一种短穗兔耳草的HPLC特征图谱检测方法及图谱与流程

本发明涉及一种短穗兔耳草的HPLC特征图谱检测方法和图谱，属于医药技术领域。

背景技术：

短穗兔耳草，玄参科兔耳草属植物，对其研究较少。研究发现，短穗兔耳草成份复杂，主要含有大量黄酮类物质，而用于黄酮类检测的HPLC常规方法对其分离效果并不理想。对于难以分离的成份，现有技术中也有采用色谱柱串联的方法，但多为阳离子交换色谱柱与反相色谱柱串联，并且色谱柱串联要考虑的因素很多：统一通用的流动相、柱压产生大幅变化、死体积突变、峰宽增高、峰形变差及出峰难以识别(先流出第一根柱子的组分，在第二根柱子保留加强而导致后出峰)等。因此，针对短穗兔耳草，需要建立一种简单有效、操作方便、分离检测效果较好的质量检测方法。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供了一种短穗兔耳草的HPLC特征图谱检测方法及其图谱。

本发明以芦丁为参照物，以十八烷基硅烷键合硅胶柱后接苯基键合硅胶柱为色谱柱；以乙腈-pH为6.0的含有体积份数比0.2％冰醋酸、体积份数比0.5％三乙胺的水混合溶液为流动相，通过梯度洗脱，对短穗兔耳草进行检测，60min即可完成检测，所得HPLC特征图谱能较全面地反映短穗兔耳草所含化学成分的种类与数量。

本发明的技术方案如下：

一种短穗兔耳草的HPLC特征图谱检测方法，包括如下步骤：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶柱后接苯基键合硅胶柱为色谱柱；以乙腈为流动相A，以pH为6.0的混合溶液为流动相B，通过梯度洗脱，对短穗兔耳草进行检测，其梯度变化为：流动相中乙腈的百分比变化0～30分钟由12％升至20％，30～60分钟由20％升至50％；检测波长为360nm；流速：0.8～1.2ml/min；理论板数按芦丁峰计算不低于2000；其中所述流动相B为含有体积份数比0.2％冰醋酸和体积份数比0.5％三乙胺的水混合溶液；

对照品溶液的制备：取芦丁对照品适量，加甲醇制成每1ml含芦丁0.05-0.20mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取短穗兔耳草细粉10-50mg，加入甲醇10-50ml，超声处理3-15分钟，放冷，滤过，取续滤液，即得；

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5～10μl，注入高效液相色谱仪，记录60-80分钟内的色谱图，即得短穗兔耳草的HPLC特征图谱。

优选的，上述短穗兔耳草的HPLC特征图谱检测方法，包括如下步骤：

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶柱后接苯基键合硅胶柱为色谱柱；以乙腈为流动相A，以pH为6.0的混合溶液为流动相B，通过梯度洗脱，对短穗兔耳草进行检测，其梯度变化为：流动相中乙腈的百分比变化0～30分钟由12％升至20％，30～60分钟乙腈由20％升至50％；检测波长为360nm；流速：1.0ml/min；理论板数按芦丁峰计算不低于2000；其中所述流动相B为含有体积份数比0.2％冰醋酸和体积份数比0.5％三乙胺的水混合溶液；

对照品溶液的制备：取芦丁对照品适量，加甲醇制成每1ml含芦丁0.1mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取短穗兔耳草细粉25mg，加入甲醇25ml，超声处理5分钟，放冷，滤过，取续滤液，即得；

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5-10μl，注入高效液相色谱仪，记录60分钟内的色谱图，即得短穗兔耳草的HPLC特征图谱。

上述短穗兔耳草的HPLC特征图谱，包括如下10个特征峰，其中2号峰芦丁为参照峰，10个峰的相对保留时间与参照峰保留时间的比值分别为0.732、1.000、1.029、1.080、1.159、1.175、1.295、1.668、2.561、2.582。

本发明的短穗兔耳草是指其药材或提取物，其中提取物是指经常规的水提取物或醇提取物，或经上述提取后还经过活性炭或大孔树脂柱进一步富集有效成分的组合物。

本说明书中所述的重量份与体积份的单位对应关系为g/ml或kg/l。

有益效果

本发明提供了短穗兔耳草HPLC特征图谱检测方法和图谱，能较全面地反映短穗兔耳草所含化学成分的种类与数量，本发明通过串联色谱柱联合梯度洗脱，60min即可完成短穗兔耳草的检测，特征峰专属性强，具有操作简便、快速、检测成本低、重现性好和信息量大等优点，对于有效控制短穗兔耳草及其提取物的质量具有重要的意义。

附图说明

图1是以十八烷基硅烷键合硅胶柱为色谱柱的短穗兔耳草提取物HPLC特征图谱；

图2是以苯基键合硅胶柱后接十八烷基硅烷键合硅胶柱为色谱柱的短穗兔耳草提取物HPLC特征图谱；

图3是以十八烷基硅烷键合硅胶柱后接苯基键合硅胶柱为色谱柱的短穗兔耳草提取物HPLC特征图谱；

图4是短穗兔耳草提取物的HPLC特征图谱；

图5是芦丁参照品的HPLC图谱；

其中图1-图4中的短穗兔耳草提取物为短穗兔耳草60％乙醇的提取物。

下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。

实验例1：色谱柱对比选择实验

试验仪器：高效液相色谱仪：Agilent 1260

电子天平：岛津AUW-220D型

紫外分光光度计：岛津UV-2450型

对照品：芦丁对照品(中国药品生物制品检定所)批号：100080-200707

供试品：短穗兔耳草提取物(体积浓度60％乙醇自制，批号：20150101、20150102、20150103、20150104、20150201、20150202、20150203、20150204、20150205、20150301)

色谱条件与系统适用性试验：分别以十八烷基硅烷键合硅胶柱、辛烷基硅烷键合硅胶柱、苯基键合硅胶柱、氨基键合硅胶柱及两种色谱柱串联进行检测；以乙腈(A)-体积份数比0.2％冰醋酸、体积份数比0.5％三乙胺水溶液(pH为6.0)(B)为流动相，梯度洗脱：0～30分钟乙腈由12％升至20％，30～60分钟乙腈由20％升至50％；检测波长为360nm；流速：1.0ml/min；分析时间：60分钟。理论板数按芦丁计算应不低于2000；

对照品溶液的制备：取芦丁对照品适量，加甲醇制成每1ml含芦丁0.1mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取短穗兔耳草提取物研细后细粉25mg，加入甲醇25ml，超声处理5分钟，放冷，滤过，取续滤液，即得。

检测波长：360nm。

结果：单独以十八烷基硅烷键合硅胶柱、辛烷基硅烷键合硅胶柱、苯基键合硅胶柱、氨基键合硅胶柱均不能达到很好的分离效果，以十八烷基硅烷键合硅胶柱为色谱柱，得到7个特征峰，但得到的特征峰中2号峰及3号峰为两个峰重叠形成的，专属性差，因此不选择十八烷基硅烷键合硅胶柱为色谱柱；而以两种色谱柱串连为色谱柱时，仅十八烷基硅烷键合硅胶柱后接苯基键合硅胶柱为色谱柱有相对较好的分离效果，其余串连方式均不能达到分离色谱峰的目的，且只能十八烷基硅烷键合硅胶柱后接苯基键合硅胶柱，而苯基键合硅胶柱后接十八烷基硅烷键合硅胶柱，得到8个特征峰，但得到的特征峰中4号峰为多个峰重叠形成的，专属性差，也不能达到分离效果。因此，选择十八烷基硅烷键合硅胶柱后接苯基键合硅胶柱为色谱柱。其中图1-3分别为以十八烷基硅烷键合硅胶柱、苯基键合硅胶柱后接十八烷基硅烷键合硅胶柱及十八烷基硅烷键合硅胶柱后接苯基键合硅胶柱进行检测的色谱图。

实验例2：短穗兔耳草HPLC特征图谱的获得实验

试验仪器、对照品、短穗兔耳草乙醇提取物同实验例1。

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶柱后接苯基键合硅胶柱进行检测；以乙腈(A)-体积份数比0.2％冰醋酸、体积份数比0.5％三乙胺水溶液(pH为6.0)(B)为流动相，梯度洗脱：0～30分钟乙腈由12％升至20％，30～60分钟乙腈由20％升至50％；检测波长为360nm；流速：0.8～1.2ml/min；分析时间：60分钟。理论板数按芦丁计算应不低于2000；

对照品溶液的制备：取芦丁对照品适量，加甲醇制成每1ml含芦丁0.1mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取短穗兔耳草提取物细粉25mg，加入甲醇25ml，超声处理5分钟，放冷，滤过，取续滤液，即得。

检测波长选择：按供试品溶液的制备方法得到供试品溶液，190-600nm波长范围内进行扫描，根据紫外吸收图谱，选定360nm为检测波长。

特征图谱获得：取10批短穗兔耳草提取物按供试品溶液的制备方法得到供试品溶液，按上述色谱条件获得10批短穗兔耳草提取物的高效液相色谱图，以这10批短穗兔耳草提取物特征图谱为基础，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》进行评价，选择在360nm检测波长下的相似度大于0.9的图谱；结果见图4-图5。

实验例3：特征图谱检测方法的方法学考察实验

1、精密度试验

取20150101批短穗兔耳草提取物样品，按上述供试品溶液的制备方法得到的供试品溶液一份，在上述色谱条件下连续进样5次测定，结果表明：本发明提供的特征图谱检测方法精密度良好。测定结果见表1。

表1短穗兔耳草HPLC特征图谱精密度考察结果(相对保留时间)

2、重复性试验

取20150101批短穗兔耳草提取物样品，按上述供试品溶液的制备方法得到的供试品溶液六份，在上述色谱条件下进样测定，结果表明：本发明提供的特征图谱检测方法重复性良好。测定结果见表2。

表2短穗兔耳草HPLC特征图谱重复性考察结果(相对保留时间)

3、稳定性试验

取20150101批短穗兔耳草提取物样品，按上述供试品溶液的制备方法得到的供试品溶液一份，在上述色谱条件下分别在0小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时进样测定，结果表明：本发明提供的特征图谱检测方法稳定性良好。测定结果见表3。

表3短穗兔耳草HPLC特征图谱稳定性考察结果(相对保留时间)

下述实施例均能实现上述实验例所述的效果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作详细的阐述,但不限于这些具体记载的实施例。

所检测的短穗兔耳草70％乙醇提取物、短穗兔耳草50％乙醇提取物、短穗兔耳草水提取物、短穗兔耳草药材均为常规市售或自制。

实施例1：短穗兔耳草的HPLC特征图谱检测方法

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶柱后接苯基键合硅胶柱为色谱 柱；以乙腈(A)-pH为6.0的体积份数比0.2％冰醋酸、体积份数比0.5％三乙胺水溶液的混合溶液(B)为流动相，梯度洗脱：0～30分钟乙腈由12％升至20％，30～60分钟乙腈由20％升至50％；检测波长为360nm；流速：1.0ml/min；理论板数按芦丁计算应不低于2000；

对照品溶液的制备：取芦丁对照品适量，加甲醇制成每1ml含芦丁0.1mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取短穗兔耳草70％乙醇提取物细粉10mg，加入甲醇25ml，超声处理5分钟，放冷，滤过，取续滤液，即得；

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入高效液相色谱仪，记录60分钟内的色谱图，即得短穗兔耳草的HPLC特征图谱。

所得HPLC特征图谱包括10个特征峰，其中2号峰芦丁为参照峰，10个峰的相对保留时间与参照峰保留时间的比值分别为0.731、1.000、1.028、1.081、1.159、1.177、1.295、1.668、2.562、2.584，符合上述标准特征图谱。

实施例2：短穗兔耳草的HPLC特征图谱检测方法

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶柱后接苯基键合硅胶柱为色谱柱；以乙腈(A)-pH为6.0的体积份数比0.2％冰醋酸、体积份数比0.5％三乙胺水溶液的混合溶液(B)为流动相，梯度洗脱：0～30分钟乙腈由12％升至20％，30～60分钟乙腈由20％升至50％；检测波长为360nm；流速：0.8ml/min；理论板数按芦丁计算应不低于2000；

对照品溶液的制备：取芦丁对照品适量，加甲醇制成每1ml含芦丁0.05mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取短穗兔耳草50％乙醇提取物细粉25mg，加入甲醇50ml，超声处理10分钟，放冷，滤过，取续滤液，即得；

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录80分钟内的色谱图，即得短穗兔耳草的HPLC特征图谱。

所得HPLC特征图谱包括10个特征峰，其中2号峰芦丁为参照峰，10个峰的相对保留时间与参照峰保留时间的比值分别为0.733、1.000、1.031、1.081、1.156、1.175、1.296、1.668、2.563、2.585，符合上述标准特征图谱。

实施例3：短穗兔耳草的HPLC特征图谱检测方法

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶柱后接苯基键合硅胶柱为色谱柱；以乙腈(A)-pH为6.0的体积份数比0.2％冰醋酸、体积份数比0.5％三乙胺水溶液的混合溶液(B)为流动相，梯度洗脱：0～30分钟乙腈由12％升至20％，30～60分钟乙腈由20％升至50％；检测波长为360nm；流速：1.2ml/min；理论板数按芦丁计算应不低于2000；

对照品溶液的制备：取芦丁对照品适量，加甲醇制成每1ml含芦丁0.2mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取短穗兔耳草水提取物细粉20mg，加入甲醇20ml，超声处理3分钟，放冷，滤过，取续滤液，即得；

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入高效液相色谱仪，记录60分钟内的色谱图，即得短穗兔耳草的HPLC特征图谱。

所得HPLC特征图谱包括10个特征峰，其中2号峰芦丁为参照峰，10个峰的相对保留时间与参照峰保留时间的比值分别为0.730、1.000、1.033、1.083、1.153、1.172、1.291、1.668、2.564、2.588，符合上述标准特征图谱。

实施例4：短穗兔耳草的HPLC特征图谱检测方法

色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶柱后接苯基键合硅胶柱为色谱柱；以乙腈(A)-pH为6.0体积份数比0.2％冰醋酸、体积份数比0.5％三乙胺水溶液的混合溶液(B)为流动相，梯度洗脱：0～30分钟乙腈由12％升至20％，30～60分钟乙腈由20％升至50％；检测波长为360nm；流速：1.0ml/min；理论板数按芦丁计算应不低于2000；

对照品溶液的制备：取芦丁对照品适量，加甲醇制成每1ml含芦丁0.15mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备：取短穗兔耳草药材细粉25mg，加入甲醇25ml，超声处理15分钟，放冷，滤过，取续滤液，即得；

测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入高效液相色谱仪，记录60分钟内的色谱图，即得短穗兔耳草的HPLC特征图谱。

所得HPLC特征图谱包括10个特征峰，其中2号峰芦丁为参照峰，10个峰的相对保留时间与参照峰保留时间的比值分别为0.732、1.000、1.031、1.084、1.160、1.174、1.291、1.673、2.564、2.593，符合上述标准特征图谱。