一种有、无受体二氧化钛纳米金属膜拉曼芯片及制作方法与流程

本发明涉及光谱分析技术中拉曼分析芯片领域，尤其涉及一种有、无受体二氧化钛纳米金属膜拉曼芯片及制作方法。

背景技术：

用表面近场增强拉曼散射(SERS)效应原理建立的表面近场增强拉曼光谱(SERSp)分析技术，最常采用的是一种用纳米银粒子与液相样品掺比混合吸进毛细管的拉曼样品池；此外有多种拉曼样品池技术方案已公开，例如：在毛细管内壁先构筑TiO₂纳米管阵列，通过Sn离子偶联再将银纳米粒子修饰在TiO₂管阵列表面的毛细管样品池“CN102706857A，一种多功能表面增强拉曼散射基底的制备方法”；在毛细管内制备三维多孔有序的SiO₂反蛋白石结构的光子晶体，再利用原位还原或者静电吸附方法在SiO₂反蛋白石结构内修饰金纳米粒子的毛细管样品池“CN103257134A，一种基于毛细管的表面增强拉曼散射基底的制备方法”；用纳米银粒子与液相样品掺比混合注入纳米金属柱群的小盒型微流通道拉曼芯片“CN203929645U，一种表面增强拉曼散射探测芯片及其制备方法”，等；当前，后三者的灵敏度比前者约低1～2个数量级。

多年来，在许多实验室的研究工作中开发、应用的在平板上制作“微米-纳米”的坑、三角形锥、纳米碳管、纤维丝等多种有序、无序阵列片基，或直接用滤膜、滤纸作片基，再滴上纳米银或金溶胶或修饰上银或金纳米粒子，作SERS基底；也有直接在透明平板上修饰银或金纳米粒子膜的SERS基底，有序的纳米坑、锥阵列SERS片基已有商品面市，使用者都需要自己配制银纳米溶胶使用，这不仅有需要自己配制银胶的不方便，而且增强因子对许多低丰度痕量样品分析灵敏度都还不够高。

当前，使用液相样品与银纳米粒子掺配混合注入各种拉曼样品池方式都存在三个局限和问题：一、银纳米粒子的拉曼增强活性功能容易被空气中的氧化过程衰降和破坏，其拉曼增强活性的储存寿命期限很短、大约两周，因此，至今尚无拉曼增强活性储存期长的银纳米粒子商品面市。许多拉曼分析研究室用的银纳米粒子多为自己配制，即配即用，此种情况在常规拉曼分析服务检测中是很不方便的，渴望有贮存活性期长的、使用方便的银纳米粒子-拉曼样品池芯片商品面市；二、对液相样品SERS定量检测低丰度痕量物质，不仅灵敏度还不够高，检测结果的均匀性、稳定性和重复性也不够好，定量分析是多年来尚未解决好的一个关键问题；三、对气相样品由于银粒子较大，将银纳米粒子掺配均匀混合气相样品非常困难，因此气相样品掺配混合银纳米粒子的拉曼样品池芯片均不适用。

国内外的微流控通道型的SERS拉曼芯片已公开的不外两种，其一是SERS金属纳米粒子在微流控通道内掺比与液相样品混合可以流动的拉曼芯片，其二是SERS金属纳米粒子在微流控通道内被修饰固定在微流控通道内，液相和气相样品均可在微流控通道内流动的拉曼芯片；国内前述例举CN102706857A，和CN203929645U即为其一，CN103257134A即为其二拉曼芯片。国外，如Tachan Park(Tachan Park(Tachan Park，Lab Chip，2005，5：437-442)报道的将银溶胶与两种寡核苷酸的混合溶液注入微流控通道即为前者拉曼芯片，此类方法与我们常规应用的液相样品与纳米银粒子掺比混合吸进毛细管的拉曼样品池有同样的局限和缺点；Gang L Li等(Appl.Phys.Lett.，2005，87，074101)报道的先用光刻技术在基板上先制备半球二甲基硅氧烷，再在其上用电子束蒸发局部沉积银纳米膜，组装成后一种微流控通道拉曼芯片，这种方法不仅工艺复杂、设备昂贵、灵敏度也不够高。

2004年发明人指导研究生发表论文“北京纳米结构和材料的光电子和光谱国际会议论文，SPIE，5635：31-37”中，已公开我们在理论模拟中发现的纳米“银箔/银粒子”-膜存在“常规热点”+“非常规热点”，此种结构设计热点的密集度特别高，其灵敏度将因此获得特别的增加。2013年，又指导研究生发表论文“J.Phys.Chem.C 2013，117，6861-6871，Controlled Preparation of Uniform TiO2-Catalyzed Silver Nanoparticle Films for Surface-Enhanced Raman Scattering”公开了可控制作均匀的二氧化钛SERS纳米银粒子膜论文，该论文初步研究了一些可控的生长方法，在二氧化钛纳米“银箔/银粒子”-膜的前期研究中是有很好进展的；但限于当时我们的认识水平局限，最关键的两项控制和三项最佳控制标准参量没有解决：一、影响SERS纳米银粒子膜质量最灵敏、最关键的、需要控制的环节——要求光催化控制生长实现多数银粒子紧挨、间隙接近0，＜3nm的同时，多数银粒子的直径与激励激光束的波长正好共轭——问题没有 解决；二、没有注意到二氧化钛薄膜厚度产生的多次反射，由于有银箔的反向反射参与，比较严重地干扰激励样品光束的相干性质量，从而降低SERS膜的增强效率，这个重要问题当时我们没有注意到，因而对二氧化钛膜厚的控制问题没有研究和解决；三、同样非常重要的是SERS膜的生产工艺全过程中有三个关键工艺的最佳控制标准参量没有讨论和提出，它对保证生产每件SERS膜的质量，特别是保证产品的一致性和稳定性非常重要，这是当前国内外开发高性能的SERS芯片尚未解决的难题，不解决此问题也就不能开发成为高性能的SERS芯片。

技术实现要素：

本发明一种有、无受体二氧化钛纳米金属膜拉曼芯片，拉曼芯片由两部分组成，载体和表面增强拉曼散射活性膜，简称为SERS-膜；载体有毛细管型、小盒型和微流控通道型三种类型，SERS-膜分为有和无“受体”修饰的二氧化钛纳米金属膜两种类型；SERS-膜在上述三种载体的内壁或透明窗口贴壁生长，其制作步骤：第一步采用溶胶凝胶方法镀二氧化钛纳米薄膜并散粒晶态化；第二步在二氧化钛薄膜表面用可控的光催化方法生长纳米金属膜，为纳米“银箔/银粒子”膜，它是高灵敏度的二层SERS-膜；第三步依据拉曼分析目标物“给体”分子的需要，利用“氢键结合力”或“免疫结合力”，将具有特异配位结合力的“受体”分子修饰在上述二层SERS-膜的表面，成为特异性好、超高灵敏度的三层SERS-膜，第三层的“受体”分子种类数根据拉曼分析多目标物“给体”分子种类数的需要设计，成为多受体修饰的三层SERS-膜，二层SERS-膜拉曼芯片是无受体修饰的拉曼芯片，它是有受体修饰的三层SERS-膜拉曼芯片生产过程中的中间产品，用三层SERS-膜组装成为超高灵敏度的三层SERS-膜拉曼芯片。

实现纳米“银箔/银粒子”膜是个难题，它的基本要求是：银箔很薄纳米级，银粒子又要很结实紧贴在银箔上紧挨，多数银粒子尺度又要与激励激光束的波长共振耦合；纳米“银箔/银粒子”二层SERS-膜的特征是，在透明度很好的玻璃基底上，贴壁镀二氧化钛溶胶-凝胶薄膜——经高温焙烤、退火，将其散点式的转化为锐钛矿型随机点阵斑点结晶化膜，薄膜厚度等于或接近激励激光束在薄膜中的半波长或四分之一波长——通过紫外光催化生长纳米“银箔/银粒子”膜，该方法利用锐钛矿型结晶化随机点阵的各斑点光催化效率很高，而该点阵背景基底仍为非晶化的二氧化钛凝胶薄膜，其光催化效率又极低的特性，自然生长出纳米“银箔/银粒子”膜，要求该膜的银箔很薄，多数银粒子紧挨，其银纳米粒子的直径等于或接近λ/2或λ/4。

目前，几乎所有高灵敏度的SERS拉曼活性基底都存在分析结果的重复性差、一致性和稳定性不好问题，用于绝对定量分析误差太大，这是一个十多年来学界、产家攻关未获结果的难题；其根本的原因是银粒子膜的制作要求十分精细、苛刻——要求银粒子的大小与激励激光束波长共振耦合的同时，银粒子必须紧挨，其间距≤2nm，难于做到，而且要求各块银粒子膜产品都能达到相同标准，就更难；如果银粒子的平均间距都大于4纳米，SERSp的拉曼信号就将下界一个数量级；因此，在SERS银粒子膜的制作工艺中如果没有严格的控制方法和控制标准，将无法解决SERSp分析结果的重复性差、一致性和稳定性问题。为解决此问题，本发明提出纳米“银箔/银粒子”二层SERS-膜及其最佳制作控制方法和创建最佳控制标准参量，其特征是：三项最佳设计指标：二氧化钛最佳膜厚d_best＝λ/2n或λ/4n，n是膜的平均折射率，银粒子的最佳直径φ_best＝λ/2或λ/4和银粒子的最佳间距Δ_best接近0≤2nm；在制作最佳纳米“银箔/银粒子”二层SERS-膜的关键工艺中，分别设置最佳控制标准参量，保证产品高灵敏度、高一致性、高稳定性：一、调整二氧化钛薄膜厚度d，是通过二氧化钛溶胶-凝胶制膜提拉速度，即液面脱离片基的速度υ完成的，膜厚d与液面脱离速度υ的关系d-υ曲线通过在线的预备实验建立；通过在生产线上创建最佳控制标准参量系统A循环的多次调正实验，建立最佳控制标准参量υ_st；通过实测薄膜的荧光可见透过率光谱曲线的理论拟合方法，给出膜厚d数值，当建立了薄膜透过率曲线的第一峰位W与d关系曲线之后，就可以比较简单地通过W直接读出薄膜的厚度d；最后通过A循环的调正，要求d_st等于或接近理论设计的最佳指标λ/2n或λ/4n；二、控制二氧化钛薄膜的最佳焙烤温度T_st和时间t_st，要求转化为散粒锐钛矿型晶化的随机点阵斑点的密度恰到好处，使实施光催化结果多数银纳米粒子的中心间距等于或接近λ/2或λ/4，在此条件下，当银粒子紧挨时，正好满足多数银纳米粒子的直径等于或接近λ/2或λ/4，创建最佳焙烤温度标准参量T_st和时间t_st，需要通过A循环的调正来完成；三、用在线创建最佳控制标准参量系统B循环的调正实验控制光催化生长时间τ，创建最佳控制标准两个参量：以在线检测的TiO₂-545nm谱线发射峰位为底的SPR峰 高H₅₄₅和光催化时间τ_st，前者为主，因为它直接与SPR相关，后者为辅是参考标准；实施上述三项最佳控制标准参量的总目的，达到或接近理论最佳设计的三项指标，其中最关键的是要使多数银纳米粒子紧挨，间隙接近0≤2nm，这是最重要的对拉曼增强因子影响最敏感的参量，通过原子力显微镜成像检测、分析，和紫外可见吸收光谱的检测，最后还需要通过R6g的SERSp有关的比较实验验证、确认。

为了超低丰度痕量分子的拉曼分析，需要在拉曼芯片二层SERS-膜的基础上，修饰第三层与检测目标物给体分子有特异结合位点的受体分子膜，其特征是，根据拉曼芯片分析检测目标“给体”分子的配位结合要求，和“氢键结合力”或“免疫结合力”方式的选择，利用氢键化学或免疫化学的已有经验，确定“受体”分子的种类，利用配位结合力修饰，将“受体”分子修饰在二层SERS纳米“银箔/银粒子”膜的表面，成为三层SERS-膜；在修饰某些三层SERS-膜时，需要预先修饰过渡偶联分子膜，而一些偶联分子膜的界面与纳米“银箔/银粒子”膜的银质界面亲和特性不如金质界面好时，需要在纳米“银箔/银粒子”膜上，镀一层金原子膜，使其成为纳米金属“银箔/银粒子镀金”膜。

为了实现对超低丰度痕量检测目标“给体”分子拉曼分析，氢键结合力和免疫结合力受体修饰的三层SERS-膜拉曼芯片可进一步提高其灵敏度、信噪比和特异性，在使用时需要配置样品浓缩、富集系统和清洗系统，其特征是，在有氢键结合力和免疫结合力受体修饰的三层SERS-膜拉曼芯片的进、出样品口，配置气相或液相样品可控微流动驱动器，驱使气相或液相样品的可控定量循环流动，使超低丰度痕量检测目标“给体”分子在三层SERS-膜表面的“热点”中有效实现“给体”分子的浓缩、富集，提高定量或半定量的拉曼分析灵敏度；随后，利用很低拉曼活性的气体或纯净水的流动，完成检测目的物拉曼谱背景分子的清洗，提高检测目标“给体”分子特征拉曼指纹谱的信噪比和特异性。

毛细管型二层SERS-膜拉曼芯片是中间产品，灵敏度高，重复性和一致性好，可以常年保持拉曼增强活性，使用很方便，其特征是，采用透明度很好的空心薄壁硬质中性玻璃或石英玻璃毛细管，常规管型为圆形也可设计为非圆形，管的内径约数百微米，管长一般为10～120公分，紧贴毛细管内壁用溶胶-凝胶法制作二氧化钛薄膜，经高温焙烤退火后转化为散粒品化薄膜，通过光催化生长纳米“银箔/银粒子”膜，其中多数银粒子紧挨、粒子尺度与激励激光束波长共轭；毛细管内用纯净水洗净后，氮气吹干，封口；毛细管的封口可用紧密盖封、腊封，和拉锥封，拉锥封的芯片拉曼活性储存寿命可已超过一年，在拉锥封口近处两端各刻一条细线痕，使用时在此线痕处扮断毛细管，打开封口，吸入液相样品或注入气相样品提供拉曼检测。

毛细管型拉曼芯片镀SERS-膜的方法和设备的特征是，利用可控镀膜提拉机与镀膜液虹吸系统，构建毛细管镀SERS-膜设备，将镀膜溶剂吸入/排出毛细管的方法制作SERS-膜，可控镀膜提拉机(5)有一个可控的垂直移动提拉部件，用于提拉被真空橡皮塞密封的移动液池(6)，将多根毛细管(1)垂直插入真空橡皮塞(10)内一小段，由镀膜提拉机控制的移动液池(6)与固定液池(7)用真空橡皮(8)连通，组成虹吸系统，在加入适量的镀膜溶液(9)之后，利用此虹吸镀膜系统，毛细管中液面的上下移动，驱使镀膜液在毛细管中的吸入/排出，用可控智能镀膜提拉机的参数设置，自动操作完成镀膜程序；溶胶-凝胶法制作毛细管中二氧化钛薄膜的最佳厚度的控制，通过调整毛细管中液面下降排出二氧化钛溶胶的速度完成；二氧化钛薄膜和修饰“受体”分子膜均用上述方法制作，只要通过镀膜提拉机控制参数适当设置即可自动完成；在完成最佳二氧化钛薄膜工序后，将毛细管取出放在高温烤炉中焙烤，精确控制在线的最佳焙烤温度T_st和时间t_st，使二氧化钛凝胶薄膜产生随机点阵散粒式的锐钛矿型结品化的转变；此后，再次放入毛细管镀膜系统，用硝酸银溶液，配置紫外灯光(11)照射，通过精确控制在线的最佳光催化时间τ_st光催化还原方法制作纳米“银箔/银粒子”膜，在镀纳米金属膜整个过程中，毛细管内需要更换多次新旧镀膜液，通过镀膜提拉机吸入/排出镀膜溶剂参数的设置、自动完成。

毛细管型拉曼芯片镀SERS-膜的另一个方法和设备的特征是，利用毛细管吸附力和精密调整氮气压力控制镀膜溶剂的吸入/排出毛细管的方法，将多根毛细管(1)一字型排列垂直插入真空橡皮塞(10)内一小段，氮气瓶(16)的精密调压阀(15)的管路连接到另一真空橡皮塞(10)，两个真空橡皮塞与有放气阀(12)的玻璃管组成一个密闭小室(14)，将毛细管的另一端浸入镀膜液池(13)二氧化钛溶胶液面下一小段，与镀膜液面倾斜大约15度，利用毛细管的表面吸附力将镀膜液吸入毛细管；通过调整氮气瓶的精密调压阀(15)，即可将二氧化钛溶胶以设置的最佳速度排出毛细管，最后一次排出二氧化钛溶胶速度将决定二氧化钛溶胶-凝胶粘附在毛细管内壁的厚度；在完成最佳厚度二氧化钛薄膜工序后，将毛细管 放在450度左右的烤炉中，精确调整在线的最佳焙烤温度T_st和时间τ_st，使二氧化钛凝胶薄膜产生随机点阵散粒式锐钛矿型结晶化的转变；此后，再次放入毛细管镀膜系统，用硝酸银配置紫外灯光(11)照射，通过光催化还原方法制作纳米“银箔/银粒子”膜；在毛细管型拉曼芯片二层SERS-膜的基础上修饰受体分子膜的方法与上述镀二氧化钛薄膜方法类同，一般修饰1种受体分子膜，当修饰大于2的多种受体分子膜时，例如多至3～5种，事先需要将它们混合在一起，再完成修饰，成为毛细管型多受体修饰的拉曼芯片；清洗毛细管拉曼芯片SERS-膜的过程，需将洗涤剂和纯净水通过的放气阀(12)灌入密闭小室(14)，然后，通过调整氮气精密调压阀完成清洗和吹干毛细管内壁。

小盒型多受体修饰的拉曼芯片的特征是，在小盒型拉曼芯片中，SERS-膜的基板与腔体采用分体设计，在镀二氧化钛纳米“银箔/银粒子”膜的工艺中，采用可控提拉镀膜机，在透明度很好的平片玻璃上制作二层SERS-膜，其上再修饰光栅式的多受体分子膜，一种受体分子膜修饰成光栅中的一条线，受体分子种类数可以多达数十，其修饰工艺，采用可控多喷墨针头，在小盒型的二层SERS-膜上，将多种受体分子溶胶写成光栅形多受体分子膜，在小盒型腔体上设计进、出样的孔道一对，再将光栅式多受体分子修饰的三层SERS-膜基板与小盒型腔体严密封装成光栅式修饰多受体小盒型拉曼芯片。

在微流控通道型拉曼芯片中修饰多受体的种类数，可以比小盒型多受体修饰的拉曼芯片设计更多的受体种类数，微流控通道型拉曼芯片修饰多受体种类膜成矩阵式的结构，其特征是，在微流控多通道型拉曼芯片中，将多通道结构设计成光栅形排列，在同一块二层SERS-膜的基础上，将多种受体修饰成矩阵式点线光栅形分布的三层SERS-膜，每条受体点线光栅上修饰多种不同种类受体，一种受体修饰成一个点斑，各条受体光栅之间的受体种类都不相同，总计最多修饰的受体种类数可以多至上百；修饰多受体的工艺，采用可控多喷墨针头，将多种受体分子溶胶写成矩阵式排列的多受体分子膜；微流控多通道的腔体也设计成间距相同的光栅形排列，进、出样口可设计成每条通道一对，也可以分组设计多对进、出样口，最后将矩阵式排列的多受体分子膜基板与微流控多通道腔体严密组装成矩阵式修饰多受体的微流控多通道拉曼芯片。

附图说明

图1纳米“银箔/银粒子”二层SERS-膜及其最佳制作控制方法和创建最佳控制标准参量

图2(A)二氧化钛膜厚～透射峰位关系曲线，利用透射光谱的透射峰位检测二氧化钛薄膜厚度，(B)前期实验结果，用于演示和方便说明在线创建W～d关系曲线

图3(A)创建在线荧光可见吸收光谱的SPR峰高最佳控制标准参量H₅₄₅、和光催化时间最佳控制标准参量τ_st，(B)前期实验结果，用于演示和方便说明在线创建H₅₄₅

图4利用可控镀膜提拉机和镀膜液的虹吸系统制作毛细管型拉曼芯片

图5利用毛细管吸附力和精确调整氮气压力控制制作毛细管型拉曼芯片

图6毛细管型SERS-膜拉曼芯片示意图

图7小盒型拉曼芯片制作工艺流程图

图8多种受体分子修饰微流控通道型拉曼芯片结构示意图

图9用相同浓度R6g10^-7Mol/L的(A)二层SERS-膜毛细管型芯片初步实验结果，与(B)毛细管掺配银纳米粒子样品池最佳的结果比较

图10初步研制的二层SERS-膜与毛细管掺配银粒子样品池的灵敏度的比较结果，(A)为用同一浓度R6g10^-6Mol/L检测的SERSp结果比较，(B)为用同一健康人的血清检测的SERSp结果比较

具体实施方式

1、毛细管型有、无受体二氧化钛纳米金属膜拉曼芯片的具体实施方法

毛细管型拉曼芯片的结构参见图6，毛细管(1)中镀TiO₂膜(2)，TiO₂膜上生长纳米“银箔/银粒子”膜(3)，该膜上修饰受体分子膜(4)，毛细管进、出样口密封段(5)的两端近处各有很细的刻痕，使用芯片前在此刻痕处可方便扮断、开口，备用；毛细管型拉曼芯片具体实施方法如下：

第一步：洗净硬质中性玻璃或石英玻璃毛细管，内径约0.5mm，外径1.0mm，长100mm；

第二步：制备TiO₂溶胶：将50mL的钛酸丁酯和3mL的乙酰丙酮混合并搅拌10min(称为A溶液)；同时，将110mL的无水乙醇、1.4mL的去离子水和0.2mL的硝酸混合并搅拌10min(称为B溶液)。然后， 在A溶液搅拌过程中，将B溶液逐滴加入到A溶液，并继续搅拌30min，最后形成TiO₂溶胶；

第三步：利用可控镀膜提拉机(50-300mm/min)和虹吸原理组装的设备，或利用精密调压阀-氮气可控吹气镀膜系统，依据激励激光束的波长λ，利用溶胶-凝胶法在毛细管内壁制备一层最佳膜厚的设计要求为λ/2n或λ/4n二氧化钛薄膜，通过A循环多次预试验，建立最佳膜厚的控制标准参量d_st，用于与最佳膜厚的设计指标比较，达到二者相等或接近；生产最佳二氧化钛薄膜的具体方法是通过调整图4的可控镀膜提拉机的最佳提拉速度υ，或调整图5的精密调压阀的压力，将二氧化钛溶胶以速度υ吹出毛细管来完成，将最佳膜厚的控制标准转移到最佳控制速度的控制标准υ_st，膜厚d与液面脱离速度υ的关系d-υ曲线通过预备实验建立；

第四步：将毛细管内壁按最佳厚度要求镀好TiO₂凝胶后，放入煅烧炉、设置最佳控制温度标准参量和时间焙烤，使其获得散粒型的锐钛矿型结晶化；通过A循环多次预试验，大约在400-450℃域内可以找到锐钛矿结晶化的最佳控制标准温度T_st和时间t_st参量，使用该标准参量控制二氧化钛薄膜转变锐钛矿型结晶化随机点阵斑点的密度恰到好处，可以使光催化生长纳米“银箔/银粒子”膜达到多数银粒子紧挨时，多数银粒子的直径恰好等于或接近激励激光束的半波长λ/2或四分之一波长λ/4；

第五步：利用可控镀膜提拉机见图4，或利用毛细管力见图5，将浓度为0.003M的AgNO3溶液吸入毛细管中，并用波长254nm，功率6W紫外灯照射，毛细管与紫外灯之间的距离大约6cm；在紫外灯光照射下通过TiO₂光催化过程，在TiO₂薄膜表面将硝酸银的银离子还原、生成银纳米粒子膜；银纳米粒子膜的结构是紧密结合在很薄的银箔上的密集的单层银纳米粒子膜，纳米粒子的尺度利用光照催化时间来调整，采用在线的荧光可见吸收光谱检测方法见图3，检测在线的以二氧化钛545nm发射峰位为底的最佳控制标准参量SPR峰高H₅₄₅为标准，τ_st用作参考标准，要使多数银纳米粒子的间隙接近到零，这是保证高拉曼增强因子的关键；毛细管内的AgNO₃溶液需要通过注入和吹排出，置换AgNO₃新旧溶液5-10次交换；使用智能的可控系统，自动完成毛细管内新旧AgNO3溶液多次置换；

第六步：免疫受体修饰的毛细管型二氧化钛纳米“银箔/银粒子”膜拉曼芯片实施方法，只要在二层SERS-膜的基础上，依据免疫学有关成热的经验，在图4或图5的镀膜液池中更换成免疫受体镀膜液，必要时先用有关的偶联镀膜液，就可以完成免疫受体修饰镀膜程序，制作完成免疫受体修饰三层SERS-膜毛细管型拉曼芯片；如果一些免疫受体的拉曼活性太低，需要增加镀活性较高的拉曼标记物分子，只要置换相关的镀膜液就可以完成；

第七步：氢键受体修饰的毛细管型二氧化钛纳米“银箔/银粒子”膜拉曼芯片实施方法，同样只要在二层SERS-膜的基础上，依据氢键结合有关成热的经验，在图4或图5的镀膜液池中更换成有关氢键受体镀膜液，完成氢键受体修饰镀膜程序；

第八步：氢键受体修饰的毛细管型拉曼芯片可以设计成气相或液相样品拉曼芯片，可以重复使用；在可重复使用的氢键受体修饰的毛细管型拉曼芯片的毛细管外表面必须镀一层电加热膜，适当加温，并用清洗液和氮气清洗毛细管芯片的内壁，使已经用过的有受体修饰的SERS-膜表面的给体-受体复合分子解结合，恢复原始状态氢键受体修饰的毛细管型二氧化钛纳米“银箔/银粒子”膜拉曼芯片的功能；

第九步：在完成毛细管内壁TiO₂-银纳米粒子膜的上述功能化工艺流程之后，将内壁清洗、氮气吹干，加密封盖、或蜡封、或火焰封死毛细管的两个开口端，最后避光保存，将可保障超过1年的拉曼活性储存寿命。

前期研究进展：我们曾初步研制毛细管型二氧化钛纳米“银箔/银粒子”膜拉曼芯片，用SERSp实验结果比较，前者的灵敏度比后者高出一个数量级：图9A二氧化钛纳米“银箔/银粒子”膜拉曼芯片R6g10^-7一Mol/L浓度的SERSp结果，和图9(B)，是常规的掺配银纳米粒子-毛细管样品池R6g10^-7Mol/L浓度的检测SERSp结果；

2、小盒型拉曼芯片的实施方法

小盒型拉曼芯片举例，四个制作工艺步骤如下：

第一步：在透明度很好的片基(17)表面，通过可控镀膜提拉机镀二氧化钛纳米凝胶薄膜，然后将此膜放在最佳焙烤温度中晶化，完成随机点阵锐钛矿型结晶化的转变(18)；

第二步：将此二氧化钛结晶化薄膜放在硝酸银溶液中，通过光催化还原生成最佳纳米“银箔(19)/银粒子”膜(20)；

第三步：在纳米“银箔/银粒子”膜的表面利用“氢键结合力”或“免疫结合力”修饰特异“受体”分子膜，如果检测目标给体分子种类数≥3，应将多种受体分子膜分开修饰成光栅型(21)分布；光栅形多种“受体”分子膜拉曼芯片在拉曼分析实验时，需要检测与光栅条数相同数目的SERSp；

第四步：将粘结有进样口和出样口毛细管(23)、拉曼芯片小盒罩(22)与镀好SERS-膜的透明窗口玻璃紧密粘合封装，组装成小盒型拉曼芯片。

3、微流控通道型拉曼芯片的实施方法

多受体分子修饰的微流控通道型拉曼芯片，可以设计成单通道型和多通道型两类：

一、微流控单通道型多受体分子修饰拉曼芯片，

第一步：在拉曼检测窗口(17)玻璃片的内壁镀二氧化钛纳米“银箔/银粒子”膜(18-20)；

第二步：在该表面修饰多个至十数个“受体”分子斑点膜(24)，排列在一条直线上，斑点的尺度在0.5～1毫米；受体分子与拉曼检测目标给体分子的配位结合力可以有氢键结合力和免疫结合力两种方式；

第三步：直线型多“受体”分子斑点的制作工艺方法，可以采用可控多喷墨针头完成；

第四步：在氢键结合受体的石英玻璃片窗口外壁镀可控电加热膜，就可以提供重复使用的适当加温，使已经使用过的“给体-受体”复合分子解结合，恢复拉曼芯片使用前的状态；

第五步：通道腔体(25)上设计进、出样通孔-滴样皿(26)，或连接进、出样毛细管，以便连接液相、气相样品的可控微流动驱动器，样品池腔形一般设计为半圆柱槽形(27)；

第五步：将微流控单通道多受体分子修饰SERS-膜与通道腔体(25)组装成多受体分子修饰的微流控单通道型拉曼芯片。

二、多受体分子修饰的微流控多通道型拉曼芯片的制作，可将多通道结构平行设计成光栅型式，在同一块二层SERS-膜上，将多种受体修饰成点线光栅形阵列式分布的三层SERS-膜，每条受体点线光栅上修饰多种不同种类受体，按一种受体一个点斑排列成点线光栅形矩阵式多种受体修饰三层SERS-膜，总计最多修饰的受体种类数可以上百，其他实施方法与上述类同。

三、前期研究进展：在前期预先研制的“TiO₂光催化-银箔/银粒子”膜，与“毛细管+掺配最佳银胶”用R6g10^-6Mol/L做了SERSp比较实验，图10(A)明显显示，前者的灵敏度比后者高一个多数量级；我们还用同一健康人的血清作样品，进行了比较，图10(B)同样明显显示，前者的灵敏度比后者高一个多数量级；由于前者的灵敏度比后者高，图10(A-1)R6g10^-6Mol/L的SERSp中有1435和1635cm^-1两条较小的拉曼峰，在图10(A-2)R6g10^-6Mol/L的SERSp中检测不到；同样情况也发生在血清样品的比较检测中，图10(B-1)血清的SERSp谱图中，有790和1530cm^-1两个较小的拉曼峰，在图10(B2)血清的R6g10^-6M的SERSp谱图中没有检测到。

4、免疫结合受体修饰的三层SERS-膜拉曼芯片的具体实施方法

第一步：再度提高拉曼芯片灵敏度的设计：在无受体修饰的拉曼芯片的灵敏度不能胜任的超低丰度痕量物质分子拉曼分析时，有效的方法之一是利用免疫结合受体修饰的三层SERS-膜拉曼芯片，配置气相或液相样品的可控微驱动器，实施定量样品循环流动通过芯片，使定量的检测目标给体分子样品不断流过三层SERS-膜表面时与膜上的受体分子结合，生成“受体-给体”复合分子，即“抗体-抗原”牢固结合的复合分子，使芯片三层SERS-膜上结合的“给体”分子富集。再将样品可控微驱动器的管路转向清洗剂纯净水或氮气供给源，清洗芯片中其他非检测的背景分子，可以非常有效地降低干扰背景，提高“受体-给体”复合分子的拉曼指纹谱的信噪比；

第二步：高效“银箔/银纳米粒子包金膜”的制作工艺与“银箔/银纳米粒子”膜的制作基本相同，只是在镀银粒子膜的最后阶段的几分钟将硝酸银AgNO₃镀膜液置换成适当浓度的氯金酸HAuCl₄镀膜液，就可通过光催化完成纳米“银箔/银粒子包金”膜；

第三步：用免疫受体修饰的三层SERS-膜的制作实施方法，完全可以借鉴免疫学积累的全部“抗原-抗体”有关知识和经验，采用的免疫结合力即抗原-抗体结合力，只要确定样品中需要检测的目标-给体分子是什么(抗原或抗体)分子，拉曼芯片中需要修饰的特异结合物的设计，就可依据成热的“免疫学”找到与其对应的受体分子(抗体或抗原)；

第四步：仅用1或2种免疫受体修饰三层SERS-膜拉曼芯片可采用毛细管载体设计，当免疫受体种类数≥3修饰的拉曼芯片则需要采用光栅形受体修饰的小盒型拉曼芯片(见图7)和微流控通道型拉曼芯片 (见图8)两类设计，在光栅形受体修饰的小盒型拉曼芯片中，每种受体分子在光栅中被修饰成一条光栅线；在点线受体修饰的微流控通道型拉曼芯片中，，每种受体分子在点线中被修饰成一个受体斑点；多受体修饰的种类数应根据市场需要设计，疾病筛查、诊断，食品安全检测和农药残留筛查等，均可采用多免疫受体种类数≥3修饰的拉曼芯片检测方案，免疫受体种类数最多可以达到数十至一百。

5、用氢键结合修饰受体的三层SERS-膜拉曼芯片的具体实施方法

用氢键结合修饰受体的拉曼芯片中的三层SERS-膜的制作工艺方法与免疫受体拉曼芯片基本相同，其主要不同如下：

第一：用氢键结合的受体修饰三层SERS-膜的制作，完全可以借鉴氢键学积累的全部“给体-受体”有关知识和经验，将其应用于氢键受体修饰三层SERS-膜拉曼芯片；见图8，是多种受体分子修饰微流控通道型拉曼芯片结构示意图；

第二：由于氢键结合力比较小，可以在三层SERS-膜的玻璃片基外表面设置电加热膜加温，使已与受体结合的给体分子解结合，再经过可控微驱动器驱动清洗剂、纯净水或氮气，清洗芯片，可以提供再次使用；

第三：在无受体修饰的拉曼芯片的灵敏度不能胜任的超低丰度痕量物质分子拉曼分析时，利用氢键结合受体修饰的三层SERS-膜拉曼芯片及其检测目的分子的富集是最有效的方法，使用该芯片需要配置气相或液相样品的可控微驱动器，控制定量样品流过芯片，使检测目标给体分子产生氢键配位的“受体-给体”结合的累积，实现检测目的“给体”分子在检测点富集，有效提高超低丰度痕量物质分子的拉曼指纹谱分析的灵敏度；之后，再用清洗剂、纯净水或氮气通过芯片，清洗芯片内不能与受体结合的背景干扰分子，可以有效地提高超低丰度痕量物质分子拉曼分析的信噪比。

本发明的效果和益处：

1、毛细管型二层SERS纳米“银箔/银粒子”膜拉曼芯片比当前的常规毛细管掺配银纳米粒子样品池灵敏度高1个多数量级，产品两端密封，纳米“银箔/银粒子”膜隔绝空气保存，拉曼活性存储期很长；使用很方便，可以用于环境污染治理检测、食品有害添加剂筛查，农药残留检测，特别适用于开展大规模早期癌症拉曼普及筛查中应用。

2、将来广泛的早期癌症拉曼筛查工作，可以很方便地使用毛细管拉曼样品池芯片专利商品；我们已经采用毛细管掺配银纳米粒子样品池，研究筛查肺癌和早期乳腺病方法，并已取得了比其他现在已经在广泛使用的血清筛查方法都好得多的进展，筛查早期肺癌尚需进一步提高系统的灵敏度和特异性。本发明中的毛细管型二层SERS纳米“银箔/银粒子”膜拉曼芯片，微流控通道型拉曼芯片和小盒型拉曼芯片，将为今后早期肺癌和其他早期癌症的筛查方法研究的突破提供重要支撑。

提高早期肺癌和其他早期癌症的筛查方法研究关键在于提高检测的灵敏度和特异性，肺癌细胞的新陈代谢标志物仅收集血清样品筛查是不够的、不全面的，再收集肺癌患者呼出气中的多种易挥发性有机化合物VOCs标志物和随着呼出气体的气流带出肺部肿瘤病变EBC免疫标志物进行免疫拉曼筛查，将呼出气拉曼筛查联合血清拉曼筛查将非常有利于提高早期癌症拉曼筛查的灵敏度和特异性。