关于PUFA衍生物所定义的。如 本文所使用的，C18脂肪酸是具有直烃链或支烃链的C18脂肪族单羧酸。典型的C18脂肪 酸包括：硬脂酸（C18:0)，油酸（C18:ln9)、异油酸（C18:ln7)、亚油酸（C18:2n6)、γ-亚麻 酸/GLA(C18:3n6)、α-亚麻酸/ALA(C18:3n3)和十八碳四烯酸/SDA(C18:4n3)。
[0064] 为了避免疑惑，在这些实施方式中，所有指定杂质的最大量为Iwt%。
[0065] 如上所述，PUFA产物中上述杂质的量通常小于lwt%。优选地，上述杂质的量小 于0. 5wt %，更优选小于0. 25wt %，更加优选小于0.1 wt %，仍更优选小于0. 05wt %，仍更 优选小于〇. Olwt %，仍更优选小于0.0 Olwt %，仍更优选小于0.0 OOlwt %，仍更优选小于 0.0 OOOlwt%。
[0066] 在某些优选的实施方式中，PUFA产物基本上不含有上述杂质。
[0067] PUFA产物不是ALA，GLA，亚油酸，ALA甘油单酯、二酯或三酯，GLA甘油单酯、二酯 或三酯，亚油酸甘油单酯、二酯或三酯，ALA C1-C 4烷基酯，GLA C1-C4烷基酯或者亚油酸 (^~C 4烷基酯，或者它们的混合物。通常，PUFA产物不是ALA、GLA、亚油酸，或者它们的衍 生物或混合物。典型的ALA、GLA和亚油酸衍生物是如上文关于PUFA衍生物所定义的。
[0068] 通常，PUFA产物不是C18PUFA，C18PUFA甘油单酯、二酯或三酯，或者C18PUFA烷基 酯。因而，本发明提供了一种从进料混合物回收多不饱和脂肪酸（PUFA)产物的色谱分离方 法，包括：
[0069] (a)在第一色谱分离步骤中，使用水和第一有机溶剂的混合物作为洗脱剂来纯化 所述进料混合物，以获得中间产物；以及
[0070] (b)在第二色谱分离步骤中，使用水和第二有机溶剂的混合物作为洗脱剂来纯化 所述中间产物，以获得所述PUFA产物，
[0071] 其中，所述第二有机溶剂与所述第一有机溶剂不同，并且具有与所述第一有机溶 剂的极性指数相差介于〇. 1和2. 0之间的极性指数，
[0072] 其中，所述PUFA产物不是C18PUFA，C18PUFA甘油单酯、二酯或三酯，或者C18PUFA 烷基醋。
[0073] 更通常，PUFA产物不是C18PUFA或C18PUFA衍生物。典型的C18PUFA包括亚油酸 (C18:2n6)、GLA (C18:3n6)和 ALA (C18:3n3)。
[0074] 适用于通过本发明的方法分离的进料混合物可以由天然来源和合成来源获得，该 天然来源包括植物油和动物油和脂肪，该合成来源包括从经基因修饰的植物、动物和包括 酵母的微生物获得的油。实例包括鱼油、藻油和微藻油以及植物油，例如琉璃苣油，蓝蓟油 和月见草油。在一个实施方式中，进料混合物是鱼油。在另一个实施方式中，进料混合物是 藻油。当期望的PUFA产物是EPA和/或DHA时，藻油特别合适。当期望的PUFA产物是EPA 时，经基因修饰的酵母特别合适。
[0075] 在特别优选的实施方式中，进料混合物是鱼油或鱼油衍生的原料。已经有利地发 现，当使用鱼油或鱼油衍生的原料时，通过本发明的方法能够以大于90%的纯度，优选为大 于95 %的纯度，更优选为大于97 %的纯度，甚至更优选为大于98 %的纯度，更加优选为大 于98. 4%的纯度，例如介于98 %和99. 5 %之间的纯度生产EPA或EPA乙酯PUFA产物。
[0076] 在