一种仿生纳微结构的制备方法及仿生纳微结构在DNA合成中的应用与流程

本发明涉及材料与生物学领域，具体涉及一种仿生纳微结构的制备方法及仿生纳微结构在dna合成中的应用。

背景技术：

1、1987年s. john等发现具有不同介电常数的材料，其空间周期性排列的结构可以产生光子禁带带隙，从而控制光的行为，他们提出了光子晶体的概念。利用光子晶体或由光子晶体衍生出的反蛋白石结构可以调控光的传播，从而实现对光响应的化学反应的控制。

2、反蛋白石的三维孔隙结构为折光指数周期性变化的结构，其周期尺度与光波长匹配，光在折光指数周期变化的反蛋白石结构膜体系中传播，发生 bragg 衍射，形成对特定波长的选择性反射和其它波长的透射，利用这种结构可以用于生物检测及催化剂的制备（cn 101339135b，cn 112062157a）。

3、dna的合成方法经历了三代的变化：

4、第一代合成法是柱式合成法，包括磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、亚磷酸酰胺法及固相亚磷酸酰胺法，这类方法以填充了多孔玻璃或聚苯乙烯筛板的合成柱作为固相载体，每个dna在单独的合成柱中合成，产量较高，一般为nmol量级，但合成中消耗的试剂量多、成本也高，合成通量有限。

5、第二代合成法是芯片合成法，芯片作为dna合成的固相载体，以高密度、集成方式在其表面特定位点上进行合成反应，节省试剂的同时实现dna的高通量合成。芯片dna合成技术以亚磷酸酰胺合成法四步循环反应为基础，因为采用不同的“脱保护”定点控制方法，分别发展出了光化学、电化学、微流控和喷墨打印等dna合成方法。其中光化学合成法的特点是具有较高的选择性和可控性，但受限于光敏脱保护单体的高成本和合成长度短的问题已经局限在极少量应用场景中；电化学合成法可以实现局部高精度的dna合成‌，但由于这种方法需要在特定的电极表面进行且合成错误率高而逐渐被淘汰。基于微流控的合成方法实现了dna合成的自动化和高效化，但需要引入微泵微阀等使得其合成装置结构相对复杂、操作麻烦、效率降低，也未成为主流方式。喷墨打印dna合成法的通量高，合成成本低，合成长度更长，逐渐成为目前主流的高通量寡核苷酸合成方式。但单独使用喷墨打印法，所选材料受粘度、表面张力等制约，因此该方法的应用范围受到限制。

6、综上所述，为解决以上现有技术中制备方式存在的问题，同时实现在基材表面构建互不干扰的反应仓，本发明提供了一种仿生纳微结构的制备方法及仿生纳微结构在dna合成中的应用，该方法首先在基材的角锥形凹陷中制备反蛋白石结构，再向角锥形凹陷内依次刮涂通用型固相载体（dmt保护的亚磷酸酰胺固体粉末和不溶性的高分子，不溶性高分子选自硅胶、交联的聚苯乙烯或多孔玻璃珠中的一种）、脱保护剂、atcg碱基单体、活化剂、盖帽剂、氧化剂，简单高效的实现高通量的dna合成。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供了一种仿生纳微结构的制备方法及仿生纳微结构在dna合成中的应用，通过在基材表面构建角锥形凹陷的阵列，再在凹陷内制备仿生纳微结构，刮涂dna合成所需的通用型固相载体、脱保护剂、atcg碱基单体、活化剂、盖帽剂、氧化剂，结合特征波长的光的辅助，简单高效地合成dna。

2、为实现上述目的，本发明是通过下列技术方案实现的：

3、一种仿生纳微结构的制备方法，仿生纳微结构包括下述制备步骤：

4、1） 基材及表面角锥形微结构

5、通过光刻技术在基材表面构建角锥形凹陷的阵列；

6、2）制备反蛋白石仿生纳微结构

7、在凹陷内制备仿生纳微结构。

8、作为本方案的进一步改进，所述的仿生纳微结构为反蛋白石结构，其制备过程为：首先在清洗后的基材表面刮涂可形成蛋白石结构的涂料，然后经涂层固化、溶解蛋白石结构、烧结后形成较高孔隙率的反蛋白石纳微结构。

9、作为本方案的进一步改进，

10、所述的基材为硅基材、二氧化硅基材、石英基材或玻璃基材中的任意一种；

11、所述基材表面的阵列由上边长为5-1000μm、边缘凹陷厚度1-20μm、底边长1-500μm、高度0.05-50μm的角锥形凹陷排列组成，

12、其中，角锥的角度范围0.5-90度，凹陷底部有微孔，孔径为1-100μm；

13、所述清洗是用乙醇-丙酮-异丙醇依次超声清洗基材。

14、作为本方案的进一步改进，所述的涂料由有机或无机微球、支撑材料及溶剂组成。

15、作为本方案的进一步改进，所述的有机微球组成为聚苯乙烯、苯乙烯-丙烯酸共聚物、苯乙烯-丙烯酸甲酯共聚物、苯乙烯-丙烯酸丁酯共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸甲酯共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸丁酯共聚物、苯乙烯-丙烯酸-丙烯酸甲酯共聚物、苯乙烯-丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯共聚物、苯乙烯-丙烯酸-丙烯酸丁酯共聚物、苯乙烯-丙烯酸-甲基丙烯酸丁酯共聚物中的任意一种；

16、无机微球组成选自二氧化硅、二氧化钛中的任意一种。

17、作为本方案的进一步改进，所述的支撑材料选自无定形碳、酚醛树脂、环氧树脂、聚苯乙烯、聚氨酯、环氧-丙烯酸树脂、聚氨酯丙烯酸树脂、酚醛环氧丙烯酸树脂中的任意一种或多种；

18、所述的有机或无机微球与支撑材料在涂层中的质量组成比例为1:5-5:1。

19、作为本方案的进一步改进，所述的涂料用溶剂选自水、乙醇、乙酸乙酯、6-己内酯、乙酸丁酯、乙二醇甲醚、乙二醇丁醚、乙二醇苯基醚、丙二醇甲醚醋酸酯中的任意一种或多种；

20、所述基材表面涂层的固化为热固化，加热温度为80-150℃，固化时间5-15min；溶解为用甲苯或浓硫酸溶解有机或无机微球；

21、涂层烧结温度为100-250℃，烧结时间10-20min。

22、作为本方案的进一步改进，所述的反蛋白石结构的直径范围为500-1000nm。

23、一种仿生纳微结构在dna合成中的应用，该仿生纳微结构由仿生纳微结构的制备方法制得；

24、dna合成，包括下述步骤：

25、（1）在反蛋白石结构内刮涂填充通用型固相载体，填充完毕后120-200℃烧结，烧结时间5-10min；

26、（2）冷却至室温后向反蛋白石结构内依次刮涂填充脱保护剂、atcg碱基单体、活化剂、盖帽剂、氧化剂合成dna，每次反应辅助光的特征波长为350-2000nm（与反蛋白石结构匹配），反应后需要冲洗。

27、作为本方案的进一步改进，

28、所述的脱保护剂为三氯乙酸-二氯甲烷溶液，溶液组成为5-15wt%的三氯乙酸及余量的二氯甲烷；

29、所述的活化剂为5-乙巯基四氮唑-乙腈溶液，溶液组成为5-15wt%的5-乙巯基四氮唑及余量的乙腈；

30、所述的盖帽剂为醋酸酐-四氢呋喃溶液和n-甲基咪唑-四氢呋喃溶液，溶液组成为10-25wt%的醋酸酐、5-10wt%的n-甲基咪唑及余量的四氢呋喃；

31、所述的氧化剂为碘-吡啶-四氢呋喃-水的溶液，氧化剂溶液中碘含量为5-10wt%，吡啶10-15wt%，四氢呋喃40-60wt%及余量的水。

32、作为本方案的进一步改进，所述dna合成的具体反应步骤为：

33、1） 在反蛋白石结构内刮涂填充通用型固相载体，填充完毕烧结；

34、2） 基材冷却至室温后，刮涂脱保护剂溶液，充分反应后用大量乙腈冲洗，将未反应的反应物除去；

35、3） 依次刮涂含1-20wt% atcg碱基单体的乙腈溶液和活化剂溶液，充分反应后用大量乙腈冲洗，将未反应的反应物除去；

36、4） 刮涂盖帽剂溶液，充分反应后用大量乙腈冲洗，将未反应的反应物除去；

37、5）刮涂氧化剂溶液，充分反应后用大量乙腈冲洗，将未反应的反应物除去。

38、作为本方案的进一步改进，每步反应辅助光的特征波长为350-2000nm，优选地，辅助光的特征波长为350-600nm，600-1500nm或者1500-1800nm。

39、本发明的一种仿生纳微结构的制备方法及仿生纳微结构在dna合成中的应用，具备下述有益效果：

40、（1）本发明首次采用反蛋白石仿生纳微结构和喷涂方法结合合成dna。

41、（2）本发明在基材表面设计了特殊的角锥形凹陷结构阵列。

42、（3）本发明利用了特定波长的光在反蛋白石结构中具有光子禁带的特点。

43、（4）本发明中：由于反蛋白石结构具有选择性反射特定波长和透射其它波长的作用，上述各步反应在特定波长的光辅助下，可以有效提高dna的合成速度。

44、（5）本发明的方法具有低成本、简单高效及高通量的特点。

45、（6）本发明的仿生纳微结构可进一步推广应用到其它需要纳微结构的生物合成领域。