检测人HSP90α-2蛋白的荧光免疫层析试纸及其制备方法技术领域本发明属于多肽化学和免疫学领域，具体涉及人热休克蛋白90α-2(HSP90α-2)抗原表位肽、用该抗原表位肽制备的HSP90α-2特异性抗原和相应的单克隆抗体或多克隆抗体、所述抗体在制备人HSP90α-2体外诊断试剂盒上的应用，人HSP90α-2体外诊断试剂盒，以及一种用于定量检测待测物中人HSP90α-2蛋白的荧光免疫层析试纸及其制备方法。
背景技术：
近年来，对肿瘤标志物的研究已经引起许多研究者的注意，寻找一种可靠的、非侵入式的、能反映肿瘤的发生、增殖分化的肿瘤标志物是众多研究者的共同心愿。通过对血液、组织液的研究，目前发现一些肿瘤标志物可以对肿瘤的发生、增殖分化进行预测。其中，人热休克蛋白90α-2(HSP90α-2)就是这样的一种肿瘤标志物。热休克蛋白90α-2是热休克蛋白家族中的重要的蛋白之一，其作为分子伴侣来参与调控、维持细胞内多种蛋白的构象和功能，在调节细胞生长、分化和凋亡等方面发挥重要的作用。近年发现，热休克蛋白90α-2作为伴侣蛋白对肿瘤的恶性转变、生长、增殖及侵袭有着重要的作用。有许多报道证实，人体肿瘤组织中，热休克蛋白的表达发生了改变。在不同部位的肿瘤组织中，热休克蛋白表达的改变并不一致。目前发现肿瘤病人血清中的HSP90α-2含量与肿瘤的恶性程度，尤其是转移正相关。因此，HSP90α-2有希望作为肿瘤诊断和预后的标志物。检测血清中的HSP90α-2水平的最理想的方法为免疫检测。因此，寻找合适的具有免疫原性的HSP90α-2抗原表位肽、制备特异性的HSP90α-2抗原及抗体即成了重点。荧光免疫层析方法测血液中的待测物操作简便、快速，只需10分钟就能完成样品检测，并且检测范围宽，灵敏度好，能够迅速及时地帮助诊断病情，监测预后。中国专利申请No.200910117820.8公开了一种荧光微球免疫层析试纸条的制备方法及定量检测方法；中国专利申请No.200910047352.1公开了一种荧光免疫层析试纸及其制备方法和应用。然而，目前还没有针对人HSP90α-2蛋白的荧光免疫层析试纸。
技术实现要素：
为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了一种用于定量检测待测物中人HSP90α-2蛋白的荧光免疫层析试纸及其制备方法。具体而言，本发明提供了：一种用于定量检测待测物中人HSP90α-2蛋白的荧光免疫层析试纸，该试纸通过双抗体夹心法检测所述人HSP90α-2蛋白，其中：所述双抗体夹心法采用标记有荧光微球的第一HSP90α-2单克隆抗体作为捕获抗体，所述第一HSP90α-2单克隆抗体来源于人HSP90α-2抗原表位肽(1)和(2)中的一者；并且所述双抗体夹心法采用第二HSP90α-2单克隆抗体作为检测抗体，所述第二HSP90α-2单克隆抗体来源于人HSP90α-2抗原表位肽(1)和(2)中的另一者；所述人HSP90α-2抗原表位肽(1)和(2)分别为：(1)Tyr-Glu-Lys-Glu-Ser-Glu-Asp-Lys-Pro-Glu-Ile-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asp-Glu；(2)Tyr-Arg-Gly-Ile-Asp-Glu-Asp-Asp-Pro-Thr-Ala-Asp-Asp-Thr-Ser-Ala-Ala-Val-Thr-Glu。优选地，所述第一HSP90α-2单克隆抗体是由第一HSP90α-2抗原制备而成的，该第一HSP90α-2抗原是通过使所述人HSP90α-2抗原表位肽(1)和(2)中的一者与载体蛋白偶联制备而成的；并且所述第二HSP90α-2单克隆抗体是由第二HSP90α-2抗原制备而成的，该第二HSP90α-2抗原是通过使所述人HSP90α-2抗原表位肽(1)和(2)中的另一者与载体蛋白偶联制备而成的。优选地，所述荧光微球的粒径为320nm至400nm。优选地，所述荧光微球上的荧光物质为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明或X-罗丹明等，其中优选为X-罗丹明；所述荧光微球的微球材料为聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸甲酯的共聚物。优选地，所述荧光微球的激发波长为350～600nm，优选为390nm；发射波长为500～700nm，优选为615nm。优选地，所述荧光免疫层析试纸具有底板，并且在该底板上沿使用时的层析方向依次以接触方式设置有：样品垫、结合垫、反应膜、吸水滤纸，所述结合垫设置有所述的标记有荧光微球的第一HSP90α-2单克隆抗体，所述反应膜包括检测区和质控区，所述检测区包被有所述第二HSP90α-2单克隆抗体，所述质控区包被有能与所述的标记有荧光微球的第一HSP90α-2单克隆抗体特异性结合的抗抗体。优选地，所述反应膜为在大于550nm的波长下基本上不发荧光的硝酸纤维素膜。优选地，所述底板基本上不具有荧光性质。优选地，所述抗抗体为羊抗鼠IgG单克隆抗体或兔抗鼠IgG单克隆抗体，其中优选为羊抗鼠IgG单克隆抗体。本发明还提供了一种制备所述的用于定量检测待测物中人HSP90α-2蛋白的荧光免疫层析试纸的方法，其包括以下步骤：1)提供标记有荧光微球的第一HSP90α-2单克隆抗体；2)提供结合垫，其中在所述结合垫上包被所述的标记有荧光微球的第一HSP90α-2单克隆抗体；3)提供反应膜，其中在所述反应膜上沿使用时的层析方向间隔固定第二HSP90α-2单克隆抗体和抗抗体，以分别形成检测区和质控区；4)在底板上沿使用时的层析方向依次以接触方式设置样品垫、所述结合垫、所述反应膜、吸水滤纸，从而制成所述荧光免疫层析试纸。优选地，所述步骤1)包括：a)用碳二亚胺活化荧光微球，优选地，将荧光微球的水分散液或MES缓冲液分散液经超声波处理并与碳二亚胺混合，从而活化所述荧光微球；b)洗涤步骤a)所获得的活化的荧光微球，优选地，将步骤a)所获得的活化的荧光微球用N-羟基硫代琥珀酰亚胺-柠檬酸缓冲液洗涤、分散，并经超声波处理；c)用步骤b)所获得的荧光微球标记第一HSP90α-2单克隆抗体，优选地，将步骤b)所获得的荧光微球与第一HSP90α-2单克隆抗体混合，用BSA-乙醇胺缓冲液封闭，离心，用BSA-吐温水溶液分散，经超声波处理，从而得到标记有荧光微球的第一HSP90α-2单克隆抗体。优选地，在所述步骤2)中，所述的标记有荧光微球的第一HSP90α-2单克隆抗体的包被浓度为0.5～2mg/ml。优选地，在所述步骤3)中，所述检测区和所述质控区间隔3mm至8mm。优选地，在所述步骤3)中，所述第二HSP90α-2单克隆抗体和所述抗抗体的包被浓度分别为0.5～2mg/ml。本发明与现有技术相比具有以下优点和积极效果：1.本发明的人HSP90α-2抗原表位肽具有良好的抗原性，用其制备的抗原(免疫原)免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体和多克隆抗体。2.用本发明制备的HSP90α-2单克隆抗体和多克隆抗体能够高度特异地与血液样本中的HSP90α-2结合。3.本发明的人HSP90α-2体外诊断试剂盒可以有效地检测血清中的HSP90α-2的水平，可用来判断肿瘤的恶性程度，并对转移和预后进行预测。4.本发明将荧光分析技术与快速层析免疫技术相结合，提供了一种用于定量检测待测物中人HSP90α-2蛋白的荧光免疫层析试纸，用该试纸检测待测物中的人HSP90α-2蛋白，操作简便、快速，只需10分钟就能完成样品检测，并且检测范围宽、特异性高、灵敏度好，能够迅速及时地帮助诊断病情，监测预后。5.本发明在制备所述人HSP90α-2蛋白的荧光免疫层析试纸的过程中，通过大量的试验摸索，优化了各方面的制备条件，使得用本发明的荧光免疫层析试纸进行检测时，荧光信背比大大提高，从而提高了检测灵敏度和结果可信度；此外，本发明还通过试纸的检测区与质控区的荧光强度比值的变化来反应样品中HSP90α-2的含量，这与传统的层析技术只考查检测区的绝对荧光强度相比，最大程度上减少了外界条件和背景等的影响，进一步提高了检测结果可信度。附图说明图1示意性示出本发明的一个实施方案的荧光免疫层析试纸的结构示意图。具体实施方式以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。一、人HSP90α-2抗原表位肽本文中所述的人HSP90α-2蛋白是本领域已知的，其氨基酸序列是本领域已知的，可以在NCBI等专业数据库中查到。本发明提供了人HSP90α-2抗原表位肽(1)和(2)，其氨基酸序列分别如序列表SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，为：(1)Y-E-K-E-S-E-D-K-P-E-I-E-D-V-G-S-D-E；和(2)Y-R-G-I-D-E-D-D-P-T-A-D-D-T-S-A-A-V-T-E。本发明的发明人经过大量的理论研究和实验摸索，最终筛选得到两种具有良好的抗原性的抗原表位肽。HSP90α-2抗原表位肽(1)包含人HSP90α-2蛋白(NCBI登录号NP_005339.3)N端第249位至第265位的肽段，并且在该肽段的N段加上Y，从而构成包含18个氨基酸的HSP90α-2抗原表位肽(1)。HSP90α-2抗原表位肽(2)包含人HSP90α-2蛋白(NCBI登录号NP_005339.3)C端第697位至第714位肽段，并且在该肽段的N段加上Y和R，从而构成包含20个氨基酸的HSP90α-2抗原表位肽(2)。这两个肽段均具有亲水性、抗原性强并且易于合成的特点。目前，本发明研究发现，本发明的HSP90α-2抗原表位肽具有如下功能：1.具有抗原性；2.与载体蛋白连接后作为免疫原刺激动物产生特异性的抗体；3.用抗原表位肽制备的抗体可特异性地与人HSP90α-2结合。本发明的HSP90α-2抗原表位肽的制备方法可用化学合成法：利用美国ABI431A型多肽自动合成仪，通过固相法合成抗原表位肽。本发明的抗原表位肽(1)和(2)的分子量分别为2404.35、2483.39，可用质谱进行确定，并通过多肽序列测定鉴定所合成的抗原表位肽序列。肽段的纯度可用薄层色谱和高效液相色谱进行评定，并测定抗原表位肽的浓度。二、HSP90α-2抗原本发明还提供了HSP90α-2抗原，其通过使本发明的人HSP90α-2抗原表位肽(1)和(2)中的一者与载体蛋白偶联制备而成。具体而言，本发明提供了HSP90α-2抗原(1)和(2)，所述HSP90α-2抗原(1)通过使本发明的人HSP90α-2抗原表位肽(1)与载体蛋白偶联制备而成；所述HSP90α-2抗原(2)通过使本发明的人HSP90α-2抗原表位肽(2)与载体蛋白偶联制备而成。本发明的HSP90α-2抗原具有免疫原性和特异性，是一种免疫原，可用来免疫动物从而制备特异性的HSP90α-2抗体。在本发明中，可用的载体蛋白的例子包括KLH(钥孔血蓝蛋白)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白OVA等。由于KLH(钥孔血蓝蛋白)免疫原性强，结合位点多，免疫效果较好，并且与免疫动物亲缘关系较远，用其作为载体蛋白不易引起交叉反应，因此是优选的。三、HSP90α-2单克隆抗体、HSP90α-2多克隆抗体和人HSP90α-2体外诊断试剂盒本发明还提供了人HSP90α-2单克隆抗体和人HSP90α-2多克隆抗体，所述抗体可以各自利用本发明的HSP90α-2抗原(1)或(2)(免疫原)免疫动物制备而得。制备方法可采用本领域的常规技术，具体可参见实施例2。本发明的HSP90α-2单克隆抗体和多克隆抗体可以用于制备人HSP90α-2体外诊断试剂盒，该试剂盒可以基于免疫方法对人体组织、细胞或体液中的HSP90α-2进行检测，优选对血液标本中的HSP90α-2进行检测。因此，本发明提供了一种人HSP90α-2体外诊断试剂盒，其包含本发明的人HSP90α-2单克隆抗体或多克隆抗体。目前已知可用于临床检验的免疫实验方法主要包括以下几种：ELISA法、化学发光法、荧光层析法、胶体金免疫测定法等。而ELISA法包括以下几种类型：双抗体夹心法检测抗原、双抗原夹心法检测抗体、间接法测抗体、竞争法测抗体、竞争法测抗原、捕获包被法测抗体等。本发明的人HSP90α-2体外诊断试剂盒优选采用ELISA双抗体夹心法来检测HSP90α-2蛋白。该试剂盒可以包含包被抗体、结合抗体、酶标记的第二抗体和/或必要的工具和试剂等。优选的是，所述人HSP90α-2体外诊断试剂盒采用本发明的人HSP90α-2单克隆抗体作为包被抗体。在此，术语“包被抗体”是指包被于固相的酶标板上的抗体。此外，所述人HSP90α-2体外诊断试剂盒还优选包含人HSP90α-2多克隆抗体以作为结合抗体，其中，当所述结合抗体来源于本发明的人HSP90α-2抗原表位肽(1)和(2)中的一者时，所述包被抗体来源于所述抗原表位肽(1)和(2)中的另一者。在此，术语“结合抗体”是指试剂盒中可与待测抗原及酶标记第二抗体结合的特异性抗体。所述试剂盒还可以包含酶标记的第二抗体，该第二抗体可以为羊抗兔IgG抗体，所述酶标记可以为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等。在本发明的试剂盒中，还可以包含检测所需的任何试剂或工具，例如预包被板、洗涤液、显色剂、终止液等。四、用于定量检测人HSP90α-2蛋白的荧光免疫层析试纸本发明还提供了一种用于定量检测待测物中人HSP90α-2蛋白的荧光免疫层析试纸，该试纸通过双抗体夹心法检测所述人HSP90α-2蛋白，其中：所述双抗体夹心法采用标记有荧光微球的第一HSP90α-2单克隆抗体作为捕获抗体，所述第一HSP90α-2单克隆抗体来源于人HSP90α-2抗原表位肽(1)和(2)中的一者；并且所述双抗体夹心法还采用第二HSP90α-2单克隆抗体作为检测抗体，所述第二HSP90α-2单克隆抗体来源于人HSP90α-2抗原表位肽(1)和(2)中的另一者；所述人HSP90α-2抗原表位肽(1)和(2)分别为：(1)Tyr-Glu-Lys-Glu-Ser-Glu-Asp-Lys-Pro-Glu-Ile-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asp-Glu；(2)Tyr-Arg-Gly-Ile-Asp-Glu-Asp-Asp-Pro-Thr-Ala-Asp-Asp-Thr-Ser-Ala-Ala-Val-Thr-Glu。在本发明中，在双抗体夹心法荧光免疫层析试纸中，“捕获抗体”是指能够首先特异性识别待测抗原的抗体，其通常设置在结合垫上；“检测抗体”是指另一种能够特异性识别待测抗原的抗体，其与捕获抗体分别识别待测抗原分子上的不同的抗原表位，其通常固定在反应膜的检测区上。在本发明中，所述第一HSP90α-2单克隆抗体可以由第一HSP90α-2抗原制备而成，该第一HSP90α-2抗原可以通过使所述人HSP90α-2抗原表位肽(1)和(2)中的一者与载体蛋白偶联制备而成；并且所述第二HSP90α-2单克隆抗体可以由第二HSP90α-2抗原制备而成，该第二HSP90α-2抗原可以通过使所述人HSP90α-2抗原表位肽(1)和(2)中的另一者与载体蛋白偶联制备而成。在本发明中，可用的载体蛋白的例子包括KLH(钥孔血蓝蛋白)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白OVA等。由于KLH(钥孔血蓝蛋白)免疫原性强，结合位点多，免疫效果较好，并且与免疫动物亲缘关系较远，用其作为载体蛋白不易引起交叉反应，因此是优选的。优选地，本发明的荧光免疫层析试纸中所用的荧光微球的粒径为320nm至400nm，优选为360nm，荧光微球上的荧光物质可为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明或X-罗丹明等，其中优选为X-罗丹明(可购自上海晶纯公司)。荧光微球的微球材料可以为聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或由甲基丙烯酸甲酯与其它单体共聚形成的共聚物，其它单体的例子为苯乙烯等。荧光微球的激发波长可以为350～600nm，优选为390nm；发射波长可以为500～700nm，优选为615nm。在本发明中，荧光微球的最大激发波长与发射波长差值较大，说明荧光微球有较大的斯托克斯(Stokes)位移，这样，荧光试纸的背景干扰较低，以该微球做免疫层析标记物有较强的优势。在一个具体的实施方案中，本发明的荧光免疫层析试纸具有底板，并且在该底板上沿使用时的层析方向依次以接触方式设置有：样品垫、结合垫、反应膜、吸水滤纸，所述样品垫用于在使用时加载待测样品，所述结合垫设置有所述的标记有荧光微球的第一HSP90α-2单克隆抗体，所述反应膜包括检测区和质控区，所述检测区包被有所述第二HSP90α-2单克隆抗体，所述质控区包被有能与所述的标记有荧光微球的第一HSP90α-2单克隆抗体特异性结合的抗抗体。优选地，本发明的荧光免疫层析试纸的样品垫、结合垫、反应膜、吸水滤纸可以沿使用时的层析方向依次搭接设置在底板上(参见图1)。反应膜上间隔设置的检测区和质控区可以为，但不限于，线、带、块等形式，检测区和质控区优选间隔3mm至8mm。在本发明中，反应膜优选为在大于550nm的波长下基本上不发荧光的硝酸纤维素膜(例如可购自上海杰一，型号GFCP203000)。在本文中，“基本上不发荧光”的含义是指在相应波长(例如大于550nm的波长)的光照下不发射荧光，或者仅发射微量的、不实质上影响检测结果的荧光。此外，底板优选基本上不具有荧光性质，例如为基本上不具有荧光性质的PVC背板(例如可购自上海杰一，型号HF000MC100)。在本文中，“基本上不具有荧光性质”是指不具有荧光性质，或者仅具有低的、不实质上影响检测结果的荧光性质。通常，常规的层析试纸组件(反应膜、底板等)在550nm波长下具有较明显的荧光背景，这对荧光信号的检测产生很大干扰。本发明通过采用在大于550nm的波长下基本上不发荧光的硝酸纤维素膜和低荧光性质的底板，从而克服了常规荧光试纸的缺陷。此外，本发明所用的荧光物质X-罗丹明可产生较强的荧光信号，从而进一步大大提高了荧光信背比，使得能够很好地区分信号和背景，进而提高检测灵敏度。在本发明中，样品垫和结合垫的材料可采用本领域通常使用的材料，例如，样品垫和结合垫可以为玻璃纤维。本发明所采用的能与标记有荧光微球的第一HSP90α-2单克隆抗体特异性结合的抗抗体可以为羊抗鼠IgG单克隆抗体或兔抗鼠IgG单克隆抗体，其中优选为羊抗鼠IgG单克隆抗体，与多克隆抗体相比，单克隆抗体特异性更高。在一个具体的实施方案中，本发明的荧光免疫层析试纸在使用时，在样品垫上滴加样品液(如含有HSP90α-2的血样)，在毛细管作用下，样品液向吸水滤纸一端移动，在结合垫处与所述的标记有荧光微球的第一HSP90α-2单克隆抗体形成免疫复合物，该免疫复合物进一步移动，在检测线上与所述第二HSP90α-2单克隆抗体结合形成双抗体夹心的免疫复合物，而未形成免疫复合物的标记有荧光微球的第一HSP90α-2单克隆抗体则与质控线上的抗抗体结合。此过程需要10分钟至15分钟，之后，用荧光检测仪进行检测，如果质控线处未出现条带，则说明试纸失效；如果质控线处出现条带，而检测线处未出现条带，则说明样品中不含人HSP90α-2蛋白；如果在质控线和检测线上均出现条带，则说明样品中含有人HSP90α-2蛋白。在另一个方面，本发明提供了一种制备用于定量检测待测物中人HSP90α-2蛋白的荧光免疫层析试纸的方法，其包括以下步骤：1)提供标记有荧光微球的第一HSP90α-2单克隆抗体；2)提供结合垫，其中在所述结合垫上包被所述的标记有荧光微球的第一HSP90α-2单克隆抗体；3)提供反应膜，其中在所述反应膜上沿使用时的层析方向间隔固定第二HSP90α-2单克隆抗体和抗抗体，以分别形成检测区和质控区；和4)在底板上沿使用时的层析方向依次以接触方式设置样品垫、所述结合垫、所述反应膜、吸水滤纸，从而制成所述荧光免疫层析试纸。本发明的方法还可以包括将制成的荧光免疫层析试纸切割成适当宽度的步骤5)。本发明的发明人通过大量的试验摸索，优化了制备本发明的用于检测人HSP90α-2蛋白的荧光免疫层析试纸的方法的各个步骤的条件，从而使得本发明的荧光免疫层析试纸能够针对人HSP90α-2蛋白获得符合临床检测要求的结果，即，检测范围宽、特异性高、灵敏度好。因此，优选的是，在本发明的方法中，所述步骤1)包括：a)用碳二亚胺活化荧光微球，优选地，将荧光微球的水分散液或MES缓冲液分散液经超声波处理并与碳二亚胺混合，从而活化所述荧光微球；b)洗涤步骤a)所获得的活化的荧光微球，优选地，将步骤a)所获得的活化的荧光微球用N-羟基硫代琥珀酰亚胺-柠檬酸缓冲液洗涤、分散，并经超声波处理；c)用步骤b)所获得的荧光微球标记第一HSP90α-2单克隆抗体，优选地，将步骤b)所获得的荧光微球与第一HSP90α-2单克隆抗体混合，用BSA-乙醇胺缓冲液封闭，离心，用BSA-吐温水溶液分散，经超声波处理，从而得到标记有荧光微球的第一HSP90α-2单克隆抗体。在本发明的一个具体的实施方案中，所述步骤1)包括：a)取1(w/v)％的荧光微球水分散液，10000rpm至15000rpm低温(例如10℃)离心5至10分钟，去上清，将沉淀物分散到500μl的蒸馏水或初洗缓冲液(0.1M的MES水溶液)中，超声波(240W)处理1至2分钟，重复以上过程三次，加入碳二亚胺10mg至50mg，搅拌10～15分钟，从而活化所述荧光微球；b)洗涤步骤a)所获得的活化的荧光微球，优选地，将步骤a)所获得的活化的荧光微球在1000rpm至15000rpm下离心5至10分钟，将沉淀物分散到1ml偶联缓冲液(20～100mM的N-羟基硫代琥珀酰亚胺-柠檬酸缓冲液))中，超声波(240W)处理1至2分钟，重复以上过程三次；c)用步骤b)所获得的荧光微球标记第一HSP90α-2单克隆抗体，优选地，按照1μl至3μl抗体(8mg/ml)/100μl所述活化的荧光微球的比例，将步骤b)所获得的荧光微球与第一HSP90α-2单克隆抗体混合，室温(25℃)...