本发明涉及农业科学技术领域，具体地说是一种能够通过数值指标来量化评价大麦茎秆脆性水平，从而实现脆茎大麦的定量筛选方法。
背景技术：
大麦栽培历史悠久，是第一个被驯化的谷类作物，以其适应性广、抗逆性强（包括耐寒、耐旱、耐盐碱等）、用途广泛而在全世界种植。作为工农业生产的重要谷类作物，全球现种植大麦6100多万hm2，总产量约1.7亿吨，面积和总产仅次于小麦、水稻、玉米，为第四大谷物。我国近20年来啤酒工业发展迅速，现已成为世界第一啤酒生产大国，由于我国优质啤酒专用大麦品种选育研究滞后于啤酒工业的迅速发展，以及啤麦生产方式及设备等因素，我国的啤酒原料因质量问题而主要依赖进口，这一现状长期地、严重地制约着我国啤麦生产和啤酒工业的稳定发展。努力实现啤酒原料国产化，对于促进我国啤酒工业的稳定发展具有十分重要的意义。同时，大麦是一个优良的饲料作物，饲用价植不亚于玉米。在全球对大麦的需求中，饲料大麦的市场份额占到70%左右。从国内对大麦的巨大需求和充分利用我国有限的土地资源这两个重要的国情分析，我国的大麦生产应该和必将会得到迅速发展，大麦仍然是我国最具有发展潜力的谷物。
众所周知，茎秆强度是植物机械强度的外在直接体现者，而茎秆性状则是影响大麦产量和品质的重要因素，也是筛选抗倒伏大麦品种的主要考察性状。脆茎突变是指植物茎秆脆茎增加，通常是根、茎、叶、茎节等器官呈现脆茎增加、易折的表型，是植物中一类比较常见的突变类型，该突变在水稻、拟南芥、玉米和大麦等植物中均有报道过。与野生型相比，脆茎突变体普遍具有纤维素含量降低、木质素含量增加、细胞壁结构组成改变等显著特点，有利于选育“粮-饲”兼用大麦，即既可以收获粮食，又能将大麦茎秆作为饲料资源用于畜牧养殖，还能减少大麦茎秆焚烧造成的环境污染。
而近几年来，随着农村经济的发展、技术进步以及农民生活条件的改善，曾经被农民广泛用作燃料、饲料和肥料的农作物秸秆失去了往日的利用优势，被大量焚烧，这不仅造成严重的环境污染，还能直接烧死、烫死土壤中的有益微生物，影响农作物对土壤养分的充分吸收，破坏土壤的结构，造成耕地质量的下降。目前，已有部分地区开展大麦秸秆还田试验，但普通大麦秸秆柔韧，机械难以粉碎，机收后如果不加处理，秸秆长期不腐解，秸秆还田效果较差。另外一方面，现有大麦良种茎秆的细胞壁结构非常致密、秸秆品质差、营养成分含量低，而大麦草的前处理操作复杂、成本高且效果不佳，限制了其在畜牧生产上的应用。与传统大麦相比，脆茎大麦品种最主要特点是茎秆机械强度低，秸秆细胞壁厚度和纤维素含量下降，同时半纤维素、木质素含量上升，营养价值提高，并且适口性好。因此，脆茎大麦品种不仅容易被粉碎，而且还可以作为动物饲料直接进行回收利用。
大麦脆茎突变体的研究也如火如荼，突变型与野生型茎秆直径无显著差异，但脆茎突变体中纤维素含量降低，茎秆的机械强度约为野生型的一半。悬浮细胞系和愈伤组织中细胞无次生壁，可以通过检测悬浮细胞系和愈伤组织细胞中纤维素含量的变化来确定纤维素的降低是否发生在次生壁上。Yeo等人测定了大麦脆茎突变体悬浮细胞系和愈伤组织细胞中纤维素的含量，结果表明突变型与野生型中纤维素总含量无变化，所以确定此突变体影响了次生壁纤维素的合成，Kimura等研究了突变体细胞膜表面纤维素合酶复合体的数目，结果表明突变型明显比野生型的数目要少，这说明此突变体纤维素合酶复合体数目的减少导致其纤维素含量降低。
大麦脆茎性状的研究，对于粮食产量安全、分子育种及饲料新能源等应用都意义重大。脆茎突变基因的定位和克隆为研究大麦次生细胞壁形成的分子机理、结构组成和植株机械强度的调控途径等发挥了重要作用。研究者对大麦脆茎性状形成的分子机理、基因定位与克隆、脆茎基因的遗传分析等方面进行了深入研究，取得了一些显著的进展。研究发现，脆茎大麦的茎秆及其他组织器官主要由于细胞壁脆茎改变。植物细胞壁的结构和成分与茎秆的机械强度直接相关，脆茎突变植物细胞壁厚度减小、纤维素含量降低是导致其脆茎增加的最直接的原因。
虽然大麦脆茎性状的研究，与粮食产量安全、大麦米品质改良、分子育种、开发饲料新能源等方面都意义重大，但迄今为止，还没有出现大面积推广的脆茎大麦品种，其主要原因还是大麦脆茎基因是数量性状遗传控制的，各脆茎突变体虽然表现显著，但大都是单基因突变，单基因脆茎突变体的表现型也各不相同。比如大麦脆茎突变材料的饲用，虽然营养价值、牲畜适口性均提高，机械加工性能增强，抵抗反刍动物消化的硅质层破碎效果得到改良，但是目前的各脆茎突变体大麦秸秆还不能完全作为青储饲料，也不能全部采用脆茎大麦秸秆作为牲畜饲料。因此，虽然脆茎大麦饲用的研究表明其巨大的产业潜值，但是还要继续加大脆茎性状的基因定位开发和数量性状的聚合，进一步增强脆茎大麦饲用性能、机械粉碎性能，才能真正发挥其广阔的市场价值和生态价值。
虽然脆茎大麦的性状很容易和其他常规大麦品种进行定性区别，只要用手掰折茎秆或叶片，就能直观判断，但是脆茎程度却无法定量统计，这给多基因脆茎突变体的基因定位和脆茎基因的多基因聚合育种过程中带来了困扰。脆茎数量基因聚合育种中尤其需要鉴别脆茎大麦的表型差异度，以确定脆茎基因聚合程度。脆茎表型定量检测方法的建立将给脆茎基因聚合育种带来极大的便利和辅助，同时也大大减少分子检测劳动力和费用，节约成本。
技术实现要素：
本发明的目的是针对脆茎大麦多基因突变体的基因定位和多基因聚合育种中数量性状的甄别仅有常规的定性鉴定而缺乏定量鉴定方法，提供一种脆茎大麦的定量筛选方法，该定量筛选方法通过对脆茎大麦表型差异度进行的显著而又准确的定量评价，从而实现了对脆茎大麦的定量筛选。
本发明的目的是通过以下技术方案解决的：
一种脆茎大麦的定量筛选方法，其特征在于：所述的定量筛选方法的步骤如下：
（1）选取均处于抽穗盛期的待筛选大麦，并剥除包裹茎秆的叶片；
（2）剪取待筛选大麦第一节间进行脱蜡处理，清洗后进行茎秆脆化处理，烘干待测；
（3）采用穿刺仪器在脆化处理后不同分蘖的茎秆上进行同位置穿刺，并记录每次穿刺时该脆茎大麦刺穿瞬间的压强值；
（4）取上述压强值的平均值作为量化评价该脆茎大麦的筛选指标。
所述步骤（1）中的均处于抽穗盛期的待筛选大麦的获取方法为：待筛选大麦单株穗部从剑叶叶鞘中抽出部分达到三分之一时标记该单株抽穗，待该大麦大田抽穗单株的比例为40%-60%时，选择整株抽穗分蘖比例与大田长势相近的健壮植株，从根部整株挖取，洗净根部泥土，去除穗部从剑叶叶鞘中抽出部分不足三分之一的分蘖，晾干后冷藏于-20℃冰箱中，不同抽穗盛期的大麦材料依次取材，分类标记，即为均处于抽穗盛期的待筛选大麦。
所述步骤（2）中的脱蜡处理的具体流程为：将剪取的第一节间大麦茎秆用蒸馏水清洗后晾干，加入甲苯和乙醇体积比为2:1的混合液，沸水浴处理8小时。
所述步骤（2）中的茎秆脆化处理的具体流程为：加入质量分数为5%的氢氧化钠溶液，在微波加热器中微波振荡并恒温加热2h。
所述步骤（3）中的穿刺位置为茎秆上邻近根基部的第一茎节起向上1.5～2cm处。
所述步骤（3）中的同位置穿刺的不同分蘖的茎秆数量不少于10根。
所述步骤（2）中的穿刺仪器采用杭州托普仪器有限公司生产的YYD-1A型便携式植物抗倒伏测定仪。
所述的微波振荡的微波功率为70-90W；所述的恒温加热温度为50-60℃。
本发明相比现有技术有如下优点：
本发明通过选取均处于抽穗盛期的待筛选大麦并剥除包裹茎秆的大麦叶，剪下邻近根基部的第一节间进行脱蜡处理，清洗后进一步进行茎秆脆化处理，烘干后进行穿刺实验，穿刺的部位限定后茎秆上邻近根基部的第一茎节起向上1.5～2cm处，在不同分蘖的茎秆上进行同位置穿刺并记录每次穿刺时刺穿瞬间的压强值，取上述压强值的平均值作为量化评价该脆茎大麦的数值指标；该定量筛选方法用于评价大麦脆茎表型，既可以解决脆茎多基因突变体基因定位和脆茎基因聚合育种中脆茎表型差异度甄别方法的难题，又可以节约分子检测的劳动力和成本，实现了对大麦脆茎表型的定量检测；这一定量筛选方法除了可以应用于脆茎大麦育种外，亦可以应用于脆茎基因定位的表型鉴定和脆茎基因遗传规律研究等众多领域。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
一种脆茎大麦的定量筛选方法，该定量筛选方法的步骤如下：
（1）待筛选大麦单株穗部从剑叶叶鞘中抽出部分达到三分之一时标记该单株抽穗，待该大麦大田抽穗单株的比例为40%-60%时，选择整株抽穗分蘖比例与大田长势相近的健壮植株，从根部整株挖取，洗净根部泥土，去除穗部从剑叶叶鞘中抽出部分不足三分之一的分蘖，晾干后冷藏于-20℃冰箱中，不同抽穗期的大麦材料依次取材，分类标记，获取均处于抽穗盛期的待筛选大麦，并剥除包裹茎秆的大麦叶。（2）标记待筛选大麦第一节间生长方向并剪下，将剪取的第一节间大麦茎秆用蒸馏水清洗后晾干，加入甲苯和乙醇体积比为2:1的混合液，沸水浴处理8小时，清洗后加入质量分数为5%的氢氧化钠溶液，在微波加热器中用70-90W的功率进行微波振荡并维持50-60℃的恒温加热2h，烘干待测。（3）采用杭州托普仪器有限公司生产的YYD-1A型便携式植物抗倒伏测定仪在脆化处理的第一节间茎秆上邻近根基部的第一茎节起向上1.5～2cm处进行同位置穿刺，同位置穿刺的同一脆茎大麦的不同分蘖茎秆数量不少于8根，并记录每次穿刺时该脆茎大麦刺穿瞬间的压强值。（4）取上述压强值的平均值作为量化评价该脆茎大麦的筛选指标。
下面通过具体实施例来进一步说明本发明提供的脆茎大麦的定量筛选方法。
实施例1 抽穗期脆茎大麦与常规大麦不同处理的穿刺实验与压折实验的对比
分别取抽穗期时期新鲜冷藏的脆茎大麦与常规大麦品种金川3号、甘啤3号，分别进行了非剥叶穿刺、剥叶穿刺、叶穿刺、脱蜡并脆化处理后穿刺实验（本发明）和摧折实验，采用浙江托普仪器公司的植物抗倒伏仪YYD-1A测量数据，单位为：kPa或N。
穿刺实验：分别取抽穗期时期新鲜冷藏的脆茎大麦与常规大麦品种金川3号、甘啤3号，选择靠近根基部第一节间开始以上1.5-2.0cm处进行穿刺，记录数据，选择不同分蘖穿刺，重复10次；另剥除包裹茎的大麦叶，进行同位置穿刺实验，记录数据，不同分蘖重复10次；取大麦剑叶在叶片中间部位进行穿刺试验，记录数据，不同分蘖重复10次；另参照本发明的技术流程进行脱蜡脆化处理后进行同位置穿刺实验，记录数据，不同分蘖重复10次。
压折实验：分别取抽穗期时期新鲜冷藏的脆茎大麦与常规大麦品种金川3号、甘啤3号，选择靠近根基部第一节间开始以上15cm两端一定高度架空，植物抗倒伏仪从15cm茎段中间从上而下缓缓压折，记录折断瞬间仪表读数。选择不同分蘖压折，重复10次。
从压折实验可知，脆茎大麦压折瞬间受力均值为54.6N，而常规主栽品种金川3号、甘啤3号压折瞬间受力为67.1N和69.4N，这表明脆茎突变体材料抗压能力要比对照品种金川3号、甘啤3号略低，这反映了脆茎材料比常规品种抗倒伏能力有所下降，但是下降不是非常明显。
分别取抽穗期时期新鲜冷藏材料进行穿刺，结果可知，脆茎突变体材料茎秆的硬度比对照品种金川3号、甘啤3号显著降低。计算压折实验和穿刺实验中脆茎材料和常规品种测量数值差异度，压折实验中，脆茎材料/金川3号=54.6/67.1=0.81，脆茎材料/甘啤3号=54.6/69.4=0.79；而茎秆穿刺实验中，脆茎材料/金川3号=98.4/133.2=0.74，脆茎材料/甘啤3号=98.4/135.7=0.73。由此可见，采用穿刺实验进行测量，脆茎材料与常规品种间的对比更加显著，更有利于脆茎材料定量检测。
采用剑叶穿刺，脆茎材料/金川3号=6.2/8.0=0.78，脆茎材料/甘啤3号=6.2/8.1=0.77；而采用茎秆穿刺实验，脆茎材料/金川3号=98.4/133.2=0.74，脆茎材料/甘啤3号=98.4/135.7=0.73，所以采用茎秆穿刺比剑叶穿刺脆茎材料比常规品种的对比更显著，更有利于脆茎材料的定量筛选。
剥叶穿刺发现，剥离茎秆外包大麦叶后对茎秆的穿刺，脆茎材料/金川3号=52.8/90.0=0.59，脆茎材料/甘啤3号=52.8/93.1=0.57，脆茎材料与常规品种间的对比更加显著，而采用本发明的技术路线，剥离茎秆外包大麦叶后进一步脱蜡、脆化处理后，脆茎材料/金川3号=29.1/64.5=0.45，脆茎材料/甘啤3号=29.1/68.0=0.43，进行所以采用本发明的技术路线脆茎材料与常规品种间的对比更加显著，更有利于脆茎材料定量评价筛选。
分析不同处理的剥叶穿刺与未剥叶穿刺的标准差发现，剥叶穿刺的标准差较未剥叶穿刺的标准差显著降低，表明脆茎与常规品种茎秆的硬度比较稳定，而剥叶处理后进一步脱蜡并脆化处理后穿刺实验的标准差最低，所以采用本发明的技术路线脆茎与常规品种茎秆的硬度最稳定，更有利于脆性大麦的定量筛选。
实施例2 脱蜡脆化处理的抽穗期脆茎材料与常规大麦不同节间穿刺的对比
分别取抽穗期、分蘖期、完熟期的脆茎材料与常规大麦品种镇金川3号、甘啤3号，脱蜡脆化处理后分别进行了抽穗期材料第一节间（本发明）、第二节间、第三节间和分蘖期、完熟期脆茎材料与常规大麦品种穿刺实验的对比，采用浙江托普仪器公司的植物抗倒伏仪YYD-1A测量数据，单位为：kPa，结果如表2。
由表2计算，脆茎突变体与常规品种镇金川3号、甘啤3号茎秆脱蜡脆化处理后不同节间的对比分别为：第一节间（本发明）29.1/64.5=0.45，29.1/68.0=0.43；第二节间26.8/60.2=0.45，26.8/61.9=0.43；第三节间25.2/54.1=0.47，25.2/57.8=0.44。对比发现，脱蜡脆化处理后不同节间穿刺试验，脆茎材料与常规品种的对比差异不显著，但是将标准差对比发现，采用第一节间穿刺的数值间标准差相对后二者小，表明根基部第一节间茎秆硬度比较稳定，更有利于脆茎材料的定量检测筛选。
不同生育期脆茎材料与常规大麦品种剥叶茎秆脱蜡脆化处理后穿刺对比试验发现，分蘖盛期脆茎材料与常规品种的剥叶茎秆脱蜡脆化处理后穿刺对比分别为21.8/43.2=0.50和21.8/46.5=0.47；抽穗期脆茎材料与常规品种的剥叶茎秆脱蜡脆化处理后穿刺对比分别为0.45、0.43；完熟期脆茎材料与常规品种的剥叶茎秆脱蜡脆化处理后穿刺对比分别为38.8/74.9=0.52和38.8/77.4=0.50。由此可以看出，选择抽穗期材料茎秆脱蜡脆化处理后进行穿刺试验，脆茎材料与常规品种间的对比更加显著，更有利于脆茎材料的定量筛选。
由以上实施例能够得知，本发明所提供的脆茎大麦的定量筛选方法能够对脆茎大麦的表型差异度进行显著而又准确的定量评价。
本发明通过选取均处于抽穗盛期的待筛选大麦并剥除包裹茎秆的大麦叶，剪下邻近根基部的第一节间进行脱蜡处理，清洗后进一步进行茎秆脆化处理，烘干后进行穿刺实验，穿刺的部位限定后茎秆上邻近根基部的第一茎节起向上1.5～2cm处，在不同分蘖的茎秆上进行同位置穿刺并记录每次穿刺时刺穿瞬间的压强值，取上述压强值的平均值作为量化评价该脆茎大麦的数值指标；该定量筛选方法用于评价大麦脆茎表型，既可以解决脆茎多基因突变体基因定位和脆茎基因聚合育种中脆茎表型差异度甄别方法的难题，又可以节约分子检测的劳动力和成本，实现了对大麦脆茎表型的定量检测；这一定量筛选方法除了可以应用于脆茎大麦育种外，亦可以应用于脆茎基因定位的表型鉴定和脆茎基因遗传规律研究等众多领域。
以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。