光技术和微流控芯片技术，而是通过液体密封设计、沟道设计，把检测所需所有化学组分集成、内置到微流控芯片中，并以磁铁主动驱动，实现一键式的磁微粒化学发光免疫检测，从而在便携配套仪器中实现全血中分析物的快速、高灵敏度、准确定量检测。
[0063]本发明的主要优点如下:
[0064]1)本发明采用直接化学发光方法，具有背景低、灵敏度高、线性范围宽的优点。
[0065]2)本发明采用磁颗粒技术，具有磁富集功能，增强并放大信号；并能利用磁铁把磁颗粒转移区域(如由包被区-清洗区-检测区)，减少样本基质的影响。
[0066]3)本发明采用微流控芯片技术，把样本混合、反应、分离和检测集成在芯片上，并把反应所需的所有试剂组分集成到芯片上。
[0067]4)本发明操作简便，检测时，只需加入样本，盖上盖子，把芯片放入小型便携配套仪器中即可。
[0068]5)本发明配套仪器是小型便携仪器，仪器只与芯片发生物理接触，芯片内液体不与仪器接触，不会污染仪器而产生交叉干扰。
【附图说明】
[0069]图1为顶部磁铁操控的微流控芯片双层结构示意图，其中1为顶板，2为底板，3为气栗，4为加样口，5为标记配体存储池，6为过滤区，7为磁颗粒包被区，8为检测区，9为清洗液存储池，10为发光基底液存储池，11为盖子，12为样本填充区，13为样本混合区，14为清洗区，15为废液池，16为液体释放通道，17为发光基底液和清洗液存储池让位孔(于顶板)，18为磁铁滑轨让位孔。
[0070]图2为顶部磁铁操控的微流控芯片的完整微流控芯片的结构示意图，其中1为顶板，2为底板，19为双面胶带，20为单面胶带，21为发光基底液和清洗液存储池让位孔(于双面胶带)，22为混合液流入过滤区时的让位孔。
[0071]图3为自带气栗的微流控芯片顶板结构示意图，其中23为密封膜。
[0072]图4为双发光基底液的微流控芯片底板结构示意图，其中24为发光基底液存储池A，25为发光基底液存储池B，26为发光液预混合通道。
[0073]图5为底部磁铁操控的微流控芯片双层结构示意图，其中1为顶板，2为底板，3为气栗，4为加样口，5为标记配体存储池，6为过滤区，7为磁颗粒包被区，8为检测区，9为清洗液存储池，10为发光基底液存储池，11为盖子，12为样本填充区，13为样本混合区，14为清洗区，15为废液池，16为液体释放通道，27为磁铁滑轨槽。
[0074]图6为底部磁铁操控的微流控芯片的完整微流控芯片的结构示意图，其中1为顶板，2为底板，19为双面胶带，20为单面胶带，22为混合液流入过滤区时的让位孔，28为磁铁滑轨让位孔，29为发光基底液和清洗液存储池让位孔(于单面胶带)。
【具体实施方式】
[0075]本发明公开了一种磁微粒化学发光双层微流控芯片，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0076]为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0077]实施例1:双抗体夹心测定超敏肌钙蛋白I(cTnl)
[0078](一 )抗体标记
[0079]取5 μ g HRP溶解于lmL蒸馏水中，再加入0.2mL0.1M新配Na104溶液，室温避光反应20min后，以ImM pH4.4醋酸钠缓冲液透析纯化溶液。再以0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液调节pH至9.0，加入10 μ g抗cTnl单抗，室温避光反应2h。加0.lmL新配的4mg/mL NaBH4液，混匀，于4°C反应2h。将上述溶液装入透析袋，以0.15M pH7.4 PBS透析，4°C过夜，得到HRP标记cTnl抗体。
[0080]向lml 10mM pH7.4磷酸缓冲液中加入lmg磁颗粒(尺寸为2 μ m)、10 μ g EDC和15 μ g NHS溶液和15 μ g抗cTnl单抗(与HRP标记的抗体不同)溶液，混合均匀并于室温下反应4h，加入lmg甘氨酸封闭。以磁铁富集，去除未反应的抗cTnl单抗，得到磁颗粒标记cTnl抗体。
[0081](二)微流控芯片组装
[0082]HRP标记cTnl抗体溶液中含0.1 %牛血清白蛋白、0.1 %吐温20和0.01 %Proclin300的pH7.4磷酸缓冲液；磁颗粒标记cTnl抗体溶液为包含0.5%牛血清白蛋白、0.1%酪蛋白、0.2%吐温20和0.01% Proclin300的pH7.4磷酸缓冲液。
[0083]清洗液为包含0.2% BSA、0.5%吐温20和0.01% Proclin300的ρΗ7.4磷酸缓冲液。发光基底液分Α液和B液，A液为含鲁米诺的酸性溶液，B液为含苯衍生物的碱性溶液。
[0084]将HRP标记抗体溶液放入顶板酶标配体存储池(5)中，密封。将磁颗粒标记抗体溶液放入底板包被区(7)中，室温干燥。将清洗液注入清洗液存储池(9)中，将发光基底液的A液和B液分别注入发光基底液存储池A (24)和发光基底液存储池B (25)，密封。按图1所示，将滤血膜粘入底板过滤区中，将存储池内置入底板。然后按图2所示，以单面胶带和双面胶带，将顶板和底板组装成微流控芯片。装入铝箔袋中，密封4°保存。
[0085](三)样本检测
[0086]用正常人血楽作稀释液，将cTnl标准品稀释成如下浓度:0pg/ml、5pg/ml、50pg/ml、500pg/ml、lng/ml、10ng/ml 和 50ng/mlo
[0087]将50 μ 1样本滴入加样口后，盖上盖子。将微流控芯片放入配套仪器(磁铁磁感应强度为6000高斯)中，仪器挤出HRP标记单抗，并使样本和HRP标记单抗混合均匀后注入底板过滤区。样本过滤后，到达微通道，并溶解磁颗粒标记单抗，磁铁加速样本反应，形成HRP标记单抗-cTnl抗原-磁颗粒标记单抗的三明治结构，然后磁铁收集磁颗粒。存储池释放清洗液，将磁颗粒清洗后，发光基底液释放，仪器检测系统检测发光信号强度。总检测时间15min。每个样本分别用3个微流控芯片测定3次，取平均值，绘制标准曲线。
[0088]将50 μ 1全血样本滴入加样口，15分钟内仪器检测系统检测发光信号强度，依据标准曲线获得样本中cTnl浓度。
[0089]检测原理为:当全血加入微流控芯片后，全血先与HRP标记抗体混合，然后经过滤区后，混合了 HRP标记抗体的血浆到达微通道，血浆溶解磁标记抗体。当血样中含有cTnl，则形成HRP标记抗体-cTnl-磁颗粒标记抗体的三明治结构(双抗体夹心法)。经清洗后，再发光基底液作用下发光，仪器检测系统测试发光信号。依据配套仪器获取的标准曲线，进而分析血样中cTnl浓度。样本中cTnl含量越高，则发光信号越强。
[0090]结果表明，其最低检测限为10pg/ml，最低定量限为50pg/ml，在定量检测范围内，相关系数R2> 0.99，未出现Η00Κ效应，且批内与批间重复性均较好，可为心梗心衰疾病诊断提供参考。
[0091]实施例2:竞争法测定他克莫司血药浓度
[0092](一 )抗体/抗原标记
[0093]称取ALP 0.lmg溶于0.lml 12.5%戊二醛的ρΗ6.8 0.1Μ PBS溶液中，室温过夜。反应后的酶溶液经SephadexG-25层析柱，用生理盐水洗脱，收集棕色液。搅拌下将22.5 μ g抗他克莫司抗体逐滴加入酶溶液中，反应3h。加0.2M赖氨酸封闭，混匀后，置室温2h。在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸钱，置4°C lh。3000rpm/min离心30min，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于0.15M PH7.4 PBS中。将上述溶液装入透析袋中，对0.15M pH7.4 PBS缓冲液透析，去除铵离子后，10000rpm/min离心除沉淀，上清液即为ALP标记抗他克莫司抗体。
[0094]向lml 10mM pH7.4磷酸缓冲液中加入lmg磁颗粒(尺寸为0.5 μπι)、10 μ g EDC和15 μ g NHS溶液和20 μ g链霉亲和素，混合均匀并于室温下反应4h，加入lmg甘氨酸封闭。以磁铁吸附富集，去除未反应的链霉亲和素，得到磁颗粒标记链霉亲和素。
[0095]将10 μ g他克莫司抗原加入5 μ L 0.25mg/mL Sulfo-NHS-LC-b1tin溶液中，反应lh。以超滤离心管纯化，去除未反应的生物素。得到生物素化的抗原。
[0096]通过亲和素-生物素间的相互作用，把抗原连接到磁颗粒表面。其中亲和素标记的磁颗粒和生物素化的抗体比例为1: 104。
[0097]( 二 )微流控芯片组装
[0098]ALP标记抗他克莫司抗体溶液中含0.1%牛血清白蛋白、吐温20和Proclin300的pH7.4 Tris-HCl缓冲液；磁颗粒标记配体溶液包含0.5%牛血清白蛋白、0.2%酪蛋白、0.1%吐温 20 和 0.02% Proclin300 的 pH7.4 Tris-HCl 缓冲液。
[0099]清洗液为包含0.2%BSA、0.5% 吐温 20、0.5% 曲拉通 Χ-100