本发明涉及生物
技术领域：
，特别是涉及一种白色念珠菌抗原近红外荧光检测试剂盒及其用途。
背景技术：
：白色念珠菌(Canidiaalbicans)又称白假丝酵母菌，是一种条件致病菌，通常存在于正常人口腔，上呼吸道，肠道及阴道，一般在正常机体中数量少，不引起疾病，当机体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制约作用失调，则易在局部大量生长繁殖，引起皮肤、黏膜甚至全身性白色念珠菌感染。白色念珠菌可引起女性的外阴及阴道炎症，主要表现为阴道分泌物粘稠、色黄或奶酪样斑片，外阴、阴道瘙痒或灼热感、豆渣样白带等临床症状。男性患者较少见，多经性接触传播,引发男性的念珠菌性龟头炎和包皮龟头炎。近年来，念珠菌性阴道炎患病率居高不下，考虑与抗生素的滥用、避孕工具及卫生用品不洁、不当等因素有关。估计75％的妇女一生至少发生1次外阴阴道白色念珠菌病，5％～10％的妇女每年发生2次，我国各地感染率为0.65～39％不等，且白色念珠菌是阴道念珠菌病的主要病原体。真菌的临床耐药问题一直是国内外面临的重大问题之一，由于抗真菌药在临床上的大量使用或不规则应用，念珠菌耐药菌株也显著增加。若病原菌不确定，治疗效果常不理想，复发率高，并可诱发耐药性及菌群失调，因此快速、灵敏、准确的鉴别诊断白色念珠菌对临床治疗十分重要。技术实现要素：鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种白色念珠菌抗原近红外荧光检测试剂盒及其用途，用于建立高效可行的白色念珠菌抗原近红外荧光检测技术，解决现有技术中的问题。鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种白色念珠菌抗原近红外荧光检测试剂盒及其用途。本发明所提供的检测试剂盒结合近红外荧光检测技术，可快速，准确的检测出女性阴道分泌物中的白念珠菌抗原。为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种白色念珠菌抗原近红外荧光检测试剂盒，包括位于背板上的试剂条，试剂条从加样端开始依次为样品垫、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、包被有抗白色念珠菌单克隆抗体的硝酸纤维素膜和吸水纸。优选的，所述免疫荧光探针为抗白色念珠菌单克隆抗体包被的近红外荧光乳胶微球颗粒。硝酸纤维素膜上包被的抗白色念珠菌单克隆抗体和所述近红外荧光乳胶微球颗粒上包被的抗白色念珠菌单克隆抗体可以为相同的抗体，也可以为不同的抗体。更优选的，所述硝酸纤维素膜上包被的抗白色念珠菌单克隆抗体为Anti-Candidaalbicansantibody[CDA](ab82704)，所述近红外荧光乳胶微球颗粒上包被的抗白色念珠菌单克隆抗体为Anti-Candidaalbicansantibody[6401](ab23368)，或所述硝酸纤维素膜上包被的抗白色念珠菌单克隆抗体为Anti-Candidaalbicansantibody[6401](ab23368)，所述近红外荧光乳胶微球颗粒上包被的抗白色念珠菌单克隆抗体为Anti-Candidaalbicansantibody[CDA](ab82704)。更优选的，所述荧光乳胶微球颗粒的直径为140-160nm。近红外光(NIR)，是介于可见光(VIS)和中红外光(MIR)之间的电磁波，ASTM定义NIR为波长在780nm-2526nm范围内的电磁波。在近红外光区，生物体自吸收或荧光强度很小，可避免背景干扰。同时由于散射光强度与波长的四次方呈反比，近红外区的散射干扰大为减少。本发明第二方面提供所述白色念珠菌抗原近红外荧光检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：1)用缓冲液将荧光乳胶微粒离心清洗并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒分散液中加入抗白色念珠菌单克隆抗体；加入EDCA使抗体与颗粒偶联；再加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，制备获得探针溶液；2)将含有抗白色念珠菌单克隆抗体的缓冲溶液喷加到硝酸纤维素膜上，烘干备用；3)将步骤1制备获得的探针溶液浸润玻璃纤维薄膜，干燥备用；4)将步骤2所得的硝酸纤维素膜、步骤3所得的标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、样品垫、吸水纸及背板组装制备成白色念珠菌抗原近红外荧光检测试剂盒。优选的，所述步骤1中，再加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，并加入冠醚，制备获得探针溶液，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合。更优选的，步骤1制备获得的探针溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml，更优选为4-8mg/ml。优选的，所述步骤1中，缓冲液为磷酸盐(PBS)缓冲液。更优选的，所述PBS缓冲液为0.009-0.011mol/L，PH7.25-7.35的PBS缓冲液。优选的，所述步骤1中，荧光乳胶微粒的直径为140-160nm。优选的，所述步骤1中，乳胶颗粒、抗白色念珠菌单克隆抗体、EDCA的重量比为9-11： 0.9-1.1：0.9-1.1。在本发明一实施例中，乳胶颗粒、抗白色念珠菌单克隆抗体、EDCA的投料量分别为1mg、100ug、100ug。优选的，所述封闭液为乙醇胺，加入量为适量，本领域技术人员可根据实际情况调整乙醇胺的用量。优选的，所述步骤2中，所述缓冲溶液为PBS缓冲液。本领域技术人员可选取适当浓度和pH的PBS缓冲液，更优选为0.009-0.011mol/L，PH7.25-7.35的PBS缓冲液。优选的，所述步骤2中，含有抗白色念珠菌单克隆抗体的缓冲溶液中还含有冠醚，所述冠醚选自二环已基-18-冠-6、15-冠醚-5、18-冠醚-6中的一种或多种的组合。更优选的，所述含有抗白色念珠菌单克隆抗体的缓冲溶液中冠醚的浓度为0.1-20mg/ml，更优选为4-8mg/ml。优选的，所述步骤2中，含有抗白色念珠菌单克隆抗体的缓冲溶液中抗白色念珠菌单克隆抗体的浓度为1.8-2.2mg/ml。优选的，所述步骤2中，抗白色念珠菌单克隆抗体的缓冲溶液的喷加量为0.9-1.1ul/cm。优选的，所述步骤2中，烘干的具体条件为36-38℃烘箱烘干。所述喷加过程利用微量蛋白点膜系统。优选的，所述步骤1中的抗白色念珠菌单克隆抗体为Anti-Candidaalbicansantibody[CDA](ab82704)，所述步骤2中的抗白色念珠菌单克隆抗体为Anti-Candidaalbicansantibody[6401](ab23368)，或所述步骤1中的抗白色念珠菌单克隆抗体为Anti-Candidaalbicansantibody[6401](ab23368)，所述步骤2中的抗白色念珠菌单克隆抗体为Anti-Candidaalbicansantibody[CDA](ab82704)。优选的，所述步骤3中，干燥的具体条件为真空干燥机干燥。本发明第三方面提供所述白色念珠菌抗原近红外荧光检测试剂盒在白色念珠菌检测领域的用途。所述用途具体为使用所述白色念珠菌抗原近红外荧光检测试剂盒对样品中的白色念珠菌进行检测，所述样品为女性阴道分泌物。本发明所提供的检测试剂盒可以以女性阴道分泌物为检测样本，结合近红外荧光检测技术，可快速，准确的检测出患者标本中的白色念珠菌抗原。所述试剂盒采用免疫荧光层析法，其最小可测量可达0.05ng/ml，检测方便、成本低，灵敏度高，特异性好，比同类定量诊断试 剂价格低20-30％，大大节约了社会医疗成本，检测过程中样品收集及处理简单，可快速准确的获得结果，非常适合突发事件现场和基层使用，并可应用到临床检测中，为临床治疗提供定性依据。具体实施方式以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本
技术领域：
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
技术领域：
的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本
技术领域：
常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。本发明各实施例中试验样品由浦东新区人民医院提供。近红外荧光检测仪，由上海凯创 生物技术有限公司开发提供。实施例11.免疫荧光抗白色念珠菌抗体颗粒制备：用0.01mol/L，PH7.3±0.05的磷酸盐缓冲液将直径为150nm的荧光乳胶微粒离心清洗2遍并将乳胶颗粒分散，在清洗好的乳胶颗粒中加入Anti-Candidaalbicansantibody[CDA](ab82704)；加入EDCA使抗体与颗粒偶联；加入封闭液封闭乳胶颗粒上多余的基团，再加入二环已基-18-冠-6。按每毫克微球乳胶100微克的待标记抗体，100微克的EDCA用量标记。每毫克的微球乳胶最后加相当于20微克的乙醇胺当量的封闭液进行封闭，冠醚的终浓度为6mg/ml。2.试剂盒的制备：用0.01MpH7.2的PBS缓冲液稀释Anti-Candidaalbicansantibody[6401](ab23368)至浓度2.0mg/ml，并加入冠醚，冠醚的终浓度为6mg/ml，再利用微量蛋白点膜系统将溶液喷加到适当孔径的硝酸纤维素膜上，按1ul/cm的量进行喷膜，37℃烘箱烘干备用。用制备好的探针(步骤1制得的标记有Anti-Candidaalbicansantibody[CDA](ab82704)的近红外荧光乳胶微球)溶液浸润玻璃纤维薄膜，真空干燥机中干燥备用。将包被抗白色念珠菌抗体的硝酸纤维素膜、标记有免疫荧光探针的玻璃纤维素膜、样品垫、吸水纸及背板组装制备成白色念珠菌抗原近红外荧光检测试剂盒。实施例2检测试剂盒的灵敏度实验取实施例1制得的白色念珠菌抗原检测试剂盒，将试剂盒放置在水平台面上，分别检测0.03ng/ml、0.05ng/ml、0.08ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml的白色念珠菌抗原标准品(由白色念珠菌抗原标准品和PBS缓冲液分别配置)，每个浓度重复5次。用吸管吸取样品液2-3滴加入到样品槽中，在滴加样品后8-15分钟判读结果。表1试剂盒灵敏度结果表1结果证实，本发明制得的白色念珠菌抗原检测试剂盒灵敏度≤0.05ng/ml，具有很高的灵敏度。实施例3白色念珠菌抗原近红外荧光检测法与细菌培养对比实验：试剂盒检测：待测样品为女性阴道分泌物，使用10倍体积的0.01MpH7.2的PBS缓冲液稀释。待测样品及试剂盒均平衡至室温开始检测，用滴管在每个试剂盒的加样孔内滴加3滴样本(约120-150ul)。15分钟时，用近红外荧光检测仪检测荧光信号，并用荧光仪器进行判断，分析仪的对荧光信号的检测范围是AD值0-10000，根据仪器的性能，CUTOFF值为50，检测AD值大于等于50为阳性结果。实验结果与细菌培养结果对比验证。白色念珠菌抗原近红外荧光检测法与阴道分泌物细菌培养结果如表2所示：表2实施例4交叉实验：在白色念珠菌抗原近红外检测试剂盒分别滴加制备好的粪肠球菌、屎肠球菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、克雷伯菌、乳酸杆菌、淋病奈瑟菌、绿脓假单胞菌、大肠杆菌、人型支原体、解脲脲原体、金黄色葡萄球菌、链球菌及幽门螺旋菌菌液(1×106CFU/ml)，进行交叉实验检测，检测以上细菌是否对本试剂盒检测结果产生影响，白色念珠菌抗原近红外荧光检测试剂与细菌交叉实验结果如表3所示，各细菌交叉实验中均无交叉反应发生：表3交叉物结果交叉物结果粪肠球菌-淋病奈瑟菌-屎肠球菌-绿脓假单胞菌-大肠埃希菌-大肠杆菌-鲍曼不动杆菌-人型支原体-克雷伯菌-解脲脲原体-乳酸杆菌-金黄色葡萄球菌-幽门螺旋菌-链球菌-实施例5白色念珠菌抗原检测试剂盒的稳定性实验将本发明所提供的白色念珠菌抗原近红外荧光检测试剂盒密封保存，并存放于4℃及室温(25℃左右)下，观察不同存放温度对试剂盒稳定性的影响。保存于4℃的试剂盒每周取出4盒，分别检测0.03ng/ml、0.05ng/ml、0.08ng/ml、0.1ng/ml的白色念珠菌抗原标准品；保存于室温(25℃)的试剂盒每3天取出4盒，分别检测0.03ng/ml、0.05ng/ml、0.08ng/ml、0.1ng/ml的白色念珠菌抗原标准品。经验证，试纸盒在4℃下可保存24个月，且最低检出限和重复性没有明显变化，在室温下可保存16个月，且最低检出限和重复性没有明显变化；在可保存的期限内，试剂盒均可达到0.08ng/ml的检测灵敏度。综上所述，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属
技术领域：
中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。当前第1页1 2 3