技术领域本发明涉及食品领域，尤其涉及一种区别巴氏杀菌乳和超高温灭菌乳的方法。
背景技术：
由于乳蛋白的氨基酸组成与人体需要颇为接近，因此被誉为“理想蛋白质”。牛乳中蛋白质含量高，尤其生鲜牛乳中还富含多种生物活性成分以及人体所需的各种氨基酸等。为确保乳制品的质量与安全，延长产品货架期，作为原料的生鲜牛乳均需要经过适当的热处理在一定程度上杀灭微生物。热处理不足就无法有效杀死牛乳中的有害微生物，而过度加热又会导致牛乳中营养成分部分或全部损失甚至产生有害物质。因此需要科学地选取合适的热处理工艺参数，使其既能保证在一定程度上杀灭乳中的有害微生物，同时又能尽量减少营养成分的损失和有害物质的产生。1864年法国化学家与微生物学家路易斯·巴斯德发明了巴氏消毒法(或巴氏杀菌法，pasteurization)，即用较低温度(如60-90℃)的短时加热来杀死液体中的微生物同时又保持其中绝大部分营养物质和风味。最初这个方法被应用在酒类(如葡萄酒和啤酒)的消毒保存，后来才被用于牛奶的杀菌。牛奶的传统杀菌方法是煮沸，但这种加热温度偏高，会使生鲜牛奶中的营养物质遭到较大的破坏(如蛋白质凝固、氨基酸和维生素损失)。早期用于牛奶的巴氏杀菌工艺为低温长时(63℃保持30min)的间歇式生产方法，但由于热处理时间长，生产效率低，目前液体乳生产上基本上不使用这种工艺。现在工业生产鲜牛乳的巴氏杀菌工艺通常为高温短时的连续式生产方法，即72-75℃保持15-20秒，实际的温度/时间组合会根据原乳质量、加工的产品类型以及要求保存特性的不同而变化，但温度不会超过90℃。超高温灭菌法(UHT)：通常要经过135℃以上高温并持续数秒。这种方法对乳中的营养成分损害较大，但同时能极大的延长乳制品的货架期。而“复原乳”则相当于经过两次超高温灭菌加工。以上热加工方式各有不同的应用，从而满足不同的消费需求，我们需要合理评价不同的热处理程度对乳制品带来的影响，从而选择合适的热处理方式和程度应用于不同的产品和需求。根据国际乳品联合会(IDF)1981年第130号资料，UHT灭菌法使乳清蛋白的变性率可达59.4％～71.1％；羟甲基糠醛(HMF)含量比巴氏杀菌法增加1～3倍；含硫氨基酸、赖氨酸损失严重；对维生素B1、维生素C和叶酸的破坏高于巴氏杀菌法1.5～7倍，易被人吸收的可溶性钙损失较大。而“复原乳”经过两次超高温处理后，其营养价值损失更大。氨基酸是构成蛋白质的基本单位，它参与生物体内的新陈代谢和生理过程。不同的氨基酸比例、排列方式组成不同类别的蛋白质，它们在维持机体组织生长、更新、参与各种化学反应、提供生理活动所需要的热能等方面发挥着重要作用。游离氨基酸是人体可直接吸收的营养成分，它的含量和成分能够部分地反映出食品的营养价值。组成人体内生命物质的20种氨基酸，除甘氨酸外都有两种互成镜像的对映的L-和D-型结构。动物实验表明D-氨基酸可能阻断一些重要生理物质的合成，还能抑制动物的生长，D-氨基酸构成的蛋白质多肽通常不被或缓慢地被肽酶水解；肝、肾中的D-氨基酸氧化酶能使D-氨基酸脱氨转化从而消除其毒性。牛乳中含有少量的D-氨基酸是正常现象，如部分种类的D-氨基酸含量较高可能与细菌引起的乳房炎有一定关系，并且在一定时间范围内，D-氨基酸含量会随着牛乳存储期的延长而增加，如D-丙氨酸。因此，D-氨基酸含量可能可以作为乳制品细菌污染程度或货架期的一个指标。另据报道健康牛初乳中D-氨基酸的含量较高，大约可达健康牛非初乳的5倍。此外也有研究报道加热和发酵等加工处理会增加乳中某些D-氨基酸的相对含量，如D-谷氨酸、D-天门冬氨酸、D-丙氨酸、D-丝氨酸以及D-色氨酸等。牛乳热处理强度评价的指示物通常包括两类：一是牛乳中原先没有、经热处理后形成的新物质，如糠氨酸含量及其与乳果糖的相对含量、羟甲基糠醛的含量；二是牛乳中本身含有的、热处理过程中含量或活性发生变化的成分，如未变性的α-乳白蛋白的相对含量、纤溶酶活和同工酶活以及色氨酸的相对荧光值等热值指标。具体情况如下：糠氨酸：糠氨酸作为牛乳热加工过程中蛋白质与乳糖形成的特征产物，温度越高，美拉德反应越强烈，牛乳中形成的糠氨酸含量也就越高，且随着储存时间延长而增加。另外牛乳加热过程中，部分乳糖异构为乳果糖。中华人民共和国农业行业标准NY/T939-2005《巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳中复原乳的鉴定》中就以糠氨酸含量和乳果糖含量作为热值指标。糠氨酸含量基于高效液相色谱-紫外检测法检测；而乳果糖经β-D-半乳糖苷酶水解后生成半乳糖和果糖，通过酶法测定产生的果糖量来计算牛乳中乳果糖含量。当巴氏杀菌乳中每100g蛋白质中糠氨酸含量大于12mg时，则鉴定为含有复原乳；生乳经UHT灭菌处理后，乳果糖含量应低于600mg/L，当UHT灭菌结束时乳每100g蛋白质中糠氨酸含量为140-190mg时，乳果糖含量(mg/L)与糠氨酸含量(每100g蛋白质所含毫克数)比值小于2或UHT灭菌结束时乳每100g蛋白质中糠氨酸含量大于190mg时鉴定为UHT灭菌乳中含有复原乳。羟甲基糠醛(HMF)：HMF是美拉德反应(氨基和羰基反应)的中间产物，原料奶中并不含HMF，加热处理或长时间贮藏过程中才会产生该物质，加热过程中HMF的产生与加热处理的温度和时间有关。因此有研究建立了前表面荧光-HMF含量模型来评价商业乳品的热处理程度，预测不同热处理加工的商业乳品的HMF含量。α-乳白蛋白：牛乳热处理过程中，随着蛋白去折叠化和疏水基团的暴露，β-乳球蛋白首先形成小的聚合体，并随着热处理强度的增强，即温度升高或受热时间的延长，逐步形成变性程度更大的β-乳球蛋白聚合物。随着温度的进一步升高，α-乳白蛋白也开始变性，并逐渐与β-乳球蛋白聚合物形成复合物，导致α-乳白蛋白的相对含量呈线性下降。因此有研究发现可以结合Native-PAGE电泳定性分析和AlphaEaseFC软件的灰度分析对牛乳中的α-乳白蛋白进行定量分析从而判断牛乳的热处理程度。纤溶酶活性：作为牛乳成分中研究较为全面且又相对重要的一种内源性蛋白酶，纤溶酶能够在较宽的温度范围内保持稳定，巴氏杀菌对其活性影响不大，超巴氏杀菌(125℃，15s)和UHT灭菌在使β-乳球蛋白变性条件下纤溶酶活性仍有部分存活。因此，有研究发现纤溶酶也可以作为一种内源性热敏感指示物，根据其耐热性以及热处理过程中活性的变化，来对巴氏杀菌乳、超巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳等不同热处理强度的牛乳样品进行辨别。同工酶活性：也有研究发现可以通过不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳法，对乳制品中同工酶(如6-磷酸葡萄糖脱氢酶、乳酸脱氢酶)的染色，来区分巴氏杀菌乳和超高温灭菌乳。不同种类的酶对高温的耐受能力不同，有的酶在较低的温度下就完全失活，而有的酶在较高的温度才会完全失活：如生乳中6-磷酸葡萄糖脱氢酶和乳酸脱氢酶的活性均较高；巴氏杀菌乳中乳酸脱氢酶活性较弱而6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活性依旧很强，UHT灭菌乳中乳酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶都完全失活。此外乳中酶很大一部分是同工酶且电泳灵敏度较高，因此，可以通过同工酶电泳法检测不同同工酶的活性来判断牛乳的受热程度。色氨酸和糠氨酸的相对荧光值：可以通过比较色氨酸的相对荧光值(反映蛋白质的变性程度)和糠氨酸的相对荧光值(反映美拉德反应产物的积累)来评估乳制品的热处理程度以及判断是否掺有复原乳。以上热处理程度的评价方法各有优缺。糠氨酸法方法成熟，有相关行业标准，判别巴氏杀菌乳与UHT灭菌乳中复原乳的依据非常明确，热处理程度与糠氨酸含量存在非常明显的正相关，检测结果准确度和精确度较高。但该法对样品的前处理复杂，耗时长(24h)，且没有明确巴氏杀菌乳和UHT灭菌乳的区别方法。羟甲基糠醛含量法可以结合前表面荧光检测来预测不同热处理加工的商品乳中的羟甲基糠醛含量，但所用的数据模型较复杂，且对热处理方式的区别和程度的评价尚不甚明确。α-乳白蛋白法、纤溶酶法和同工酶电泳法都是从酶活角度考察，但影响蛋白活性和酶活的因素比较多，这几种方法操作也比较麻烦，而且很费时，运用在奶业的现场监测上不是很方便。荧光物质检测法灵敏度高、检测时间短，但稳定性差，对于长时间存放的UHT灭菌乳检测不理想，此外对于泌乳初期乳样的检测结果易受此时含量较高的固醇类激素影响而导致误判，也会由于不同季节奶牛摄入的人工饲料和多汁草料不同而出现乳样营养成分随季节变化的情况，从而影响检测结果。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中巴氏杀菌乳和超高温灭菌乳的区别方法不明确以及对于乳制品热处理程度评价方法存在操作繁琐、耗时较长等缺陷，提供一种区别巴氏杀菌乳和超高温灭菌乳的方法。本发明的方法能够准确区分巴氏杀菌乳和超高温灭菌乳，特别寻找到有效的牛乳热处理效果评价指标。本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：本发明提供了一种区别巴氏杀菌乳和超高温灭菌乳的方法，其包括下述步骤：分别检测生乳样品和杀菌乳中某D型氨基酸占该种氨基酸总量的百分比，分别记为Dx0％和Dx1％，所述的D型氨基酸为D-精氨酸、D-天门冬氨酸、D-谷氨酰胺和D-丝氨酸中的一种或多种；所述的杀菌乳是将所述的生乳样品进行巴氏杀菌或超高温灭菌得到的乳制品；所述的Dx0％和Dx1％是指各测试3次以上取的平均结果值；根据D型氨基酸的百分比Dx1％和Dx0％在95％的置信水平上是否具有统计学意义的显著性差异来判断杀菌乳是超高温灭菌乳还是巴氏杀菌乳，当二者没有统计学意义的显著性差异(P≥0.05)时，判断杀菌乳是巴氏杀菌乳；当二者有统计学意义的显著性差异(P<0.05)时，判断杀菌乳是超高温灭菌乳。本发明中的P值即统计学上常用的P值，为结果可信程度的一个递减指标，是将观察结果认为有效即具有总体代表性的犯错概率。P值越大，越不能认为样本中变量的关联是总体中各变量关联的可靠指标。如P＝0.05提示样本中变量关联有5％的可能是由于偶然性造成的。本发明中的P值采用统计学方法计算，即通常使用的MicrosoftExcel软件、SPSS软件、SAS软件等均可进行差异显著性的检验以及P值的计算。本发明中，两个热处理组之间的差异的检验使用双尾成组学生T检验方法，三个及以上热处理组之间差异的检验使用单因素方差分析法。其中进一步优选，当D-天门冬氨酸的百分比变化值△Dx％＝100％×(Dx1％-Dx0％)/Dx0％超过±5％，和/或，当D-精氨酸、D-谷氨酰胺和D-丝氨酸中的一种或多种的百分比变化值△Dx％＝100％×(Dx1％-Dx0％)/Dx0％超过±10％，且所述的百分比变化值引起的差异具有统计学意义(P<0.05)时，判断杀菌乳是超高温灭菌乳。其中进一步优选，当D-精氨酸、D-天门冬氨酸、D-谷氨酰胺和D-丝氨酸中的一种或多种的百分比变化值△Dx％＝100％×(Dx1％-Dx0％)/Dx0％不超过±5％，且所述的百分比变化值引起的差异没有统计学意义(P≥0.05)时，判断杀菌乳是巴氏杀菌乳。其中较佳地，所述的Dx0％和Dx1％是指各测试6次以上取的平均结果值。本发明中，根据本领域常识，所述的某D型氨基酸占该种氨基酸总量的百分比按照下述公式计算Dx％＝100％×[Dx]/([Dx]+[Lx])，其中，[Dx]是指D型某种氨基酸的检测含量，[Lx]是指L型某种氨基酸的检测含量，[Dx]+[Lx]是指该种氨基酸的总含量。其中，所述的巴氏杀菌可为本领域常规的巴氏杀菌，一般是指在70～90℃条件下杀菌10～20s。其中，所述的超高温灭菌可为本领域常规的超高温灭菌，一般是指在135～150℃条件下杀菌1～4s。其中，所述的生乳样品可为本领域常规的生乳样品，一般是指符合中华人民共和国国家标准GB19301-2010《食品安全国家标准——生乳》的生乳，所述的生乳样品的参数指标优选为：蛋白质≥2.8g/100g，脂肪≥3.1g/100g，非脂乳固体≥8.1g/100g，杂质度≤4.0mg/kg，微生物菌落总数≤2×106CFU/g。其中，所述的检测的方法较佳地包括下述步骤：(1)制备待测样品：将乳品去除脂肪和蛋白质并提取游离态氨基酸，得到待测样品；所述的乳品为生乳样品或杀菌乳；(2)衍生：将标准氨基酸和步骤(1)的待测样品分别进行衍生，衍生的条件如下：采用N-异丁酰基-L-半胱氨酸与邻苯二甲醛联合衍生，内标物为L-高精氨酸；(3)分离检测：采用高效液相色谱-荧光检测方法分离检测氨基酸，得到待测样品的色谱图与标准氨基酸的色谱图，通过绘制标准曲线来计算乳品中各氨基酸的含量：通过标准氨基酸的色谱图，以某种标准氨基酸(sAAx)与内标物L-高精氨酸的色谱峰面积之比值(AsAAx/AL-Homo)对反应体系中该标准氨基酸与内标物L-高精氨酸的最终加入量之比值(NsAAx/NL-Homo)作图拟合作标准曲线，并通过待测样品的色谱图计算待测样品的该氨基酸(AAx)与内标物L-高精氨酸的色谱峰面积之比值(AAAx/AL-Homo)，通过标准曲线得出待测样品中对应的该氨基酸的最终加入量和内标物最终加入量的比值(NAAx/NL-Homo)，从而得到待测样品中该氨基酸的含量；其中，高效液相色谱的条件如下：流动相A为pH值为5.90～6.10、钠离子浓度为20～25mmol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液，流动相B为甲醇与乙腈的体积比为12:1的混合溶剂，以流动相A与流动相B按照下述体积比进行梯度洗脱：0min:(95～100)％A+(0～5)％B→15min:(84～88)％A+(12～16)％B→(45～55)min:(75～78)％A+(22～25)％B→90min:(30～46)％A+(54～70)％B→95min:(30～46)％A+(54～70)％B；流速为0.6～1mL/min。本发明中，所述的将乳品去除脂肪和蛋白质并提取游离态氨基酸可按本领域常规方法进行，较佳地通过下述步骤进行：将乳品离心，撇去上层脂肪后，与0.1mol/L盐酸按照1g:(0.5～2)mL的比例混合均匀后再加入三氯乙酸使三氯乙酸终浓度为3～10％，静置使蛋白质完全沉淀，离心后取上清液，用孔径为0.22μm滤膜过滤得到的滤液即为待测样品，更佳地通过下述步骤进行：将乳品于4℃条件下以5000×g离心30min，撇去上层脂肪后，与0.1mol/L盐酸按照1g:1mL的比例混合均匀后，再加入三氯乙酸使三氯乙酸终浓度为5％，振荡使充分混匀后于4℃静置4～24h使蛋白质完全沉淀(更佳的静置时间为12h)，再于4℃条件下以(9000～20000)×g离心10～30min后取上清液(更佳地为15000×g离心20min)，用孔径为0.22μm滤膜过滤得到的滤液即为待测样品。待测样品于-85～-18℃保存(更佳地为不高于-80℃保存)；所述的终浓度是指质量百分比浓度。本发明中，步骤(2)中，将标准氨基酸进行衍生较佳地通过下述步骤进行：用孔径为0.22μm滤膜过滤如下试剂：硼酸-硼酸钠缓冲溶液、含200～300mmol/LN-异丁酰基-L-半胱氨酸的硼酸-硼酸钠缓冲溶液、含150-200mmol/L邻苯二甲醛的硼酸-硼酸钠缓冲溶液、含0.3～0.5mmol/L内标物L-高精氨酸的0.1mol/LHCl溶液以及含有标准氨基酸的0.1mol/LHCl溶液，然后按照体积比13:1:1:1:8混合，振荡混匀，避光条件下静置发生衍生反应；所述的硼酸-硼酸钠缓冲溶液的浓度为0.01～0.5mol/L，pH值为10.0～10.8。步骤(2)中，将标准氨基酸进行衍生更佳地通过下述步骤进行：用孔径为0.22μm滤膜过滤如下试剂：硼酸-硼酸钠缓冲溶液、含260mmol/LN-异丁酰基-L-半胱氨酸的硼酸-硼酸钠缓冲溶液、含170mmol/L邻苯二甲醛的硼酸-硼酸钠缓冲溶液、含0.4mmol/L内标物L-高精氨酸的0.1mol/LHCl溶液以及含有标准氨基酸的0.1mol/LHCl溶液，然后按照体积比13:1:1:1:8混合，振荡混匀，避光条件下静置发生衍生反应；所述的硼酸-硼酸钠缓冲溶液的浓度为0.01～0.5mol/L，pH值为10.0～10.8。本发明中，步骤(2)中，将步骤(1)的待测样品进行衍生较佳地通过下述步骤进行：按照上述标准氨基酸衍生的方法，将所述的含有标准氨基酸的0.1mol/LHCl溶液替换为含有待测样品的0.1mol/LHCl溶液，即可。上述步骤(2)中，所述的硼酸-硼酸钠缓冲溶液的浓度较佳地为0.05mol/L，pH值较佳地为10.4；所述的振荡较佳地采用旋涡振荡器进行振荡，振荡的时间较佳地为10～60s，更佳地为30s；所述的衍生反应的时间较佳地为1.5～18min，更佳地为5min；所述的衍生反应的温度较佳地为16-30℃，更佳为21～25℃。本发明中，硼酸-硼酸钠缓冲溶液的浓度是指共轭酸碱的总浓度。其中，所述的高效液相色谱的色谱柱可采用本领域常规使用的各种色谱柱并配以保护柱，较佳地为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱和保护柱，所述的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱较佳地为规格5μm、150×4.6mm的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，所述的保护柱较佳地为规格5μm、12.5×4.6mm的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱。色谱柱的柱温较佳地为16～35℃，更佳地为25℃。进样量较佳地为6～50μL，更佳地为15μL。其中，所述的流动相A较佳地为pH值为5.98～6.02、钠离子浓度为23mmol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液。其中，所述的流动相A与流动相B较佳地按照下述体积比进行梯度洗脱：0min:97％A+3％B→15min:85％A+15％B→50min:77％A+23％B→90min:40％A+60％B→95min:40％A+60％B。其中，所述的流速较佳地为1mL/min。其中，在所述的荧光检测方法中，荧光检测器的激发波长较佳地为220～250nm，更佳地为230nm；所述的荧光检测器的发射波长较佳地为415～485nm，更佳地为445nm。本发明中，L-Homo(L-homoarginine)即是指内标物L-高精氨酸，OPA(o-phthalicaldehyde)即是指邻苯二甲醛。本发明中所述的IBLC、OPA和氨基酸标准品(17种构成蛋白质的基本氨基酸及其手性异构体、甘氨酸以及作为内标物的L-高精氨酸)均为纯度≥97％的标准试剂(更佳地为≥99％、手性化合物的光学纯度≥99.5％)；盐酸、乙酸、乙酸钠和三氯乙酸等的纯度可采用本领域常规使用的纯度，较佳地为分析纯；甲醇和乙腈的纯度为本领域常规使用纯度，较佳地为色谱纯；除特殊说明外所有配制溶液的水按本领域常规均为超纯水(电阻率达18.2MΩ·cm)。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。本发明的积极进步效果在于：(1)本发明提供了一种针对巴氏杀菌乳和超高温灭菌乳的明确的区别方法。(2)本发明基于快速准确地对多种标准手性氨基酸进行同时的定性和定量分析，通过高效液相色谱检测液态乳中游离氨基酸的D、L型的含量比例这一相对指标来区别巴氏杀菌乳和超高温灭菌乳，普适性更强，适用于更多的常规实验室。(3)本发明在糠氨酸、乳果糖、羟甲基糠醛、α-乳白蛋白、纤溶酶活和同工酶活(6-磷酸葡萄糖脱氢酶和乳酸脱氢酶)等热值指标之外，为牛乳热处理程度的评价增加了一个新的指标。附图说明图1为36种标准氨基酸衍生物色谱图(其中加入的L-氨基酸的浓度为8μmol/L，L-高精胺酸为0.4mmol/L，D-氨基酸和甘氨酸均为4μmol/L，最终进样量分别为40，250，20和20pmol)。图2(A)为某牧场A某批次生乳样品及对其进行巴氏杀菌处理后样品中的各D-氨基酸的平均相对含量的图谱，图2(B)为某牧场B某批次生乳样品及对其进行巴氏杀菌处理后样品中的各D-氨基酸的平均相对含量的图谱(4℃是指新鲜榨取4℃保存的生乳样品，74℃是指74℃加热处理15s的巴氏杀菌乳样品，85℃是指85℃加热处理15s的巴氏杀菌乳样品，90℃是指90℃加热处理15s的巴氏杀菌乳样品；其中加入的内标物L-高精氨酸的浓度为0.4mmol/L，最终进样量为250pmol；各D-氨基酸的平均相对含量为6次平行实验的平均结果)。图3(A)为某牧场A生乳样品及对其进行超高温灭菌处理后样品中各D-氨基酸的平均相对含量的图谱，图3(B)为某牧场B生乳样品及对其进行超高温灭菌处理后样品中各D-氨基酸的平均相对含量的图谱(4℃是指新鲜榨取4℃保存的生乳样品，135℃是指135℃加热处理4s的超高温灭菌乳样品，其中加入的内标物L-高精氨酸的浓度为0.4mmol/L，最终进样量为250pmol；各D-氨基酸的平均相对含量为6次平行实验的平均结果)。图4为某批次经分别巴氏杀菌处理和超高温灭菌处理后的液态乳样品及其来源的生乳样品中各D-氨基酸的平均相对含量的图谱(A、B分别为两种加热杀菌方式中的一种，具体哪种未知，其中加入的内标物L-高精氨酸的浓度为0.4mmol/L，最终进样量为250pmol；各D-氨基酸的平均相对含量为6次平行实验的平均结果)。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明的实施例采用的试验条件如下：检测仪器：Agilent1260高效液相色谱系统，G1329B100孔自动进样装置，AgilentG1321B荧光检测器；色谱柱：美国安捷伦公司的XDBC18(150×4.6mm,5μm)液相色谱柱，保护柱为美国安捷伦公司的XDBC18(12.5×4.6mm,5μm)分析保护柱；柱温：25℃；流动相：流动相A为钠浓度23mmol/L的乙酸/乙酸钠缓冲液(pH值为6.00±0.02)，流动相B为甲醇/乙腈混合溶剂(v:v＝12:1)，流速为1mL/min；检测波长：设定激发波长为230nm，发射波长445nm；进样量：15μL。洗脱程序：洗脱步骤洗脱时间/min流速/(mLmin-1)A相比例B相比例10197％3％215185％15％350177％23％490140％60％595140％60％实施例1标准曲线的绘制：(1)氨基酸标准品的衍生：采用IBLC(N-异丁酰基-L-半胱氨酸)和邻苯二甲醛作为联合衍生剂，内标物为L-高精氨酸，衍生时间为5min，衍生温度为23±2℃，以上述衍生条件对35种混合氨基酸以及内标物L-高精氨酸标准溶液进行衍生，具体实施时采用下述方案：将预先用孔径为0.22μm滤膜过滤的如下试剂：0.05mol/L、pH值为10.4的硼酸/硼酸钠缓冲溶液(BB)、含260mmol/LIBLC的BB缓冲液、含170mmol/LOPA的BB缓冲液、含0.40mmol/L内标物L-Homo的0.1mol/LHCl溶液以及一系列含有不同浓度标准氨基酸的0.1mol/LHCl溶液(各L-氨基酸系列浓度分别为0、0.01、0.02、0.1、0.2、0.4、1、2、4、8、10、20、50、100和200μmol/L，各D-氨基酸和甘氨酸系列浓度分别为0、0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、5、10、25、50和100μmol/L)，然后按照体积比13:1:1:1:8混合，用旋涡振荡器振荡30s混匀，避光条件下静置使反应5min，衍生温度为23±2℃，进样15μL(其中IBLC：N-isobutyryl-L-cysteine，N-异丁酰基-L-半胱氨酸；OPA：o-phthalicaldehyde，邻苯二甲醛；L-Homo：L-homoarginine，L-高精氨酸)。注意根据每种样品中氨基酸的浓度，保证IBLC的终浓度能使样品中的氨基酸完全衍生。各标准氨基酸的较高浓度储备液的制备除天冬酰胺和谷氨酰胺用超纯水溶解以外，其他标准氨基酸均用0.1mol/LHCl溶解，于-85℃保存，使用前再按比例用0.1mol/LHCl稀释并混合。(2)氨基酸标准品的色谱检测：对上述某浓度比例衍生后的36种混合氨基酸(包括17种构成蛋白质的基本氨基酸及其手性异构体、甘氨酸以及作为内标物的L-高精氨酸)标准溶液进行色谱检测，得到36种标准氨基酸衍生物色谱图(如图1所示)。图1所示的为36种标准氨基酸衍生物色谱图，其出峰顺序、保留时间和分离度如下表1所示。表136种标准氨基酸的出峰顺序、保留时间和分离度表由上表可见，各峰之间的分离度都达到1.2，说明本发明的方法对这36种氨基酸均实现了较好的两两分离。(3)不同浓度氨基酸标准品(即标准氨基酸与内标物L-高精氨酸终浓度之比值不同的一系列标准样品，L-高精氨酸的加入量范围为200-500pmol)的色谱检测和标准曲线方程：对上述一系列不同浓度氨基酸标准品，以某种标准氨基酸(sAAx)与内标物L-高精氨酸的色谱峰面积之比值(AsAAx/AL-Homo)对反应体系中该标准氨基酸与内标物L-高精氨酸的最终加入量之比值(NsAAx/NL-Homo)作图拟合标准曲线。标准曲线呈现分段线性，当最终加入各标准氨基酸的量分别在0.1-10pmol和10-500pmol范围内时，各标准氨基酸与内标物L-高精氨酸的色谱峰面积之比值(AsAAx/AL-Homo)对反应体系中该标准氨基酸与内标物L-高精氨酸的最终加入量之比值(NsAAx/NL-Homo)呈线性关系，对各标准氨基酸的最低检测限均可达0.05pmol(即5×10-14mol，信噪比S/N＝3)，标准曲线方程如下表2所示：表2各氨基酸标准曲线方程的斜率、截距和R2值表实施例2生乳样品及其巴氏杀菌处理后样品的D-氨基酸相对含量的比较：(1)液态乳的热处理灭菌：将新鲜榨取的生乳样品进行巴氏杀菌处理，分(74℃，15s)、(85℃，15s)和(90℃，15s)三种不同的温度时间组合进行三种不同程度的热处理；另外留存部分新鲜榨取的生乳样品于(-85～-80)℃保存以待对照，实验前解冻后使其温度保持在4℃；(2)制备待测样品：生牛乳样品或其巴氏杀菌处理后的样品于4℃下以5000×g离心30min，撇去上层脂肪后，与0.1mol/L盐酸按照1g:1mL的比例混合均匀后，再加入一定量的三氯乙酸使三氯乙酸终浓度为5％，振荡使充分混匀后于4℃静置12h使蛋白质完全沉淀，再于4℃下以15000×g离心20min后取上清液，用孔径为0.22μm滤膜过滤得到的滤液即为待测样品，于-85℃保存；(3)待测样品的衍生：采用IBLC(N-异丁酰基-L-半胱氨酸)和邻苯二甲醛作为联合衍生剂，内标物为L-高精氨酸，衍生时间为5min，衍生温度为23±2℃，具体实施时采用下述方案：将预先用孔径为0.22μm滤膜过滤如下试剂：将0.05mol/L、pH值为10.4的硼酸/硼酸钠缓冲溶液(BB)、含260mmol/LIBLC的BB缓冲液、含170mmol/LOPA的BB缓冲液、含0.4mmol/L内标物L-Homo的0.1mol/LHCl溶液以及上述制备得到的待测样品按照体积比13:1:1:1:8混合，用旋涡振荡器振荡30s混匀，避光条件下静置使反应5min，衍生温度为23±2℃，进样15μL(其中IBLC:N-isobutyryl-L-cysteine，N-异丁酰基-L-半胱氨酸；OPA:o-phthalicaldehyde，邻苯二甲醛；L-Homo:L-homoarginine，L-高精氨酸)。注意根据每种样品中氨基酸的浓度，保证IBLC的终浓度能使样品中的氨基酸完全衍生；(4)测定：根据该生乳样品及其巴氏杀菌处理后样品中的17种氨基酸及其手性异构体和甘氨酸的HPLC测定曲线图谱(其中加入的内标物L-高精氨酸的浓度为0.4mmol/L，最终进样量为250pmol)中各色谱峰保留时间的归属以及峰面积，按照实施例1得到的各标准氨基酸的标准曲线方程，可以计算得到该生乳样品及其巴氏杀菌处理后样品中各氨基酸的含量，并计算各D-氨基酸的相对含量Dx％＝100％×[Dx]/([Dx]+[Lx])。图2即为某地区某两个牧场分别某批次的生乳样品及其巴氏杀菌处理后样品中各D-氨基酸的相对含量(6次平行实验的平均结果)。由图2可看出，生乳样品分别经这三种加热程度的巴氏杀菌处理后，其中各D-氨基酸的相对含量并没有发生明显变化，即它们之间的差异在95％的置信水平上没有统计学意义(P值均>0.05)。此外，表3(A)、表3(B)分别列举了来自A和B牧场的生乳经巴氏杀菌热处理后各D-氨基酸相对含量的变化幅度。表3(A)A牧场生乳经巴氏杀菌处理后各D-氨基酸相对含量的变化幅度表3(B)B牧场生乳经巴氏杀菌处理后各D-氨基酸相对含量的变化幅度注：所述差异指在95％置信水平；其中，***表示P<0.001；**表示0.001≤P<0.01；*表示0.01≤P<0.05；ns表示P≥0.05。P(4-90)：三组巴氏杀菌处理组(74℃*15s、85℃*15s、90℃*15s)以及未加热处理组(4℃保存)相比其差异显著性检验通过单因素方差分析得到的P值；P(4vs135)：UHT处理组(135℃*4s)以及未加热处理组(4℃保存)相比其差异显著性检验通过双尾成组学生T检验分析得到的P值。实施例3生乳样品及其超高温灭菌处理后样品的D-氨基酸相对含量的比较：将新鲜榨取的生乳样品按照(135℃，4s)的温度时间组合进行超高温灭菌处理；另外留存部分新鲜榨取的生乳样品于(-85～-80)℃保存以待对照，实验前解冻后使其温度保持在4℃。将上述生乳样品及其超高温处理后的样品按照实施例2中的待测样品制备、衍生方法和氨基酸分离测定方法进行这两种样品中17种构成蛋白质的基本氨基酸及其手性异构体以及甘氨酸的分析测定，并计算各D-氨基酸的相对含量Dx％＝100％×[Dx]/([Dx]+[Lx])。图3即为某地区某两个牧场分别某批次的生乳样品及其超高温灭菌处理后样品中各D-氨基酸的相对含量(6次平行实验的平均结果)。此外，表3(A)、表3(B)也分别列举了来自A和B牧场的生乳经UHT灭菌热处理后各D-氨基酸相对含量的变化幅度。由图3和表3可看出，生乳样品经超高温灭菌处理后，其中某些D-氨基酸(A牧场为D-Arg(-15.70％，P＝0.00002)、D-Asn(+14.36％，P＝0.00013)、D-Asp(+6.02％，P＝0.00009)、D-Gln(+14.91％，P＝0.00243)、D-Glu(-1.96％，P＝0.01965)、D-Phe(+79.85％，P＝0.00679)、D-Ser(-18.49％，P＝0.00000)；B牧场为D-Arg(-16.45％，P＝0.00450)、D-Asp(+11.92％，P＝0.00000)、D-Gln(+24.03％，P＝0.00012)、D-Ser(+64.83％，P＝0.01316)、D-Tyr(+1.97％，P＝0.03528))的相对含量发生了明显变化，即它们之间的差异在95％的置信水平上具有统计学意义(P<0.05)，两个牧场的样品都有明显变化的是D-Arg(变化幅度均超过10％)、D-Asp(变化幅度均超过5％)、D-Gln(变化幅度均超过10％)、D-Ser(变化幅度均超过10％)。而巴氏杀菌处理后这几种D-氨基酸的相对含量变化幅度都较小(多数不超过5％)，只除了其中一个牧场的D-Gln在巴氏杀菌处理后变化幅度较大(超过10％，但差异没有统计学意义)。D-Gln的这种较大的波动可能是由于水解作用使其与D-Glu相互转换。实施例4某牧场某批次生乳样品分别经巴氏杀菌处理和超高温灭菌处理后样品的区别：将两种未知方式热处理杀菌后的样品及其来源的生乳样品按照实施例2中的待测样品制备、衍生方法和氨基酸分离测定方法进行这两种样品中17种构成蛋白质的基本氨基酸及其手性异构体以及甘氨酸的分析测定，并计算各D-氨基酸的相对含量Dx％＝100％×[Dx]/([Dx]+[Lx])。图4即为某批次分别经巴氏杀菌处理和超高温灭菌处理的液态乳样品及其来源的生乳样品中各D-氨基酸的相对含量(6次平行实验的平均结果)。由图4看出，A图中加热杀菌处理后的样品中各D-氨基酸的相对含量与其来源生乳样品相比，并未发生具有统计学意义的明显变化，几种典型D-氨基酸相对含量的变化幅度分别为：D-Arg(-0.20％，P＝0.99089)、D-Asp(+3.22％，P＝0.82386)、D-Gln(+，P＝0.43659)、D-Phe(-44.76％，P＝0.64681)、D-Ser(+16.80％，P＝0.85548)。即它们之间的差异在95％的置信水平上没有统计学意义(P>0.05)。而B图分别为D-Arg(-14.67％，P＝0.00554)、D-Asp(+8.60％，P＝0.00009)、D-Gln(+18.87％，P＝0.00243)、D-Phe(+32.32％％，P＝0.00679)、D-Ser(+23.85％，P＝0.00000)，即这些D-氨基酸相对含量的差异在95％的置信水平上具有统计学意义(P<0.05)，其中与实施例3相似的是这些变化显著的D-氨基酸也包括D-Arg、D-Asp、D-Gln、D-Ser，且D-Asp变化幅度超过5％，其他三者的变化幅度均超过10％。因此相比较而言，A图中样品的热杀菌处理方式为巴氏杀菌，而B图中样品的热杀菌方式为超高温灭菌。该实验结果与实际情况相符。注：此处D-Gln在生乳(杀菌处理前)未检出，杀菌处理后有一定量，故加热处理使D-Gln增加，但由于处理前检测值为0，所以D％的变化率无法计算。