一种制备微弧氧化涂层的方法

1.本发明属于表面改性技术领域，具体涉及一种制备微弧氧化涂层的方法。


背景技术：

2.在目前的临床实践中，骨和牙齿植入后仍然面临无菌性松动和感染性骨缺损两大挑战。导致无菌性松动的关键因素是在植入物和骨组织之间的界面处形成纤维囊而不是新生骨。研究表明22％的骨科植入物翻修手术失败是由于植入物感染造成的。因此，制备具有抗菌性和高促成骨性能的多功能骨再生材料用于骨缺损修复可能是最有前途的策略之一。
3.钛(ti)及其合金因其优异的机械强度和良好的生物相容性而被广泛应用于骨科植入物的制备中。然而，医用钛基植入体的一个主要问题是其生物惰性，这大大降低了植入体的临床预期性能。为了解决这一问题，研究者们采用了各种表面改性策略，例如喷砂酸蚀、等离子喷涂和微弧氧化(mao)。mao是一种电化学表面处理技术，通过等离子体放电在金属(如钛、铝、镁和钒)表面原位生长一层陶瓷膜。该过程可以在植入体表面产生大量的微米级火山孔结构，以促进骨组织再生。
4.此外，银、钙和磷酸盐等生物活性元素可以从电解质中同步掺入到涂层中，以实现预期的生物功能。据报道，mao涂层表面沉积的纳米银颗粒(agnps)能够显著促进植入物的抗菌作用。已有研究采用两步或三步mao法制备分级双孔结构涂层，能有效促进骨的整合却缺乏其长期有效的抗菌性能，为了提高其抗菌性能，大量研究者在植入体表面构建了一层聚多巴胺(pda)的载药平台，以实现对agnps的更多负载和缓慢释放。然而，要同时实现钛植入体的抗菌和促成骨性能，往往需要进行多步表面改性，繁琐且不高效。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种制备微弧氧化涂层的方法，使用一步微弧氧化即可制成具有抑菌和促成骨的多功能钛微弧氧化涂层。
6.根据本发明的一个方面，提出了一种制备微弧氧化涂层的方法，包括以下步骤：
7.将钛样品置于钙磷钠银系电解液中，经微弧氧化制得双层多孔分级的微弧氧化涂层；所述钙磷钠银系电解液包括六偏磷酸钠((napo3)6)、硝酸银(agno3)、乙酸钙(ca(ch3coo)2·
h2o)、磷酸二氢钙(ca(h2po4)2·
h2o)。
8.根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：
9.本发明采用一步微弧氧化法制备了一种双层多孔分级涂层，操作步骤简单易行；电解液中含有硝酸银，在微弧氧化过程中，可以将银离子氧化形成纳米银颗粒，这将赋予钛基植入体在植入初期起到长期的抑菌作用，而且电解液中引入的钙、磷、钠元素还能提高植入体表面的生物活性，进而加快骨的内生长和矿化成熟。根据本发明方法制备的微弧氧化涂层，在治疗感染性骨缺损和骨整形外科中具有广泛的应用前景。
10.在本发明的一些实施方式中，所述钛样品包括纯钛或钛合金中的任一种。
11.在本发明的一些优选的实施方式中，所述钛样品包括ta1、ta2、ta3、ta4或tc4钛合金中的任一种。
12.在本发明的一些实施方式中，需对所述钛样品表面进行打磨、清洗后再置于所述钙磷钠银系电解液中。
13.在本发明的一些实施方式中，所述的打磨过程，具体包括：依次用600目、800目、1000目和2000目的碳化硅砂纸进行打磨抛光。
14.在本发明的一些实施方式中，所述的清洗，具体包括以下步骤：依次用丙酮、酒精和蒸馏水对打磨好的所述钛样品超声清洗8～10min。
15.在本发明的一些优选的实施方式中，所述的清洗，具体包括以下步骤：对打磨好的所述钛样品依次用丙酮、酒精和蒸馏水超声清洗10min。
16.在本发明的一些实施方式中，所述六偏磷酸钠的浓度为8～10g/l。
17.在本发明的一些优选的实施方式中，所述六偏磷酸钠的浓度为10g/l。
18.在本发明的一些实施方式中，所述硝酸银的浓度为1～1.5g/l。
19.在本发明的一些优选的实施方式中，所述硝酸银的浓度为1g/l。
20.所述硝酸银中的银离子在微弧氧化过程中会被氧化成银原子，进而形成纳米银颗粒，将含有这种微弧氧化涂层的钛基植入体植入所需部位后，银原子被氧气缓慢氧化，释放出游离的银离子，这些银离子通过与细菌壁上的巯基结合，阻断细菌的呼吸链，最终杀死附着在钛基植入体表面的细菌。
21.在本发明的一些实施方式中，所述乙酸钙的浓度为6.5～8.5g/l。
22.在本发明的一些优选的实施方式中，所述乙酸钙的浓度为8.5g/l。
23.在本发明的一些实施方式中，所述磷酸二氢钙的浓度为6.5～7.5g/l。
24.在本发明的一些优选的实施方式中，所述磷酸二氢钙的浓度为6.5g/l。
25.在本发明的一些实施方式中，进行所述微弧氧化时，所述钙磷钠银系电解液保持搅拌状态。
26.在本发明的一些实施方式中，进行所述微弧氧化时，所述钙磷钠银系电解液的温度为40℃以下。
27.在本发明的一些实施方式中，所述微弧氧化以所述钛样品作为阳极，电解槽作为阴极；所述电解槽的材料包括不锈钢、碳钢或镍中的任一种。
28.在本发明的一些实施方式中，所述微弧氧化的电源设置为恒压模式。
29.在本发明的一些实施方式中，所述微弧氧化的条件为：正向电压为350～400v，频率为450～500hz，占空比为10～15％。
30.在本发明的一些优选的实施方式中，所述微弧氧化的条件为：正向电压为400v，频率为500hz，占空比为10％。
31.在本发明的一些实施方式中，所述微弧氧化的时间为10～15min。
32.在本发明的一些优选的实施方式中，所述微弧氧化的时间为10min。
33.在微弧氧化过程中，电解液中的o
2-和po
43-在电场的作用下进行定向运动，并在钛样品表面的tio2氧化层及形成的放电通道内进行持续沉积。而ca
2+
和ag
+
在持续的电解液搅拌下，可以通过扩散和电泳沉积在生长的tio2氧化层上，与po
43-反应并形成外层的类磷灰石层；外层类磷灰石层的无序微米级孔的形成是由于在350～400v的电压下，等离子体放电
对涂层的破坏和剥落。随着时间的增加，微弧氧化涂层不断生长，最终形成本发明的双层多孔分级涂层。此外，在微弧氧化过程中，频率应保持在450～500hz，一个合适的频率有助于构建明显的双层多孔分级涂层。频率过低，使得放电时间过长，能量过高，易破坏外层的形成且内层孔径增大；相反频率过高，使得放电时间过短，能量过低，外层孔与内层孔的孔径都较小，不利于双层多孔分级涂层的构建。
34.在本发明的一些实施方式中，在所述双层多孔分级的微弧氧化涂层中，外层的孔较大，且分布不均，外层孔的孔径为5～10μm；内层的孔呈现“火山孔”形貌，内层孔的孔径为200～1000nm。
35.在本发明的一些优选的实施方式中，在所述双层多孔分级结构中，所述外层孔的孔径约为10μm，内层孔的孔径约为400nm。
36.在本发明的一些实施方式中，在制得所述双层多孔分级的微弧氧化涂层后，需对所述微弧氧化涂层进行清洗和干燥，具体包括以下步骤：采用蒸馏水冲洗所述微弧氧化涂层，并于电热鼓风干燥箱中进行干燥处理。
附图说明
37.下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
38.图1为本发明实施例1制备的微弧氧化涂层的扫描电镜图；右为左的局部放大图；左的标尺为50μm，右的标尺为5μm；
39.图2为本发明实施例1制备的微弧氧化涂层的能谱分析(eds)图；标尺为5μm；
40.图3为本发明实施例1制备的微弧氧化涂层的的双层多孔分级结构示意图；
41.图4为本发明试验例中mti/ag/cap样品在sbf溶液中浸泡336h(14天)的体外银离子释放曲线图；
42.图5为本发明试验例中cp-ti和mti/ag/cap样品对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果曲线图；其中，e代表大肠杆菌，s代表金黄色葡萄球菌；
43.图6为本发明试验例中cp-ti和mti/ag/cap样品对骨肉瘤细胞增殖的影响结果图；
44.图7为本发明试验例中对cp-ti和mti/ag/cap样品表面ecm的茜素红染色图和对矿化的定量结果图；上为茜素红染色图，标尺为100μm，下为定量结果图；
45.图8为本发明试验例中术后8周对植入体和周围新生骨组织的三维重建图像和新生骨组织的骨矿化密度(bmd)和骨体积分数(bv/tv)的定量结果图；其中，三维重建图像中的标尺为500μm。
具体实施方式
46.下面详细描述本发明的实施例，通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
47.本发明的描述中，除非另有明确的限定，打磨、孵育等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本发明中的具体含义。
48.本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”等的描述意指结合该实施例描述的具体特征、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例。而且，描述的具体特征、材料或者特点
可以在任何的一个或多个实施例中以合适的方式结合。
49.实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
50.实施例1
51.本实施例制备了一种微弧氧化涂层，具体过程为：
52.钛样品选用10mm
×
10mm
×
2mm的工业纯钛(ta2)，并进行如下处理：
53.(1)依次用600目、800目、1000目和2000目的碳化硅砂纸对钛样品进行打磨抛光，然后依次用丙酮、酒精和蒸馏水对打磨好的钛样品超声清洗10min，去除表面杂质；
54.(2)将清洗后的钛样品作为阳极，并置于钙磷钠银系电解液(包括10g/l的六偏磷酸钠，1g/l的硝酸银，8.5g/l的乙酸钙，6.5g/l的磷酸二氢钙和蒸馏水)中，电源设置为恒压模式，在正向电压为400v，频率为500hz，占空比为10％的条件下进行微弧氧化，氧化全程进行搅拌且电解液温度保持在40℃以下，微弧氧化的时间为10min，微弧氧化结束后即制得双层多孔分级的微弧氧化涂层；
55.(3)用蒸馏水冲洗微弧氧化涂层，并于电热鼓风干燥箱中进行干燥处理，此时即制成表面覆有微弧氧化涂层的钛样品(mti/ag/cap)。
56.使用扫描电镜(sem，su8230，hitachi，japan)在5kv加速电压下观察上述含有微弧氧化涂层的钛样品的表面形貌，即微弧氧化涂层的形貌，由sem附带的能量色谱x射线荧光光谱仪(edx，oxford x-max 50，oxford instruments，uk)确定，结果如图1、图2和图3所示。图1为微弧氧化涂层的sem图，图3为微弧氧化涂层的双层多孔分级结构示意图，图1和图3显示该涂层外层的孔较大，为微米孔，且分布不均，外层孔的孔径为10μm；内层的孔呈现经典的“火山孔”形貌，为纳米孔，内层孔的孔径为400nm，另外可在涂层表面观测到有纳米银颗粒的富集。图2为微弧氧化涂层的能谱分析(eds)图，发现ag、ca、p元素均成功被引入到涂层中，且可判断植入体的外层为多孔的类磷灰石涂层，内层为tio2层。
57.微弧氧化涂层的这种结构主要归因于电解液及电解参数的不同：在微弧氧化过程中，电解液中的o
2-和po
43-在电场的作用下进行定向运动，并在钛样品表面的tio2氧化层及形成的放电通道内进行持续沉积。而ca
2+
和ag
+
在持续的电解液搅拌下，可以通过扩散和电泳沉积在生长的tio2氧化层上，与po
43-反应并形成外层的类磷灰石层(见图3)；外层类磷灰石层的无序微米级孔的形成是由于在350～400v的电压下，等离子体放电对涂层的破坏和剥落。随着时间的增加，微弧氧化涂层不断生长，最终形成双层多孔分级涂层。此外，在微弧氧化过程中，频率应保持在450～500hz，一个合适的频率有助于构建明显的双层多孔分级涂层。频率过低，使得放电时间过长，能量过高，易破坏外层的形成且内层孔径增大；相反频率过高，使得放电时间过短，能量过低，外层孔与内层孔的孔径都较小，不利于双层多孔分级涂层的构建。
58.实施例2
59.本实施例制备了一种微弧氧化涂层，具体过程为：
60.钛样品选用10mm
×
10mm
×
2mm的工业纯钛(ta4)，并进行如下处理：
61.(1)依次用600目、800目、1000目和2000目的碳化硅砂纸对钛样品进行打磨抛光，然后依次用丙酮、酒精和蒸馏水对打磨好的钛样品超声清洗10min，去除表面杂质；
62.(2)将清洗后的钛样品作为阳极，并置于钙磷钠银系电解液(包括9g/l的六偏磷酸
钠，1.3g/l的硝酸银，7.5g/l的乙酸钙，7g/l的磷酸二氢钙和蒸馏水)中，电源设置为恒压模式，在正向电压为350v，频率为480hz，占空比为12％的条件下进行微弧氧化，氧化全程进行搅拌且电解液温度保持在40℃以下，微弧氧化的时间为10min，微弧氧化结束后即制得双层多孔分级的微弧氧化涂层；
63.(3)用蒸馏水冲洗微弧氧化涂层，并于电热鼓风干燥箱中进行干燥处理，此时即制成表面覆有微弧氧化涂层的钛样品。
64.试验例
65.本试验例测试了实施例1制备的微弧氧化涂层及含有微弧氧化涂层的钛样品的性能。其中：
66.1.微弧氧化涂层的离子释放
67.将mti/ag/cap样品放入盛有5ml的模拟体液(sbf，包括氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钾、氯化镁、氯化钙、tris、碳酸氢钠，ph＝7.4)溶液的离心管中，将离心管置于37℃孵育箱中，进行持续震荡(80rpm)培养，在特定的时间点(1、3、6、24、48、72、120、168、240和336h)取出1ml sbf溶液，同时补充1ml新鲜的sbf溶液到离心管中，保证离心管内一直为5ml的总体积。将取出的1ml sbf溶液用电感耦合等离子体质谱仪(icp-ms，型号expec 7000)进行测定，重复三次取平均值，结果如图4所示。图4中，在24h内释放速度较快，之后释放速度较为缓慢。因此，将该钛样品用于植入手术中，mti/ag/cap样品涂层上的纳米银颗粒的突然释放，对于手术最初的植入是十分有益的，它能尽可能避免感染的发生；而后续长期的缓慢释放，也能帮助降低感染复发的风险，以减少二次手术给患者带来的痛苦。
68.2.抗菌性能评价
69.步骤同试验例1，将未处理的钛样品(cp-ti)也进行相同的浸泡过程，在离子释放试验的基础上，将浸泡1、120和336h的cp-ti和mti/ag/cap样品分别取出，用于抗菌性能的测试。采用涂布稀释法检测抗菌性能，即将2
×
105cfu的菌悬液(使用两种菌悬液：大肠杆菌e.coli和金黄色葡萄球菌s.aureus)1ml置于24孔的组织培养聚苯乙烯培养皿(已放置取出后的钛样品)中，在37℃、相对湿度为90的孵育箱中孵育24h后，用1ml磷酸盐缓冲液(pbs)轻轻冲洗3次，去除未附着的细菌。然后将钛样品放入含有5ml pbs的离心管中，涡流1min，使粘附的细菌分离，制成菌悬液；再将1ml的菌悬液稀释1000倍后，取出100μl的稀释液均匀涂抹在含有lb培养基(1％w/v胰蛋白胨，0.5％w/v牛肉提取物，0.5％w/v氯化钠和2％w/v琼脂)的平板上，在37℃孵育24h后，计算菌落数，重复三次取平均值，结果如图5所示。图5显示，相比于cp-ti样品，mti/ag/cap样品具有持续且有效的抑菌性能，第1天表现出95.5％的抑菌率，第14天仍有近70％的抑菌效果，这为抑菌和治疗感染性骨缺损奠定了良好的基础。且该持续有效的抑菌率主要归因于涂层内银离子的持续缓慢释放行为。
70.3.成骨细胞毒性评价
71.将骨肉瘤细胞(mg-63)按4
×
104细胞/孔的密度接种在cp-ti和mti/ag/cap样品(置于培养板中)表面进行培养，每孔含500μl mem培养基(含10％胎牛血清、100u/ml青霉素g、100mg/ml硫酸链霉素、0.25mg/ml两性霉素b)。每2d更换一次新鲜培养基，1、3、5d后采用cck-8法测定其细胞毒性，即将50μl的cck-8溶液滴加到原有培养基中，37℃孵育1h，随后将黄色的甲酰胺反应产物转移到96孔板上，使用酶标仪(imark，bio-rad，中国)在450nm波长下测试每孔的吸光度，以表征细胞增殖，重复三次取平均值，结果如图6所示。图6显示，在第
1、3和5d(特别是第5d)，mti/ag/cap样品上的细胞增殖率明显高于cp-ti样品上的细胞增殖率，表明本发明制备的微弧氧化涂层能够显著促进细胞的增殖，表现出了较强的生物活性。
72.4.体外细胞外基质(ecm)矿化评价
73.体外基质矿化是骨诱导培养基中成骨分化的晚期指标，这里采用茜素红(ars，solarbio，china)染色观察ecm的矿化情况。将mg-63细胞以4
×
104细胞/孔的密度接种于cp-ti和mti/ag/cap样品(置于培养板中)表面，培养基为含10mmβ-甘油磷酸盐、0.3mm抗坏血酸和100nm地塞米松(sigma，usa)的成骨诱导培养基，于37℃下孵育21d。孵育结束后用pbs将样品清洗3次，然后用4％多聚甲醛固定15min，再用茜素红(2％，ph＝4.3，400μl)在室温下染色15min，用去离子水冲洗并消除游离染料后用光学显微镜(dm2700m，leica，德国)观察细胞ecm的矿化情况。最后用10％的十六烷基氯化吡啶萃取并结合ca 2h，在562nm波长下测定所得溶液的吸光度，以表征ecm的矿化，重复三次取平均值，结果如图7所示。图7中，茜素红主要对矿化结节进行染色，染色结果显示mti/ag/cap样品表面的染色较深，矿物沉积也更厚，定量结果与染色结果相一致，表明mti/ag/cap样品表面的微弧氧化涂层能显著促进成骨细胞的分化和基质矿化。
74.5.体内植入试验评估
75.选用spf级健康sd雄性大鼠(8周龄，平均体重350～400g)进行股骨远端干骺端骨缺损修复模型的构建。手术全程在无菌环境下进行，选取吸入异氟醚(维持浓度3％)麻醉大鼠，麻醉后给大鼠皮下注射美洛昔康(10μl/10g体重)进行术后镇痛。对大鼠右后肢进行剃毛消毒，将股骨上方皮肤和肌肉切开10
×
5mm切口，显露股骨远端干骺端；用1.5mm钻头钻孔形成直径1.5mm、深度2mm的圆柱形骨缺损，用生理盐水冲洗断骨碎片。将无菌的cp-ti和mti/ag/cap植入体(1.5
×
1.5
×
2mm)植入骨缺损处，逐层缝合切口。其中，术中和术后肌注射青霉素、口服卡洛芬的剂量分别为6000u/kg和4mg/kg，持续3天。8周后，对大鼠实施安乐死并采集植入体及周围新生骨组织进行进一步的micro-ct分析，重复三次取平均值，结果如图8所示。图8可看到cp-ti植入体周围出现少量的新生骨组织，而mti/ag/cap植入体周围有更多的新生骨组织生产和更厚的骨小梁结构；此外，micro-ct的定量分析结果中，mti/ag/cap植入体周边骨组织的骨矿化密度(bmd)和骨体积分数(bv/tv)都显著高于cp-ti植入体周边的骨组织的，表明mti/ag/cap植入体在体内具有优异的成骨性能。
76.可见，本发明的一步法制备的具有抑菌和促成骨的多功能钛微弧氧化涂层的方法，不失为一种简单、快速、高效的环境友好型的表面处理方法，在将来治疗感染性骨缺损和骨整形外科应用中具有广泛的应用前景。
77.上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。