技术领域本发明涉及一种筛选抗肿瘤药物的试剂盒及其使用方法，属于生物检测技术领域。
背景技术：
目前，恶性肿瘤已经成为人类的头号杀手，严重的危害着人类的健康，世界卫生组织的资料表明，每年全世界肿瘤的发病为1000万人，死亡约700万人，我国每年癌症每年的新发病例为200万，因癌症死亡的约为140万，我国居民死亡5人中，即有1人死于癌症。现阶段，国内外抗肿瘤药物筛选选用的模型主要有细胞、果蝇、线虫、小鼠和大鼠。细胞为模型的药物筛选为体外药物作用研究，效率高但往往相关性差；果蝇的生活模式限制了其在高通量药物筛选中的应用；鼠类的建模实验操作技术要求高且因其培养条件高导致筛选效率低、研究成本高昂。而秀丽隐杆线虫培养条件简单，可以在琼脂板上或是液体培养基中取食细菌(E.coli)；世代周期短，通常为3天左右；寿命短，通常为3周左右；秀丽隐杆线虫实验群体容易放大，而且可以大量获得同步化(生长时期处于同一阶段)的秀丽隐杆线虫。秀丽隐杆线虫因为寿命周期短和容易实现高通量的优势，成为肿瘤研究的理想模型。但是现阶段使用秀丽隐杆线虫仍然存在一定的困难，主要是对于一般人来讲，秀丽隐杆线虫的的造模、培养、检验等仍需要系统的技术培训与实践，才能完成药物筛选，因此，大家急需一种基于上述秀丽隐杆线虫模型的筛选抗肿瘤药物的试剂盒，供本领域研发人员高效准确地筛选抗肿瘤药物。对此，本发明特提供一种基于上述秀丽隐杆线虫模型的筛选抗肿瘤药物的试剂盒，使用该试剂盒能够快速、准确、方便地筛选抗肿瘤药物，本发明同时提供上述试剂盒的使用方法。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种筛选抗肿瘤药物的试剂盒，使用该试剂盒能够筛选出抗肿瘤药物。本发明的另一个目的是提供上述筛选抗肿瘤药物的试剂盒的使用方法。本发明提供一种筛选抗肿瘤药物的试剂盒，所述试剂盒包括以下试剂：①试剂A：秀丽隐杆线虫；②试剂B：大肠杆菌OP50；所述试剂B为含有大肠杆菌OP50活菌的冻干粉或菌液。其中，所述秀丽隐杆线虫的浓度为80-100条/20μl，大肠杆菌OP50的浓度为10mg/ml。所述秀丽隐杆线虫为同步化线虫，秀丽隐杆线虫同步化的步骤如下：用M9缓冲液将平板上的秀丽隐杆线虫冲下来，将冲洗液吸入离心管；4000rpm/min离心3min，去除上清；加入终浓度为3.2％NaClO和1MNaOH的裂解液；在涡旋仪上震荡7min，使秀丽隐杆线虫的虫体破裂释放卵；4000rpm/min离心3min，去除上清，收集沉淀获得大量的秀丽隐杆线虫卵；M9缓冲液冲洗两次，加入1mlM9缓冲液，置于20℃培养箱中孵化48小时。本发明还提供一种筛选抗肿瘤药物的试剂盒的使用方法，即上述试剂盒的使用方法：使用96孔细胞培养板，每孔中的终体积为200μl；每孔加入160μl的待测药液，加入20μl秀丽隐杆线虫液，再加入20μl大肠杆菌OP50菌液，每个处理设三个重复，放置到20℃生化培养箱中培养；培养至成虫后，在倒置显微镜下观察秀丽隐杆线虫野生型和突变体数目；野生型％＝100×野生型线虫数/线虫总数(即：野生型数目+突变体数目)；与空白对照相比，野生型比率越高表示药物抗肿瘤的效果越好。本发明的有益效果在于：本发明提供一种基于秀丽隐杆线虫模型的筛选抗肿瘤药物的试剂盒，该试剂盒检测结果准确，使用方法简单，适合在筛选抗肿瘤药物的领域大规模推广。以下提供具体实施例以实现本发明所述的筛选抗肿瘤药物的试剂盒，但不限于这些实施例。附图说明图1索拉非尼对RAS过度激活let60/ras(gf)多阴门突变体MT2124的作用图2索拉非尼对RAF下游的转录因子lin-31(gf)多阴门突变体MT301的作用图3依托泊苷对RAS过度激活let60/ras(gf)多阴门突变体MT2124的作用图4依托泊苷对RAF下游的转录因子lin-31(gf)多阴门突变体MT301的作用具体实施方式1.实验生物：秀丽隐杆线虫MT2124：多阴门表型，基因型：let-60(n1046sd,gf)IV，购买于TheCaenorhabditisGeneticsCenter(CGC)。秀丽隐杆线虫MT301：多阴门表型，基因型：lin-31(n301)II，购买于TheCaenorhabditisGeneticsCenter(CGC)。细菌株：尿嘧啶渗漏突变型大肠杆菌OP50，购买于TheCaenorhabditisGeneticsCenter(CGC)。2.培养基：NGM培养基：NaCl1.5g，K2HPO41.3g，KH2PO48.5g，蛋白胨1.4g，琼脂粉8.5g，蒸馏水500mL。灭菌后加入过滤除菌的500μL胆固醇(5mg/ml，无水乙醇配制)，高压蒸汽灭菌的500μL1mol/LMgSO4，500μL1mol/LCaCl2。M9缓冲液：NaCl1.98g，Na2HPO42.38g，KH2PO41.20g，MgSO40.048g，蒸馏水400mL。LB液体培养基：NaCl2g，蛋白胨2g，酵母膏1g，蒸馏水200mL。溶解后用1MNaOH调节pH为7.0，高压蒸汽灭菌。3.试剂：索拉非尼：纯度≥98％，购自大连美仑；依托泊苷注射液：江苏恒瑞，批号：vp101202，购于兰州大学第一医院。4.仪器：高压灭菌锅(上海申安医疗器械厂)单人单面超净台(苏州净化设备厂)生化培养箱(宁波江南仪器厂)隔水式恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)连续变倍体视显微镜(上海一恒科学仪器有限公司)离心机(CT15E，日立)电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)实施例1秀丽隐杆线虫的同步化秀丽隐杆线虫同步化的步骤如下：用M9缓冲液将平板上的秀丽隐杆线虫冲下来，将冲洗液吸入离心管；4000rpm/min离心3min，去除上清；加入终浓度为3.2％NaClO和1MNaOH的裂解液；在涡旋仪上震荡7min，使秀丽隐杆线虫的虫体破裂释放卵；4000rpm/min离心3min，去除上清，收集沉淀获得大量的秀丽隐杆线虫卵；M9缓冲液冲洗两次，加入1mlM9缓冲液，置于20℃培养箱中孵化48小时。实施例2试剂盒的装配本发明所述的一种筛选抗肿瘤药物的试剂盒，该试剂盒包括以下试剂：①、试剂A：秀丽隐杆线虫；②、试剂B：大肠杆菌OP50；其中，所述试剂B为含有大肠杆菌OP50活菌的冻干粉或菌液。所述秀丽隐杆线虫的浓度为80-100条/20μl，大肠杆菌OP50的浓度为10mg/ml。本领域技术人员可根据具体研究内容，选用类似株系，而不局限于本发明实施例中所述的秀丽隐杆线虫株系。实施例3试剂盒的使用方法使用96孔细胞培养板，每孔中的终体积为200μl；每孔加入160μl的待测药液，加入20μl秀丽隐杆线虫液，再加入20μl大肠杆菌OP50菌液，每个处理设三个重复，放置到20℃生化培养箱中培养；培养至成虫后，在倒置显微镜下观察秀丽隐杆线虫野生型和突变体数目；野生型％＝100×野生型线虫数/线虫总数(即：野生型数目+突变体数目)；与空白对照相比，野生型比率越高表示药物抗肿瘤的效果越好。实施例4试剂盒效果验证实验本试剂盒对所选常规抗肿瘤药物进行了抗肿瘤药效筛选的效果验证。实验步骤：1.含有待测药物的溶液的制备索拉菲尼、依托泊苷注射液将上述待测药物溶解，滤去杂质，将滤液稀释至各浓度梯度待用。本领域研究人员可根据实验需要，自行调整浓度范围。2.抗肿瘤药效分析实验(1)索拉菲尼抗肿瘤药效分析索拉非尼，是Bayer和Onyx公司共同研制的一种多靶点的生物靶向新药，临床前研究和临床试验提示索拉非尼有广泛的抗肿瘤作用。研究表明：在具有RAS或B-RAF基因突变的肿瘤中观察到了索拉非尼的抗肿瘤活性，索拉非尼可通过抑制RAF活性从而阻断了RAF/MEK/ERK信号传导通路，抑制肿瘤细胞的增殖，直接抑制肿瘤生长。因此，应用本发明提供的抗肿瘤试剂盒评价索拉非尼对RAS过度激活let60/ras(gf)多阴门突变体MT2124和RAF下游的转录因子lin-31(gf)多阴门突变体MT301的影响。结果表明：索拉非尼能够明显逆转RAS过度激活let60/ras(gf)多阴门突变体MT2124的表型，且呈剂量依赖关系(图1，p<0.01)。然而，索拉非尼对RAF下游的转录因子lin-31(gf)多阴门突变体MT301的表型几乎没有影响(图2，p＞0.05)这与先前所研究的索拉非尼靶向RAF/MEK/ERK结果相一致。(2)依托泊苷抗肿瘤药效分析依托泊苷为细胞周期特异性抗肿瘤药物(Meleyetal.,2010)，其作用机制主要为抑制DNA拓扑异构酶Ⅱ，从而干扰DNA结构和功能。它并不像索拉非尼一样，是一个信号通路靶向药物，而是一个细胞毒的抗癌药物，因此，该药物的抗癌作用机制并不依赖细胞信号通路。应用本发明提供的抗肿瘤试剂盒检测依托泊苷对RAS过度激活let60/ras(gf)多阴门突变体MT2124和RAF下游的转录因子lin-31(gf)多阴门突变体MT301的影响。结果表明：依托泊苷明显逆转了两株突变体的多阴门表型，并呈药物剂量依赖关系(图3和4，p<0.01)。由上述实验数据结果可以得出，使用本发明公开的试剂盒对现有抗肿瘤药物进行检测，其抗肿瘤效果的预计结果与现有文献结论一致。由此证明本发明的试剂盒可以被用于筛选抗肿瘤药物，且结果准确，使用方法简便，易于掌握，适合在筛选抗肿瘤药物领域大规模推广。