一种用于生物和/或化学分析的方法及设备与流程

本发明涉及一种应用于生命科学工业中的分析技术，特别是诊断学、基因组研究和分子生物学中的多重应用。本发明特别涉及一种用于生物和/或化学分析的方法以及用于此目的的分析设备。

背景技术：

本发明所述范围内，微载体与微粒子指任意类型的颗粒、分别指任意类型的尺寸微小的载体，典型地，其最大尺寸为100nm至300μm，优选地为1μm至200μm。

根据本发明，术语微载体指功能化或者被设计成功能化的微粒子，其包含或者被设计包含一种或一种以上连接于微载体表面或浸渍于微载体本体的配体或者功能单元。广谱的化学和生物分子可以作为配体连接于微载体。一个微载体可以具有多个功能单元和/或配体。本文中所使用的术语功能单元可以定义为可以改性、连接、附加、或可以共价或非共价地连接于上述微载体表面或浸渍于微载体本体的任意一种功能单元。上述功能单元包括高通过量筛选技术与诊断学中常规使用的所有功能单元。

术语微通道和微流体通道是指封闭的通道，即横截面为显微可见尺寸，也就是说横截面的最小尺寸典型地为大约1至大约500μm，优选大约10至大约300μm左右的细长的液体通道。微流体通道为纵向的，但并不必然为直线，其与液体在通道内流动的方向相对应，即在假定液体为层流状态时，优选微流体通道的方向与液体平均流速矢量方向基本相对应。

新药的发现或筛选以及DNA测序通常涉及对大量的化合物和分子进行分析。上述分析典型地包括，例如：对所关注的化合物或特定目标分子筛选化学库，或者测试分子间所关注的化学和生物相互作用。这些分析手段通常需要进行数以千计的化学和/或生物反应。

在操作如此巨大数量的独立反应的中产生了众多的实际问题。其中，最为突出的问题可能是标注和跟踪每一个独立反应的必要性。

用于跟踪反应“身份”的一种常规方法是通过微量滴定板(微阵列)将每个反应物理性地分离而实现的。然而，使用微量滴定板一些缺点比如，特别地，由于所使用的微量滴定板尺寸的物理性限制，也因此导致限制了在平板上进行的不同反应的数量。

考虑到微阵列应用的限制，功能性编码微粒子(functionalized encoded microparticles)是当前用于化学和/或生物分析的有利替代方法。每种功能性编码微粒子具有一个代码，其能唯一地识别结合到它表面的特定配体。这种功能性编码微粒的使用适用于随机处理，这意味着数以千计的独特的功能编码微粒可以被混合并同时用于分析中。国际专利申请WO 00/63695中描述了上述功能性编码微粒的实例。

申请人在国际专利申请WO 2010/072011中提出了一种分析设备，其具有至少一个带有入口和出口的微通道，所述微通道用作反应室，在其中大量的功能性编码微粒或微载体10(图1)可以被分装。该微流体通道具有限制或中断装置其可以起到过滤器的作用，允许含有化学和/或生物试剂的液体溶液流通，但阻断微通道内部的微载体。微粒子10的形状和尺寸被设计成与微通道的横截面相对应以防止任何相邻微粒子10发生重叠。因此，微载体10在每一个微通道的内部呈现单层排列，沿着微通道堆积在限制装置处。

在连接其上的配体和流经的化学和/或生物试剂之间表现出有利反应的上述功能性编码微载体10，可能其自身代码被随机读取，从而导致配体被识别而产生有利反应。

该代码可以包含由多个穿越孔12构成独特模式，也可能包含非对称定向标记，例如，L型记号14(如图1所示)或三角形。这些非对称定向标记使得微载体1的上表面16和下表面18得以区分。

借助于WO 2010/072011中所描述的分析设备，微粒子由微通道的入口进入其内并固定到限制装置中。然后，生物样品(包含一种或多种目标分子)流入含有微粒子的微通道(包含一套或者多套微载体)，然后通过限制装置流向出口，而微载体仍然被限制装置而阻挡在内。目标反应的检测基于微流体通道中存在的每个被编码微载体的荧光强度的连续读取。换句话说，分析中目标分子的存在会激发预定的荧光信号。

然而，在微粒子10被添加到微通道并且堆积于限制装置上之后，微粒子10可能被与微通道20相垂直的另一个方向上的微粒子10稍微抵消，即在Z方向上(图2)。

然后，当进行如WO 2010/072011A1中所述的方法连续读取荧光强度时，可以观察到部分或者全部的微粒子22与其靶向分子连接导致微粒子22表面发出的荧光的强度是不均匀的(图3。图4是微粒子22的放大图，在其表面显示了不均匀的强度。微粒子22清晰地显示出第一个区域24的灰度值低于周围的第二个区域26。

这种不均匀的光强度缘于微通道的质量传递的不均匀性，这主要微通道20内的Z方向上微载体10的特定排列的结果。微通道(20)中不均均匀的质量传递将导致目标分子在微粒子表面的不均匀性通过。

这种不均匀的质量传递是存在问题的，因为它会影响对于微载体荧光值的属性。如果不均匀性是显著的，微载体的荧光值将不能真正地反映出分析样品中目标分子的正确浓度。

因此，不均匀的质量传递会影响测量信号的可靠性。多个微载体的错误数值会严重影响分析的可靠性，进一步影响其在诊断学，基因组研究和分子生物学领域的有效性。

本发明旨在部分或者全部地解决上述问题。

技术实现要素：

针对上述目的，本发明提供了一种用于执行化学和/或生物分析的方法，其包含至少以下连续步骤：

a)提供一种包含至少一个微通道的分析设备，所述微通道具有至少一个入口和至少一个出口，所述分析设备进一步包含一个限制性装置，所述限制装置被设计为在限制被引入微通道的微粒子向出口移动的同时允许液体经由所述限制装置流向出口，

b)将多个微粒子经由入口引入到微通道中，每个微粒子具有与微通道横截面相对应的形状以防止两个相邻微粒子发生重叠，

c)使用限制装置限制微粒子在微通道内向出口方向的移动，

d)使液体样品流过微通道，

e)对每个微粒子执行生物和/或化学读取，该方法的进一步包含步骤：

f)使微粒子在微通道内移动的同时，所述微粒子仍被所述限制装置限制朝出口方向移动，

g)依次地重复步骤d)和步骤e)。

因此，根据本发明所述的方法，微粒子要在两个连续的生物和/或化学读取位点间进行移动为了至少改变与微通道垂直的方向的微粒子相互之间的排列，以减少上述不均匀质量传递的影响。

实际上，在进行第一生物和/或化学读取时，取决于微通道内微粒子的排布，质量传递的特定分布是确定的，从而创建微载体的流动模式。然而，在进行第二次生物和/或化学读取之前移动微粒子将会引起微通道内的质量传递分布的改变。因此由于质量传递的不均匀所导致的不均匀的强度通过一段时间内所有微粒子的统计平均值计算得到，从而收集到一段时间内每个微粒子的均匀的强度。

通过在不同的时间点读取，然后有可能得出可靠的方式和动力反应。

根据本发明的另一个特性，在步骤g结束之后重复至少一次步骤f至g，因此允许目标分子和微粒子进行生物和/或化学反应期间进行若干次质量传递的分布。

优先地，步骤f和g至少以给定频率进行重复，因此在进行生物和/或化学分析期间，微通道内的微载体可以定期随机排列。

在本发明的一个特定实例中，给定频率包含在下述范围内：0.05Hz至1Hz，更优选包含在下述范围内：0.5Hz至2Hz。

根据本发明的另一个特征，移动微通道内的微粒子的步骤f)在第一给定期间内进行，该给定期间的长度足以引起微通道内质量传递分布发生改变。

同样应该理解，所述第一个期间应该以不会增加进行一个完整的生物和/或化学分析所需时间的方式被确定。

本发明的一个实例中，给定的第一期间包含在下述范围内：0.5至5s。已经发现，该期间在能够进行一个完整的分析所需的时间和充分移动微粒子以引起质量传递分布的改变所需的时间之间可以达到良好折中。根据本发明的另一个特征，步骤g用于执行第二个给定期间。

第二个给定期间可以确保所有的微粒子具有充分的时间与液体样品中的试剂和目标分子进行相互作用，并确保能够检测微粒子发出的信号。因此，该第二给定期间被认为是获得微粒子目标分子的良好质量传递的关键特征。

在本发明的一个实施例中，该给定第二个期间包含在下述范围内：0.2至5s。

根据本发明的另一个实施例，步骤f)由沿微通道方向来回移动微粒子组成，这一过程便于将微粒子沿微通道方向彼此之间进行空间和随机重新排列，因此会导致在微通道内已经建立的质量传递分布的改变。

本发明的一个特定实施例中，通过对微通道入口与出口间的液体样品施加负压力差使得微粒子向后移动，通过对微通道入口与出口间的液体样品施加一个正压力差使得微粒子向前移动。在一个实施例中，所述负压力差包含在下述范围内：-20至-200mbars。根据本发明，所述正压力差包含在下述范围内：20至200mbars。

在本发明的另一个实施例中，通过由微通道出口向入口的机械驱动实施液体样品位移使微粒子向后移动，通过由微通道入口向出口的机械驱动实施液体样品位移使微粒子向前移动。有利地，该机械驱动将注射泵连接于微通道，以及推动注射活塞而产生。

优先地，在步骤f)中微粒子向微通道入口移动一段表示为至少5倍于沿微通道方向测量的微粒子尺寸的距离。

上述数值被认为相当于是微粒子应该移动的最佳距离，其可以保证微粒子沿微通道方向彼此之间的随机重新排列以引起微通道内质量传递分布的随机改变。根据本发明的一个实施方式，步骤f’在步骤f与步骤g之间执行，由其构成为使微粒子向出口移动直到它们的移动被限制装置所限制。

微粒子的移动被限制装置限制之前向出口方向的移动为微粒子提供了一种静态的配置用于进行分析和读取，在上述过程中微粒子通常被定位在微通道的相同区域。

本发明同时也涉及一种基于本发明所述方法的分析设备，其包括至少一个微通道，所述微通道具有至少一个入口与出口，所述微通道被设计为可以容纳多个微粒子，其特征性在于所述入口与出口与压力实施装置相连接，所述压力实施装置连接了用于控制压力实施装置的控制装置以便于在入口和出口之间产生负压力差和正压力差。

根据本发明的分析设备通过改变微通道入口与出口的压力差使得添加到微通道内的微粒子进行向后和向前移动，因此可以防止或者至少减少生物和/或化学分析中不均匀质量传递的影响。

附图说明

通过非限制实施例结合附图，本发明和下述说明书中的其他细节、特征和优点可以被更好地理解，其中：

图1：示出了根据现有技术的一种微载体的俯视图；

图2：示出了微通道内彼此相对的微载体的定位；

图3：根据现有技术的方法和分析设备所获得的荧光图像；

图4：由一个微载体收集的荧光放大图；

图5：根据本发明的分析设备的横截面图；

图6A、6B、6C和6D为根据本发明的方法在微通道内移动微粒子的步骤简图；

图7：根据本发明的方法获得的荧光图像。

我们首先来看图5，其代表本发明所述的分析设备19，其包含若干个微通道20(横截面图中只能看到一个)，所述微通道20在平板22上形成并彼此并排排列。每个微通道20包含一个与吸入井30液体相通的入口28和一个与排水井32液体相通的出口32。

每个微通道20的末端都带有一个用作过滤器的限制或中断装置34，使得当微载体10被阻挡在微通道20时允许液体溶液流通。

如上所述，微粒子10在每个微通道内部呈现单层排列，并且沿微通道堆积在限制装置处。

该分析设备包含检测装置36，该装置被设计为用于检测由基本垂直于平板方向的微粒子10的表面所发出的荧光信号，上述平板为光学透明的以便于可从微通道的外部进行信号检测。

第一微型泵38被固定在吸入井30的入口处，第二微型泵40被固定在排出井32的出口处。第一微型泵38和第二微型泵40都与控制装置42相连接以便于同时对两个微型泵38和40进行控制，然后对微通道20的入口28和出口30之间的液体施加压力差△P。

根据本发明的方法，第一步骤a即是提供上文描述的分析设备19。

图6A所示的为第二个步骤b，由将多个微粒子101、102、103和104引入吸入井然后引入微通道内。为便于微粒子101、102、103和104引入微通道内，事先将微粒子101、102、103和104加入溶液中，该溶液随后引入到吸入井30和微通道20中。

为了使微粒子101、102、103和104能够流向微通道20的出口30，控制装置42控制第一和第二泵38、40以确保在微通道20的入口28和出口30之间提供一个正压力差△P。

图6B所示的为第三个步骤c，微粒子101、102、103和104向微通道20的出口方向的移动被限制装置34所限制。

在第四个步骤d中，液体样品由微通道20的入口28流向出口30。该液体样品包含用于生物分析的所有必要的试剂，目标和/或非目标分子。

第五个步骤e由使用检测装置34收集微粒子发出的荧光信号组成。

第六个步骤由使微粒子101、102、103和104在微通道20中向后朝入口移动，如图6C所示，然后向前朝出口移动直到其移动被限制装置34所限制。

微粒子101、102、103和104的向后移动(图6C)由控制第一和第二微型泵38、40的控制装置42引起使得微通道20的入口28和出口30之间的压力差由正变负。而微粒子101、102、103和104的向前移动则是在微通道20的入口28和出口30之间重设正压力差来引起。

微粒子101、102、103和104向微通道20的入口28移动一段表示为至少5倍于沿微通道方向测量的微粒子的尺寸的距离，即为微粒子直径的5倍。

微粒子101、102、103和104在范围为1至5s之间，优选向后移动，以保证所有的微粒子101、102、103、104具有充足的时间沿微通道进行移动。

与图6B所观察到的排列方式进行对比，图6D所示的微粒子101、102、103和104沿微通道20彼此之间具有不同的空间排布。然后，这种微粒子101、102、103、104间空间排布的变化会引起在执行生物和/或化学连续读取之间质量传递分布的变化。

在最后的步骤g中，本发明所涉及的方法包括在0.2至5s的时间范围内连续重复地进行步骤d和e。

在本发明所述方法的一个特殊实施方式中，步骤f和g以给定频率，例如0.05至5Hz周期性地重复，以定期改变生物和/或化学分析中的质量分布。

图7示出了由微粒子10所发出的的荧光图像。上述连接有已与液体样品中的化学和/或生物试剂反应的配体的微粒子的整个表面都显现出均匀的光强度。因此，本发明所涉及的方法可以消除不均匀的质量传递对从微粒子收集到的荧光信号的影响。

控制着第一和第二微型泵38、40的控制装置42被配置为使得每个控制泵38、40可以分别地向微通道20的入口28和出口30施加压力P_入口和P_出口其值都高于大气压P_大气。

此外，压力P_入口和P_出口以及微通道的入口28和出口30之间压力差的绝对值∣△P∣使得P_入口—∣△P∣和P_出口-—∣△P∣总是要高于预定压力以防止在微通道20中形成微气泡而导致局部阻塞微通道。

在本发明的一个实施方式中，压力P_入口和P_出口被设定为相同的数值P₁。

在限制装置34的非限制实施例中包含电网、电线、筛网过滤器、一个伟尔结构(weir construct)、一根或者多根沿与平板基本垂直的方向延伸的柱子、微通道缩减部分。静电力或非静电力或磁场可能被用于固定微粒子。更多限制装置的实施例描述于申请人的专利申请WO 2010/072011中。

除了利用上述改变压力差的方式，其他手段也可用于推动微粒子10向后移动。特别地。可以利用能够产生磁场的磁场装置，所述磁场可以和对磁场敏感的微粒子10相互作用。

微粒子10的形状优选为直径1至200μm，例如直径为40μm的圆盘。所述微粒子的也可以具有一些不同的形状例如长方形和六边形。

根据本发明已公开的说明和实际操作，其他实施例对于本领域技术人员是显而易见的。在如下所附权利要求书所表明的本发明的真正范围和精神内，上述说明和实施例应当被认为只是典范性的。