技术领域本发明涉及食品卫生、农产品安全检测领域，特别涉及一种用于水生类蔬菜中544种农药残留的侦测方法。
背景技术：
早在1976年世界卫生组织(WHO)、粮农组织(FAO)和联合国环境规划署(UNEP)共同建立了全球环境检测系统/食品项目(GlobalEnvironmentMonitoringSystem，GEMS/Food)，旨在掌握会员国食品污染状况，了解食品污染物摄入量，保护人体健康，促进贸易发展。现在，世界各国都把食品安全提升到国家安全的战略地位。农药残留限量是食品安全标准之一，也是国际贸易准入门槛。同时，对农药残留的要求呈现出品种越来越多，限量越来越严格的发展趋势，也就是国际贸易设立的农药残留限量门槛越来越高。现在欧盟已制定了839种农药的162248项MRL标准，美国制定了351种农药的39147项MRL标准，日本制定了579种农药的51600多项MRL标准，我国2014年发布了381种农药的3650项MRL标准。目前，国际上普遍采用的一律标准限量为10μg/kg。因此，食品安全和国际贸易都呼唤高通量快速农药残留检测技术，这无疑也给广大农药残留分析工作者提供了机遇和挑战。在目前的众多农药残留分析技术中，色谱质谱联用技术是实现高通量多残留快速检测的最佳分析手段。目前农药残留分析多以气相色谱、液相色谱、气相色谱-质谱和液相色谱-质谱联用技术为主。这些检测技术都首先需要农药标准品对照进行定性。例如，对100种农药的检测就需要准备相应的100种农药标准品对照，而这100种之外的农药都会被漏检。在农兽药残留实验室的实际工作中，绝大多数实验室都不会储备数百种农药标准品，其原因是农药标准品不仅价格昂贵，而且有效期只有2、3年，需要重复投资。一般实验室常备农药标准品只有几十种，其日常监测的农药品种也就只限于这几十种，由此造成食品安全监测漏洞。本发明人团队经过多年潜心研究，研发了二种544种农药的精确质量数据库以及一种水生类蔬菜中544种农药的残留侦测技术，实现了不需标准品对照、即可对水生类蔬菜中500种以上农药残留，同时快速侦测检测，满足了当前农产品中农药残留高通量快速检测的急需。
技术实现要素：
本发明在评价了世界常用1000多种农药的质谱行为特征的基础上，创新性地建立了544种农药TOF/MS和Q-TOF/MS精确质量数据库；创新性地建立了以高分辨精确质量数、同位素分布及同位素丰度等化合物质谱信息为识别标准的，依据TOF/MS和Q-TOF/MS精确质量数据库对544种农药进行侦测和确证的LC-Q-TOF/MS技术方法；创新性地开发了与之配套的水生类蔬菜中农药残留高通量样品制备技术。实现了只需要一次样品制备、一次进样检测，就可以对水生类蔬菜中500多种农药的快速侦测，并且可对侦测出的农药进行Q-TOF/MS数据库确证，彻底改变了原有以化合物标准物为参比的定性模式，是一种不需要标准物对照，快速、高通量、准确可靠的农药残留检测新技术。一、本发明创新性在于：1、创新性地建立了544种农药精确质量可达到0.0001m/z的精确质量数据库，包括TOF/MS数据库和Q-TOF/MS数据库。2、TOF/MS数据库包含544种农药的英文名称、化学分子式、保留时间、精确质量数、同位素分布、同位素丰度以及母离子和碎片离子的全扫描质谱图信息，信息量大，准确全面。3、Q-TOF/MS数据库中每种农药碎片离子的全扫描质谱图信息，是通过对八个不同碰撞能量下全扫描质谱图优选，得到的离子信息丰富的四个不同碰撞能量下碎片离子全扫描图。4、创新性地建立了以高分辨精确质量数、同位素分布及同位素丰度等化合物质谱信息为识别标准的，依据TOF/MS和Q-TOF/MS精确质量数据库对544种农药进行侦测和确证的LC-Q-TOF/MS技术方法，彻底改变了原有以化合物标准物为参比的定性模式，是一种不需要标准物对照，快速、高通量、准确可靠的农药残留检测新技术。5、本发明建立的残留侦测技术方法能够依据目标化合物的保留时间、精确质量数、同位素分布以及同位素丰度等信息，通过与TOF/MS数据库中化合物的对应信息检索比对，给出目标化合物的匹配度得分值。依据目标化合物的得分值，实现对农药的定性侦测。6、本发明建立的残留侦测技术方法能够依据目标化合物碎片离子的全扫描质谱图信息，通过与Q-TOF/MS数据库中化合物碎片离子的全扫描质谱图信息检索比对，给出目标化合物的匹配度得分值，实现对目标化合物的定性确证。相比传统的检测定性确证方法，由于采用了全扫描质谱图信息比对，具有更高的定性准确度。7、开发了与残留侦测技术方法配套的农产品中农药残留高通量样品制备技术。实现了只需要一次样品制备、两次进样检测，就可以对农产品中500多种农药的快速侦测和确证。8、LC-Q-TOF/MS主要侦测技术指标：扫描范围50-1600m/z；测定的精确质量可达0.0001m/z；质量精度可控制在分子质量的10ppm以内；扫描速度在50-1600m/z范围为每秒4次。LC-Q-TOF/MS主要侦测技术特点：样品一次制备，可在1小时内完成544种农药侦测、定性与确证；80％以上农药确证点达到10个以上；在同时侦测的544种农药中，327种农药侦测灵敏度低于一律标准10微克/千克，占比64.1％，基本满足各国农药残留MRL水平筛查的要求。二、本发明采用的技术方案：1、建立精确质量数据库1.1TOF/MS数据库的建立在TOF/MS模式下，分别测定每种农药标准物在指定色谱质谱条件下的保留时间，确定该化合物ESI源下的离子化形式(+H，+NH4，+Na)及化学式，得到每种化合物母离子的精确质量数，同位素峰分布和丰度比。将544种农药的名称、保留时间、分子式、精确质量数、同位素峰分布和丰度比等信息导入到数据库CSV软件文件中，形成TOF/MS数据库。1.2Q-TOF/MS数据库的建立在AgilentMassHunter数据采集界面依次输入TOF/MS数据库中544种农药的母离子，在Q-TOF/MS模式下，对544种农药分别在8个碰撞能量下，进行碎片离子全扫描质谱图采集。优选其中离子信息丰富的3-5个不同碰撞能量下碎片离子全扫描质谱图导入数据库软件文件中，并与对应的农药信息相关联，建成Q-TOF/MS数据库。2、建立以高分辨精确质量数、同位素分布及同位素丰度等化合物信息为识别标准的，544种农药LC-Q-TOF/MS侦测和确证技术方法，技术步骤包括：2.1样品制备：水生类蔬菜样品经1％醋酸乙腈提取，Carbon/NH2柱净化，乙腈+甲苯(3+1，v/v)洗脱残留农药，经浓缩、溶解和过滤后制成待测样液；所述水生类蔬菜包括茭白、豆瓣菜、莲藕、荸荠和水芹；2.2色谱质谱检测：采用配有反相色谱柱(ZORBAXSB-C18，2.1mm×100mm，3.5μm)的液相色谱分离待测样液中的农药，配有电喷雾离子源的LC-Q-TOF-MS检测；2.3TOF/MS数据库定性侦测方法：在AgilentMassHunter定性软件中调用已建立的TOF/MS数据库，依据TOF/MS数据库对目标化合物定性检索，检索参数保留时间偏差限定为±0.5min，精确质量偏差限定为±10ppm，离子化形式选择+H，+NH4，+Na模式，软件会依据每种化合物保留时间、精确质量等要素的实测值与TOF/MS数据库中理论值的偏差，以及同位素分布和同位素比例四个参数，通过科学地设定各个要素在匹配度得分计算中的权重(其中精确质量数偏差的权重最高)，给出检索匹配得分值，检索匹配得分值较高的化合物，为疑似检出化合物，依据TOF/MS数据库定性侦测农产品中农药残留的方法准确度，达到90％以上；2.4Q-TOF/MS数据库定性确证方法：在TargetedMS/MS采集模式下，输入疑似检出化合物的母离子，保留时间和最佳的碰撞能量，对待测样液再次检测，将检测质谱图与Q-TOF/MS数据库中化合物碎片离子的全扫描质谱图，在镜像对比条件下匹配，根据特征离子分布与谱库是否一致，二级碎片精确质量数偏差和碎片离子的比例给出得分，其匹配得分值较高，即确认检出该目标化合物。该确证方法采用全扫描质谱图匹配确证，使80％以上农药确证点可以达到10个以上，比标准的4个确证点要求，具有更高的定性准确度。三、本发明的技术内容：本发明提供二种544种农药的精确质量数据库以及一种用于检测水生类蔬菜中544种农药残留侦测技术。1、本发明提供的二种精确质量数据库为TOF/MS数据库和Q-TOF/MS数据库。1.1TOF/MS数据库技术内容包括：544种农药的化学式，精确质量数，保留时间以及农药英文名称等信息。TOF/MS数据库中3种化合物技术内容示例如下：1.2Q-TOF/MS数据库技术内容包括：544种农药在4个碰撞能量下的碎片离子信息质谱图。Q-TOF/MS数据库技术内容示例如图1所示。2、本发明提供了一种水生类蔬菜中544种农药LC-Q-TOF/MS侦测和确证技术方法。侦测和确证技术方法内容包括如下：2.1样品制备2.1.1水生类蔬菜样品取可食部分切碎，混匀，密封，标明标记。2.1.2称取10g水生类蔬菜样品(精确至0.01g)，于80mL离心管中，加入40mL1％醋酸乙腈，用高速匀浆机13500r/min，匀浆提取1min，加入1g氯化钠，4g无水硫酸镁，振荡5min，在4200r/min下离心5min，取上清液20mL，在40℃水浴中旋转蒸发浓缩至约1mL，待净化。2.1.3在Carbon/NH2柱中加入约2cm高无水硫酸钠。先用4mL乙腈+甲苯(3+1，v/v)淋洗SPE柱，并弃去流出液，当液面到达硫酸钠的顶部时，迅速将样品浓缩液转移至净化柱上，下接新鸡心瓶接收。再每次用2mL乙腈+甲苯(3+1，v/v)洗涤样液瓶三次，并将洗涤液移入SPE柱中。在柱上连接50mL贮液器，再用25mL乙腈+甲苯(3+1，v/v)洗脱农药，合并于鸡心瓶中，并在40℃水浴中旋转浓缩至约0.5mL。2.1.4将浓缩液置于氮气下吹干，加入2mL的乙腈+0.1％甲酸水(2+8，v/v)混匀，经0.2μm滤膜过滤后定容，得到待测样品溶液a。2.2LC-Q-TOF/MS检测2.2.1液相色谱分离：待测样品溶液a通过配有反相色谱柱(ZORBAXSB-C18，2.1mm×100mm，3.5μm)的液相色谱系统分离；流动相A为5mM的乙酸铵-0.1％甲酸-水；流动相B为乙腈；液相色谱梯度洗脱程序为：0min：1％B，3min：30％B，6min：40％B，9min：40％B，15min：60％B，19min：90％B，23min：90％B，23.01min：1％B，后运行4min；流速为0.4mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL。2.2.2质谱检测：Agilent6530LC-Q-TOF/MS在电喷雾电离正离子模式(ESI+)；毛细管电压：4000V；干燥气温度：325℃；干燥气流量10L/min，鞘流气流速11L/min，鞘流气温度为325℃；雾化气压力40psi，锥孔电压60V，碎裂电压140V。全扫描质核比范围为50-1600m/z，并采用内标参比溶液对仪器质量精度进行实时校正。通过AgilentMassHunterWorkstationSoftware(versionB.05.00)对质谱数据采集与处理。2.3TOF/MS数据库定性侦测在AgilentMassHunter定性软件中调用已建立的TOF/MS数据库，设置检索参数保留时间偏差为±0.5min，精确质量偏差为±10ppm，离子化形式选择+H，+NH4，+Na模式；依据TOF/MS数据库对上述采集的样品溶液质谱数据进行定性检索，通过软件计算出每种化合物检索匹配得分值，检索匹配得分值＞70的化合物，为疑似检出化合物。2.4Q-TOF/MS数据库定性确证在TargetedMS/MS采集模式下，输入疑似检出化合物的母离子，保留时间和最佳的碰撞能量，对待测样品溶液a再次检测，将检测质谱图与Q-TOF/MS数据库中化合物碎片离子的全扫描质谱图，在镜像对比条件下匹配确证。其匹配得分值＞70，即确认检出该目标化合物。本发明相比现有技术所具有的有益效果为：1、本发明以高分辨精确质量数、同位素分布及同位素丰度等化合物信息为识别标准，建立的500多种农药侦测和确证技术方法，彻底改变了原有以化合物标准物为参比的定性模式，是一种不需要标准物对照，快速、高通量、准确可靠的农药残留检测新技术；2、本发明在不需标准物对照的前提下，实现了500多种农药残留的定性侦测和确证，可以大大节省购买标准物的成本，也更加环保、安全；3、本发明可在1小时内完成500多种农药侦测、定性与确证，与传统检测方法相比较，可以提高工作效率数百倍；4、本发明能够做到对水生类蔬菜样品中500多种农药残留一次性提取净化，一次进样检测，与传统检测方法相比较，可以节省检测成本、提高工作效率数百倍；5、本发明同时侦测的544种农药中，有327种农药侦测灵敏度低于10微克/千克，占比64.1％，基本满足各国农药残留MRL水平筛查的要求；6、本发明在不需农药标准物对照的前提下，依据精确质量数据库对目标化合物的定性和确证，使80％以上农药确证点达到10个以上，全部农药满足欧盟对化合物4个确证点的要求，定性结果更加准确可靠；7、本发明可以测试的水生类蔬菜样品中农药包括以下物质中的一类或几类：有机磷类农药，氨基甲酸酯类农药，苯并咪唑类农药，磺酰脲类农药，烟碱类农药，除虫菊酯类农药及其他类型的农药及代谢物；8、本发明建立的侦测技术指标：扫描范围50-1600m/z；测定的精确质量可达0.0001m/z；质量精度可控制在分子质量的10ppm以内；扫描速度在50-600m/z范围为每秒4次；9、本发明提供的二种544种农药的精确质量数据库以及一种用于检测水生类蔬菜中544种农药残留侦测技术已经在7个农药残留分析实验室得到推广和应用，经过对30省市500多个市售水生类蔬菜样品的侦测验证，取得了重要的残留侦测数据。附图说明图1茭白样品全扫描模式TOF得分图；图2茭白样品中疑似农药二级采集方法示例图；图3茭白样品中检出农药二级Q-TOF/MS确证得分图。图4豆瓣菜样品全扫描模式TOF得分图；图5豆瓣菜样品中疑似农药二级采集方法示例图；图6豆瓣菜样品中检出农药二级Q-TOF/MS确证得分图。图7荸荠样品全扫描模式TOF得分图；图8荸荠样品中疑似农药二级采集方法示例图；图9荸荠样品中检出农药二级Q-TOF/MS确证得分图。具体实施方式实施例1水生类蔬菜(以茭白为例)中544种农药(见表1)LC-Q-TOF/MS侦测和确证技术实施实例，包括如下步骤：1、样品前处理技术的具体步骤：1.1茭白样品取可食部分切碎，混匀，密封，标明标记；1.2称取10g茭白样品(精确至0.01g)，于80mL离心管中，加入40mL1％醋酸乙腈，用高速匀浆机13500r/min，匀浆提取1min，加入1g氯化钠，4g无水硫酸镁，振荡5min，在4200r/min下离心5min，取上清液20mL，在40℃水浴中旋转蒸发浓缩至约1mL，待净化。1.3在Carbon/NH2柱中加入约2cm高无水硫酸钠。先用4mL乙腈+甲苯(3+1，v/v)淋洗SPE柱，并弃去流出液，当液面到达硫酸钠的顶部时，迅速将样品浓缩液转移至SPE柱中，下接新鸡心瓶接收。再每次用2mL乙腈+甲苯(3+1，v/v)洗涤样液瓶三次，并将洗涤液移入SPE柱中。在柱上连接50mL贮液器，用25mL乙腈+甲苯(3+1，v/v)洗脱农药及相关化学品，合并于鸡心瓶中，并在40℃水浴中旋转浓缩至约0.5mL。1.4将浓缩液置于氮气下吹干，加入2mL的乙腈+水(2+8，v/v)混匀，经0.2μm滤膜过滤后定容，得到待测样品溶液。2、LC-Q-TOF/MS操作条件色谱条件：液相色谱流动相A为5mM的乙酸铵-0.1％甲酸-水；流动相B为乙腈；梯度洗脱程序为：0min：1％B，3min：30％B，6min：40％B，9min：40％B，15min：60％B，19min：90％B，23min：90％B，23.01min：1％B，后运行4min；流速为0.4mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL。质谱条件：Agilent6530LC-Q-TOF/MS质谱仪的毛细管电压：4000V；干燥气温度：325℃；干燥气流量10L/min，鞘流气流速11L/min，鞘流气温度为325℃；雾化气压力40psi，锥孔电压60V，碎裂电压140V。全扫描质核比范围为50-1600m/z，并采用内标参比溶液对仪器质量精度进行实时校正。通过AgilentMassHunterWorkstationSoftware(versionB.05.00)对质谱检测结果采集与处理。3水生类蔬菜(以茭白为例)中农药残留侦测3.1在全扫描模式下测定样品溶液，将侦测结果与TOF数据库进行比对，得出1级TOF得分，见图1。3.2对于得分满足要求的化合物，在软件中建立二级采集方法，详见图2。3.3在MS/MS模式下，重新运行样品溶液，获得样品碎片离子全扫描数据，将其与二级质谱图库中碎片离子信息进行比对，得到二级QTOF得分，见图3。4某省会城市茭白样品中LC-Q-TOF/MS侦测结果采集某省会城市市售茭白样品21个，应用LC-Q-TOF/MS技术进行544种农药残留侦测，LC-Q-TOF/MS技术检出4种农药残留，共计4频次，涉及样品19个，具体结果见表2。表1544种农药LC-Q-TOF/MS侦测参数表表2某地区茭白样品中LC-Q-TOF/MS侦测结果实施例2水生类蔬菜(以豆瓣菜为例)中544种农药(见表1)LC-Q-TOF/MS侦测和确证技术实施实例。样品前处理步骤、LC-Q-TOF/MS操作条件均参照实施例1中的处理条件。在全扫描模式下测定样品溶液，将侦测结果与TOF数据库进行比对，得出1级TOF得分，见图4；对于得分满足要求的化合物，在软件中建立二级采集方法，详见图5；在MS/MS模式下，重新运行样品溶液，获得样品碎片离子全扫描数据，将其与二级质谱图库中碎片离子信息进行比对，得到二级QTOF得分，见图6。某省会城市豆瓣菜样品中LC-Q-TOF/MS侦测结果：采集某省会城市市售豆瓣菜样品12个，应用LC-Q-TOF/MS技术进行544种农药残留侦测，LC-Q-TOF/MS技术检出6种农药残留，共计13频次，涉及样品12个，具体结果见表3。表3某地区豆瓣菜样品中LC-Q-TOF/MS侦测结果实施例3水生类蔬菜(以荸荠为例)中544种农药(见表1)LC-Q-TOF/MS侦测和确证技术实施实例。样品前处理步骤、LC-Q-TOF/MS操作条件均参照实施例1中的处理条件。在全扫描模式下测定样品溶液，将侦测结果与TOF数据库进行比对，得出1级TOF得分，见图7；对于得分满足要求的化合物，在软件中建立二级采集方法，详见图8；在MS/MS模式下，重新运行样品溶液，获得样品碎片离子全扫描数据，将其与二级质谱图库中碎片离子信息进行比对，得到二级QTOF得分，见图9。某省会城市荸荠样品中LC-Q-TOF/MS侦测结果：采集某省会城市市售荸荠样品9个，应用LC-Q-TOF/MS技术进行544种农药残留侦测，LC-Q-TOF/MS技术检出2种农药残留，共计2频次，涉及样品5个，具体结果见表4。表4某地区荸荠样品中LC-Q-TOF/MS侦测结果