本发明涉及一种葡萄酒中氨基甲酸乙酯的高效样品前处理方法，同时采用气相色谱-质谱分析葡萄酒中氨基甲酸乙酯含量的检测技术。
背景技术：
氨基甲酸乙酯(EthylCarbamate，EC)是一种多位点致癌物，可导致肺癌、淋巴癌、肝癌、皮肤癌等疾病，经国际癌症研究机构(IARC)认定其为2A类致癌物。研究表明葡萄酒中的氨基甲酸乙酯有2个主要的形成途径：1、葡萄籽中的氰苷在酶的作用下降解产生氰化物，而后氧化为氰酸盐，再与乙醇反应生成氨基甲酸乙酯；2、酵母将葡萄汁中的精氨酸降解为尿素，尿素与乙醇反应生成氨基甲酸乙酯。由此可知，氨基甲酸乙酯是葡萄酒中不可避免的伴生产物。
氨基甲酸乙酯对人类的危害主要通过饮用酒精饮料造成，所以近年来欧美等国家严格制定了葡萄酒中EC的限量标准，其中加拿大、捷克等国规定佐餐葡萄酒中的EC含量不得超过30μg/L，美国则是不得超过15μg/L，而我国尚未制定葡萄酒中EC的限量标准。
目前，国内外检测葡萄酒中EC的前处理方法主要有以下方法：1、液液萃取。本方法不需要特殊设备，具有低成本的优点，但是液液萃取效率较低，往往需要复提一次，所以操作步骤较多、耗时较长、提取剂用量也较大；2、固相萃取。目前欧盟、美国和国际葡萄酒组织推荐的前处理方法就是固相萃取法，它集提取与净化于一身，但是本方法需用160mL二氯甲烷洗脱(二氯甲烷本身也是2A类致癌物，过多接触也不利于实验人员的健康)，所以需要进行旋转蒸发和氮吹两步浓缩，耗时长、处理效率低。3、固相微萃取。本方法不需要复杂的前处理，是完全自动化的过程，但是所用纤维价格昂贵，且使用次数有限，所以本方法不适合生产企业的日常检测。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有样品前处理技术处理时间长、消耗溶剂多等缺点和不足，为葡萄酒中氨基甲酸乙酯的检测提供一种简便高效的样品前处理技术。为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种对葡萄酒中的氨基甲酸乙酯进行固相支持液液萃取的前处理方法，所述方法包括如下步骤：
(1)提取与净化：称取葡萄酒样品，将所述葡萄酒样品加载到萃取柱上，然后静置，再用二氯甲烷洗脱；
(2)浓缩：将步骤(1)得到的洗脱液进行氮吹；
(3)除水：向步骤(2)得到的浓缩液中加入干燥剂，然后静置，用滤器进行过滤；
在步骤(2)中，将所述洗脱液氮吹至1mL。
本发明采用结合液液萃取和固相萃取优点的固相支持液液萃取方法。上样后，样液在萃取填料表面形成一层薄液膜，加入洗脱剂后，洗脱剂包裹在样品外部，两液膜之间进行微观的液液萃取。萃取填料是硅藻土，其天然微孔表面富含羟基，可以吸附水性样品溶液，形成液膜，洗脱有机溶剂与样品液膜间形成微观液液萃取，既避免了液液萃取振荡操作带来的乳化现象、提高萃取能力，又改善了现有固相萃取中使用大量提取剂的问题，节省溶剂、简化浓缩过程，提高前处理效率。
附图说明
图1为1000μg/L氨基甲酸乙酯标准品总离子流色谱图(上)和质谱图(下)。
具体实施方式
在一些现有的前处理方法，使用乙醚作为洗脱溶剂，但乙醚可能会对实验人员的身体健康产生不利影响。另外，采用乙醚进行洗脱得到的洗脱液在氮吹过程中需要吹至全干，再复溶于乙醇当中。这一过程存在以下两个可能影响测量准确性的问题：(1)氨基甲酸乙酯的沸点较低，氮吹至干可能会造成少量氨基甲酸乙酯的挥发；(2)由于生产工艺的原因，所用的乙醇中本身可能就含有低含量的氨基甲酸乙酯。
而在本发明中，采用了二氯甲烷作为洗脱溶剂，避免了乙醚的使用。并且，氮吹后得到的浓缩液可直接进行后续的处理步骤，不必在吹干后复溶于乙醇中。可见，现有的前处理方法中可能存在的问题均在本发明中得以避免。因此，本发明的前处理方法具备简单高效、有机溶剂用量小、无机盐用量小、浓缩步骤损失小、毒害小等多方面的优点。
在本发明的步骤(1)中，优选采用的静置时间为10-12min。如果静置时间过短，则无法使葡萄酒样品与萃取柱中的填料充分结合，造成后续的洗脱效果不佳；如果静置时间过长，则会造成不必要的时间浪费。
在本发明的步骤(1)中，相对于2g的葡萄酒样品，优选的二氯甲烷用量为12-15mL。如果二氯甲烷用量过小，则无法完全将样品中的待测物洗脱，造成测量结果偏小；如果二氯甲烷用量过多，则造成不必要的有机溶剂浪费，并且也使得氮吹时间增加。
在本发明的步骤(1)中，优选的二氯甲烷流速为1.5-2mL/min。如果流速过快，则无法完全将样品中的待测物洗脱，造成测量结果偏小；如果流速过慢，则会造成不必要的时间浪费。
实施例
接下来，通过实施例对本发明进行进一步详细地说明，但本发明不仅限于这些实施例。
实施例1
1.1仪器与试剂
7890A-5975C气相色谱-质谱仪(安捷伦公司)，12位负压SPE装置(博纳艾杰尔科技有限公司)，BSA224S-CW电子天平(赛多利斯集团)，TTL-DCII氮吹仪(同泰联科技发展有限公司)，QL-902旋涡混合器(海门其林贝尔仪器制造有限公司)。
氨基甲酸乙酯标准品(CAS51-79-6，AccuStandard公司)。
乙腈(色谱纯，Fisher公司)，二氯甲烷(色谱纯，ClemanChemical公司)，无水硫酸钠(分析纯，北京化工厂)，CleanertEC-SPE柱(博纳艾杰尔科技有限公司)。
葡萄酒样品购自超市。
1.2实验方法
1.2.1标准溶液的配制
储备液：准确称取氨基甲酸乙酯标准品0.0100g，加乙腈溶解并稀释至10mL，浓度为1000mg/L。冷冻贮存(-18℃以下)。
使用液：准确移取氨基甲酸乙酯储备液，用乙腈稀释为20μg/mL的使用液。冷冻贮存(-18℃以下)。
1.2.2样品前处理
(1)提取与净化：称取2g(精确到0.01g)均匀葡萄酒于10mL离心管中，涡旋混匀后，将酒样加载到萃取柱上，静置10-12min后，用12-15mL二氯甲烷洗脱，控制流速为1.5-2mL/min左右，全部洗脱液收集于试管中。
(2)浓缩：将洗脱液在30℃下温和氮吹至1mL。
(3)除水：向1mL浓缩液中加入0.7-0.8g无水硫酸钠，涡旋混匀后，静置3-5min。样品过0.22-0.45μm尼龙滤膜后，待GC/MS分析。
1.2.3仪器条件
色谱柱：VF-WAXms毛细管柱，30m×0.25mm×0.25μm，恒流模式，流速1.0mL/min；进样口：脉冲不分流模式，脉冲压力30psi，温度180℃，进样量2μL；升温程序：60℃保持1min，以5℃/min升至140℃，；后运行温度220℃，后运行时间10min；载气：He，纯度≥99.999％。质谱检测器检测条件：选择离子监测模式(SIM)，定量离子为62，定性离子为45、74、89；电子轰击离子源(EI)：70eV；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；接口温度：280℃；溶剂延迟：15min。
1.3方法的线性范围
在1.2的实验方法下，氨基甲酸乙酯的色谱峰形尖锐、对称，保留时间为16.2min左右。用乙腈将20μg/mL的标准使用液逐级稀释为浓度是1000、500、200、100、50、20、10、5、0μg/L的标准溶液，以氨基甲酸乙酯的峰面积对浓度绘制标准曲线，线性方程是y＝137.1x-680.3，回归系数R2＝0.998。1000μg/L氨基甲酸乙酯标准品色谱图和质谱图见图1。
1.4方法的加标回收和精密度实验
称取2g(精确到0.01g)均匀葡萄酒，添加标准使用液使样品的添加浓度分别为0.02mg/kg、0.05mg/kg、0.10mg/kg，按1.2的实验方法进行分析，各添加水平下扣空白后的平均回收率、相对标准偏差(RSD)与定量限(以定量离子10倍信噪比计，即LOQ＝10×S/N)见表1。
表1氨基甲酸乙酯添加回收实验的平均回收率、相对标准偏差与定量限