用于诊断的细胞表面前列腺癌抗原的制作方法
本申请要求2014年1月17日提交的美国临时专利申请号61/928,776的美国优先权，其全部内容通过交叉引用被并入本文。
发明领域
本发明总体上涉及前列腺癌诊断学领域。特别地，本发明涉及生物样品中生物标记的鉴定，其可用于前列腺癌的检测。鉴定的标记还可用于确定预后和监测对前列腺癌患者治疗的响应。
发明背景
前列腺癌是最常诊断的内脏癌症和美国男性癌症死亡的第二主要的原因。美国癌症学会估计2013年约238,590个前列腺癌的新病例将被诊断，并且29,720个男性将死于该疾病。总体上，六分之一的男性在他们的一生将被诊断有前列腺癌。
目前，前列腺癌可通过数字直肠检查(DRE)或通过患者血液中前列腺特异抗原(PSA)的测量来检测。然而，这两种试验都不是完全决定性的，二者均可导致假阴性(留下未检测到的真正的癌症)和假阳性(发出癌症信号，而该癌症不存在)。例如，以推荐的4.0ng/ml截止值进行的标准的PSA试验对癌症患者是86％敏感，但是只是33％特异，在大致67％的非癌症患者中产生假阳性(Hoffman等，2002)。假阳性之后通常是创伤的和疼痛的活组织检查。
存在对具有提高的准确性和/或灵敏度的前列腺癌诊断检测的需求。
发明概述
本发明部分基于磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(GPC-1)水平在前列腺癌患者的体液或组织中升高的发现。本发明人已发现磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1是前列腺癌的新标记。因此，本发明提供检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1以确定患者中前列腺癌存在的方法。
在一个实施方式中，发明提供检测患者前列腺癌的方法，包括获得来自患者的体液或组织样品，使所述样品与抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体接触，基于所述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体与所述体液或组织样品的结合来确定所述患者具有前列腺癌或发展前列腺癌的增加的可能性。在一些实施方式中，一种或多种另外的前列腺标记的水平在体液或组织样品中测量，患者具有癌症的确定基于患者体液或组织样品中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的水平和一种或多种另外的标记的水平。在一些实施方式中，癌症是前列腺癌，另外的标记是PSA。在一些实施方式中，抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体是MIL-38。在其它实施方式中，抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体不是MIL-38。在一些实施方式中，抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体是能结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的抗体片段或重组抗体。在一些实施方式中，抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体被标记以容易检测。在一些实施方式中，抗体标记可以是荧光标记、生物素-亲和素放大系统、化学发光系统、微球体或胶体金等。
在一些实施方式中，获自患者的体液样品是血液、血清、血浆、或尿样品。
在一个实施方式中，比较结合到患者的体液或组织样品的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体与对照样品的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体结合的水平；其中相对于对照样品增加的体液或组织样品的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体结合与前列腺癌的存在相关。在一些实施方式中，所述对照样品包括来自年龄匹配的无前列腺癌的患者的体液。
在其它实施方式中，比较结合到患者的体液或组织的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体的水平与结合到参考标准的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体的水平，其中相对于参考标准样品增加的体液或组织样品的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体结合与前列腺癌的存在相关。在一些实施方式中，所述参考标准包括具有已知磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1含量的样品。在一些实施方式中，将结合到体液或组织的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的比较与结合到磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1标准品的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1比较以定量所述体液中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的量。
在一些实施方式中，体液样品中高于约0.1ng/ml、0.5ng/ml、1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml或20ng/ml的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1含量指示前列腺癌。
发明的诊断方法可进一步包括施用一种或多种前列腺癌治疗给患者，和跟踪作为机制的体液或组织中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1水平的改变以监测患者恢复或对前列腺癌治疗的响应。在一些实施方式中，抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体结合通过技术如免疫荧光、放射性标记、免疫印迹、酶联免疫测定、流式细胞术、光密度、和化学发光来检测。
本发明还包括检测患者体液或组织中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的试剂盒。在一个实施方式中，检测前列腺癌的试剂盒包括第一抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体、药学上可接受的载体、和磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1标准品；其中所述试剂盒能检测患者体液或组织中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1。在一些实施方式中，试剂盒进一步包括第二配体。在一些实施方式中，第二配体是第二抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体。在一个实施方式中，第二抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体与第一抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体相同。
在一些实施方式中，第二配体与标记缀合，用于所述配体的快速检测。
本发明因此至少涉及下面的下列系列的编号的实施方式：
实施方式1：检测患者中前列腺癌的方法，所述方法包括测量来自患者的体液样品中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的水平和基于体液样品中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的水平确定所述患者具有前列腺癌或增加的发展前列腺癌的可能性。
实施方式2：实施方式1所述的检测患者中前列腺癌的方法，包括以下步骤：
(a)从患者获得体液样品；
(b)使所述体液样品与抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体接触；和
(c)基于所述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体与所述体液样品的结合确定所述患者具有前列腺癌或增加的发展前列腺癌的可能性。
实施方式3：实施方式2所述的方法，其中所述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体是MIL-38。
实施方式4：实施方式2所述的方法，其中所述体液样品与抗体群接触，其中：
所述群中的抗体包括：
(a)重链可变区，包括：
互补决定区1(CDR1)，包括SEQ ID NO:10的位置50-54限定的氨基酸序列或由SEQ ID NO:10的位置50-54限定的氨基酸序列组成；
互补决定区2(CDR2)，包括SEQ ID NO:10的位置69-85限定的氨基酸序列或由SEQ ID NO:10的位置69-85限定的氨基酸序列组成；
互补决定区3(CDR3)，包括SEQ ID NO:10的位置118-126限定的氨基酸序列或由SEQ ID NO:10的位置118-126限定的氨基酸序列组成；和
(b)轻链可变区，包括：
互补决定区1(CDR1)，包括SEQ ID NO:11的位置44-54限定的氨基酸序列或由SEQ ID NO:11的位置44-54限定的氨基酸序列组成；
互补决定区2(CDR2)，包括SEQ ID NO:11的位置70-76限定的氨基酸序列或由SEQ ID NO:11的位置70-76限定的氨基酸序列组成；
互补决定区3(CDR3)，包括SEQ ID NO:11的位置109-117限定的氨基酸序列或由SEQ ID NO:11的位置109-117限定的氨基酸序列组成；和
所述群中的抗体不包括轻链可变区，所述轻链可变区包括：
互补决定区1(CDR1)，包括SEQ ID NO:12的位置48-58限定的氨基酸序列或
由SEQ ID NO:12的位置48-58限定的氨基酸序列组成；
互补决定区2(CDR2)，包括SEQ ID NO:12的位置74-80限定的氨基酸序列或由SEQ ID NO:12的位置74-80限定的氨基酸序列组成；
互补决定区3(CDR3)，包括SEQ ID NO:12的位置113-121限定的氨基酸序列或由SEQ ID NO:12的位置113-121限定的氨基酸序列组成。
实施方式5：实施方式4所述的方法，其中所述抗体群由2014年8月22日在澳大利亚细胞库(CBA)在登录号CBA20140026下保藏的杂交瘤细胞产生或另外与2014年8月22日在澳大利亚细胞库(CBA)在登录号CBA20140026下保藏的杂交瘤细胞产生的抗体群相同。
实施方式6：实施方式2所述的方法，其中所述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体不是MIL-38。
实施方式7：实施方式2至4中任一项所述的方法，其中所述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体是能结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的抗体片段或重组抗体。
实施方式8：实施方式2至7中任一项所述的方法，其中所述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体被标记。
实施方式9：实施方式8所述的方法，其中所述标记选自放射性标记、荧光标记、生物素-亲和素放大系统、化学发光系统、微球体、和胶体金。
实施方式10：实施方式2至9中任一项所述的方法，其中抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体结合通过选自以下的技术来检测：免疫荧光、放射性标记、免疫印迹、蛋白质印迹法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、流式细胞术、免疫沉淀、免疫组织化学、生物膜试验、亲和环试验、抗体阵列光密度试验、和化学发光。
实施方式11：实施方式1所述的方法，其中将来自患者的体液样品中所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的水平与对照样品中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的水平比较；其中相对于对照样品增加的体液样品的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体结合与前列腺癌的存在相关。
实施方式12：实施方式11所述的方法，其中所述体液样品的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的水平相对于对照样品中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的水平增加50％或更多指示前列腺癌。
实施方式13：实施方式2至10中任一项所述的方法，其中将与所述体液样品的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体结合与对照样品的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体结合比较；其中相对于对照样品增加的体液样品的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体结合与前列腺癌的存在相关。
实施方式14：实施方式13所述的方法，其中相对于对照样品的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体结合水平，与所述体液样品的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体结合增加50％或更多指示前列腺癌。
实施方式15：实施方式2至10、13或14中任一项所述的方法，其中将结合到所述体液样品的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体与结合到一种或多种磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1标准品的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体比较；其中所述标准品的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体结合用于定量所述体液样品中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的量。
实施方式16：实施方式1至15中任一项所述的方法，其中所述体液样品中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1含量高于约10ng/ml指示前列腺癌。
实施方式17：实施方式1至16中任一项所述的方法，进一步包括：
测量来自患者的体液样品中前列腺特异性抗原(PSA)的水平，和
基于(i)体液样品中测量的PSA水平，和(ii)所述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体与所述体液样品的结合，确定所述患者具有前列腺癌或增加的发展前列腺癌的可能性。
实施方式18：实施方式17所述的方法，其中前列腺特异性抗原(PSA)的水平在来自患者的血液样品中测量。
实施方式19：实施方式17或实施方式18所述的方法，其中将测量的体液样品中前列腺特异性抗原(PSA)的水平与对照样品中测量的PSA水平比较；其中相对于对照样品，体液样品中增加的PSA水平与前列腺癌的存在相关。
实施方式20：实施方式1至19中任一项所述的方法，其中所述体液选自血液、血清、血浆、和尿。
实施方式21：检测前列腺癌的试剂盒，包括第一抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体、药学上可接受的载体、和磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1标准品；其中所述试剂盒能检测患者体液中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1。
实施方式22：实施方式21所述的试剂盒，其中所述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体不是MIL-38。
实施方式23：实施方式21所述的试剂盒，其中所述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体是MIL-38。
实施方式24：实施方式21所述的试剂盒，其中所述抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体是实施方式4、5或7中任一项提到的抗体。
实施方式25：实施方式21至24中任一项所述的试剂盒，进一步包括第二配体。
实施方式26：实施方式25所述的试剂盒，其中所述第二配体是第二抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体或能结合到磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的适配体；其中所述第二抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体可以与第一抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体相同。
实施方式27：实施方式25或实施方式26所述的试剂盒，其中所述第二配体与标记缀合，用于所述配体的快速检测。
实施方式28：实施方式27所述的试剂盒，其中所述标记用于选自以下的检测方法：免疫荧光、放射性标记、免疫印迹、蛋白质印迹法、酶联免疫吸附测定(ELISA)、流式细胞术、免疫沉淀、免疫组织化学、生物膜试验、亲和环试验、抗体阵列光密度试验、和化学发光。
实施方式29：实施方式22至28中任一项所述的试剂盒，其中试剂盒包括进行ELISA的组分。
附图简述
图1.细胞结合的MIL-38磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗原的表征。
将DU-145前列腺癌细胞用细胞膜蛋白提取试剂盒(MPEK,Merck)处理并同与磁珠连接的MIL-38抗体温育。然后在洗脱抗原和将所述抗原进行质谱法分析之前将抗原在磁珠上免疫沉淀和清洗。质谱法分析的结果显示鉴定磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1为MIL-38抗原。将跨越磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1蛋白的18个独特的肽序列加下划线。
图2.MIL-38免疫沉淀和尺寸排阻层析。
DU-145前列腺癌细胞膜提取物利用MIL-38免疫沉淀并通过尺寸排阻层析柱流动。图显示利用MIL-38抗体或第二抗体对照的偶数编号的层析部分的蛋白质印迹分析。MIL-38抗原在部分A28和A30中显示在60Kd。
图3.尺寸排阻层析纯化的MIL-38抗原的质谱法。
将来自图2尺寸排阻层析分离的部分编号A29通过质谱法分析。质谱法分析结果显示鉴定磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1为MIL-38抗原，跨越磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1蛋白的8个独特的肽序列加下划线。
图4.MIL-38和抗GPC-1抗体在2D凝胶蛋白质印迹上显示重叠的反应性。
将DU-145前列腺癌细胞的细胞膜蛋白提取物在2D凝胶(pI梯度水平的和分子质量垂直的)上分离。利用MIL-38抗体和商品化rGPC-1兔多克隆抗体的蛋白质印迹显示标记60Kd蛋白的重叠的反应性(在图中圈起的)。泳道D是作为对照的DU-145提取物的一维分离。泳道M是作为对照的分子大小标记的一维分离泳道。
图5.MIL-38可检测GPC-1抗体的免疫沉淀物，反之亦然。
MIL-38和兔抗GPC-1抗体各自用于从DU-145前列腺癌或C3(MIL-38阴性)细胞膜蛋白提取物免疫沉淀它们的抗原。显示的是用MIL-38或抗GPC-1抗体检测的免疫沉淀物的蛋白质印迹。图5A描绘MIL-38免疫沉淀物的GPC-1检测(左)和GPC-1免疫沉淀物的MIL-38检测(右)。图5B描绘作为对照的MIL-38免疫沉淀物的MIL-38检测。泳道是：Magic Mark-作为对照的商品化蛋白质标记；DU145MPEK-前列腺癌膜蛋白提取物(未被免疫沉淀)；DU145FT-来自免疫沉淀的前列腺癌流通(flow through)；DU145IP-利用抗体的免疫沉淀物；C3MPEK-(MIL-38阴性)对照膜蛋白提取物(未被免疫沉淀)；C3FT-来自免疫沉淀的(MIL-38阴性)细胞流通；C3IP洗脱-利用抗体的(MIL-38阴性)细胞免疫沉淀物。MIL-38可检测来自rGPC-1抗体的免疫沉淀物，反之亦然。MIL-38还可结合到包括DU145MPEK的所有对照和结合到通过MIL-38进行的IP。
图6.MIL-38检测重组磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1
测试NS0细胞中产生的重组磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1与MIL-38和抗GPC-1抗体的反应性。蛋白质印迹显示MIL-38和兔多克隆抗GPC-1抗体两者与重组磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的反应性。泳道是：Magic Mark-作为对照的商品化蛋白质标记；GPC-1-重组磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1蛋白；GPC-1red-具有还原剂的重组磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1蛋白。
图7.MIL-38可检测分泌到细胞培养上清液中的抗原。
将DU-145前列腺癌细胞与无血清培养基温育36小时以产生无细胞的条件培养基。将没有任何细胞的条件培养基利用MIL-38抗体免疫沉淀并和利用DU-145MPEK膜蛋白提取物的标准IP比较。显示的是利用MIL-38抗体的免疫沉淀物的蛋白质印迹。MIL-38抗体可在条件液体培养基中检测40和55kD的抗原。
图8.细胞培养上清液中检测的MIL-38抗原是磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1
将DU-145前列腺癌细胞与无血清培养基温育36小时以产生无细胞的条件培养基。将条件培养基利用MIL-38抗体免疫沉淀，并将免疫沉淀物送去进行质谱法分析。图8A.将含有40和55kD MIL-38反应性抗原的样品进行质谱法分析。质谱法分析的结果显示从条件液体培养基鉴定磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1为MIL-38抗原，跨越磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1蛋白N端的9个独特的肽序列加下划线。图8B.将含有40kDa MIL-38反应性抗原的样品进行质谱法分析。质谱法分析的结果显示从条件液体培养基鉴定磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1为MIL-38抗原，跨越磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1蛋白N端的10个独特的肽序列加下划线。图8C.将含有55kDa MIL-38反应性抗原的样品进行质谱法分析。质谱法分析的结果显示从条件液体培养基鉴定磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1为MIL-38抗原，跨越磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1蛋白N端的9个独特的肽序列加下划线。
图9.MIL-38抗体可检测前列腺癌患者血浆中和前列腺癌的膜提取物中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1。
图9A.将来自一个正常对照患者和一个前列腺癌患者的血浆样品用MIL-38抗体免疫沉淀。显示用MIL-38和rGPC1抗体的蛋白质印迹。MIL-38在前列腺癌患者血浆中较在对照患者血浆中免疫沉淀更高水平的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1蛋白。泳道是：046IP NT-来自前列腺癌血浆的IP；046IP HepI-来自用肝素酶处理的前列腺癌血浆的IP；042IP NT-来自正常对照血浆的IP；042IP HepI-来自用肝素酶处理的正常对照血浆的IP；Magic Mark-作为对照的商品化蛋白质标记。图9B.来自一个正常前列腺和一个前列腺癌的膜蛋白提取物获自Novus Bio。利用MIL-38抗体进行相等量的蛋白质的蛋白质印迹。前列腺癌提取物表明更高的MIL-38抗原表达。
图10.MIL-38可在前列腺癌患者尿中检测癌症。
收集来自125个年龄匹配的患者的尿样品和利用MIL-38抗体在间接免疫荧光测定中测试前列腺癌的存在。基于活组织检查证实(BPH、CaP)或危险因素分析(健康对照)，将患者分类为健康对照、良性前列腺肥大(BPH)或前列腺癌(CaP)。图显示CaP实验样品；DU145阳性对照样品；和C3阴性对照样品的示范图。
图11.MIL-38可在许多种ELISA形式中检测重组磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1
夹心ELISA利用0、0.1、1或10ng重组人NS0-产生的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1蛋白(rhGPC1)作为分析物来进行。图11A.用MIL-38抗体的捕获，用兔多克隆抗GPC1(a-GPC1)的检测。图11B.用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体的捕获，用MIL-38的检测。
图11C.用MIL-38的捕获，用生物素化的MIL-38的检测。
图12.利用不同MIL-38抗体制剂作为捕获抗体进行的比较夹心ELISA。
图12A显示利用AM3和AM4作为捕获抗体的比较夹心ELISA。图12B显示利用混合制剂(34A)或克隆群(AM4 1F5)作为捕获抗体的比较夹心ELISA。
图13.抗体筛选的原始数据的箱式图。
AM4MIL-38抗体与合成肽中每个的结合在基于PEPSCAN的ELISA中测试。箱的底部和顶部是数据的第25和第75百分位数。接近箱中间的带是第50百分位数(中位数)。须线是在1.5的四分位数间距，指示数据集内的统计学异常值(Mcgill et al.,The American Statistician,32:12-16,1978)；
图14.在组3的取代分析上探查的MIL38-AM4的Letterplot表示(实施例13)。
详细描述
本发明部分基于磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(GPC-1)水平在前列腺癌患者的体液或组织中升高的发现。本发明人已发现磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1是前列腺癌的新标记。因此，本发明提供检测患者中前列腺癌存在的方法。
正常的人细胞在端粒缩短使它们不能存活之前只能四十至六十次细胞分裂。然而，前列腺癌细胞不受分裂的海弗利克极限影响并连续无限分裂，引起异常生长。
癌症最常见的表现是患者身体中肿瘤的形成。在本发明的一些实施方式中，前列腺癌肿瘤可以是无痛的和无症状的。在其它实施方式中，肿瘤可引起身体不舒服或其它局限的症状如流体堵塞或出血。在一些实施方式中，本发明的前列腺癌可引起全身性症状如破坏正常的身体功能引起的那些症状。在其它实施方式中，本发明的前列腺癌的症状可包括肠排便习惯(bowel habits)或膀胱功能的改变。
良性前列腺肿瘤(非癌性的)和恶性前列腺肿瘤(癌性的)之间的区别因素之一是转移的能力。转移是癌症扩展(转移)到身体其它部分的能力。将患者中的前列腺癌根据疾病的进展进一步分成期。最常见的分期系统是TNM系统，其基于以下分类癌症：原发肿瘤(T)的大小和范围、癌症向附近淋巴结(N)的扩展、和原发肿瘤向身体其它部分的转移(M)形成的继发肿瘤的存在(美国癌症学会)。表1显示每个癌症时期的实例定义。
表1.TNM系统的癌症时期的定义，改编自美国癌症学会。
在一些实施方式中，本发明可检测在任何一个或多个期的癌症。
在一些实施方式中，本发明的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1由SEQ ID NO:1编码。在一些实施方式中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1蛋白是SEQ ID NO:2的全氨基酸序列。在一些实施方式中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1蛋白不包括SEQ ID NO:3的信号肽。在一些实施方式中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1蛋白不包括SEQ ID NO:4的前肽。在一些实施方式中，本发明的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1蛋白是SEQ ID NO:5。在一些实施方式中，本发明的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1包括磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1变体如同种型、剪接变体、和同种异型。本发明还提供测定具有前列腺癌的患者预后的方法。在一个实施方式中，所述方法包括从患者获得体液或组织测试样品、测量所述体液或组织中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的水平、和比较所述水平与值的固定范围，其中较高的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1水平与较差的预后或不太有利的患者结局相关。
可用本发明检测的前列腺癌的非限制实例包括前列腺上皮内瘤、腺癌、平滑肌肉瘤、和横纹肌肉瘤
抵抗癌症最有力的工具之一是早期检测。癌症早期趋于更容易治疗，并且如果疾病仍然是局限的，那么大多数癌症的预后通常较好。存在许多可辅助诊断癌症的测试。在一些实施方式中，本发明单独使用磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1来检测前列腺癌。在其它实施方式中，GPC-1与另一种抗原一起使用，其中前列腺癌的存在通过两种抗原的检测来确定。在一个实施方式中，其它抗原是PSA。
本发明提供检测前列腺癌的方法。前列腺癌是最常诊断的内脏癌症和美国男性癌症死亡的第二主要的原因。美国癌症学会估计2013年约238,590个前列腺癌的新病例将被诊断，并且29,720个男性将死于该疾病。总体上，六分之一的男性在他们的一生将被诊断有前列腺癌。前列腺癌已与包括排尿困难、勃起功能障碍和疼痛在内的许多症状相关。虽然大多数前列腺癌缓慢生长，但是存在侵袭性前列腺癌的病例，其可转移并可最终导致死亡。
目前存在医学专业人员使用的两种主要的前列腺癌检测试验：数字直肠检查(DRE)和患者血液中前列腺特异抗原(PSA)的测量。令人遗憾的是，这些试验都不是完全决定性的，二者均可导致假阴性(留下未检测到的真正的癌症)和假阳性(发出癌症信号，而该癌症不存在)。例如，以推荐的4.0ng/ml截止值进行的标准PSA试验对癌症患者是86％敏感，但是只是33％特异，在大致67％的非癌症患者中产生假阳性(Hoffman等，2002)。本发明描述将磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1测量与另一种前列腺癌抗原PSA结合的方法，其中前列腺癌的存在基于患者体液或组织中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的水平和PSA试验的结果来确定。
BLCA-38(也称作MIL-38)是对抗人膀胱癌细胞系UCRU-BL-17CL引起的IgG1鼠源抗体(Walker et al.,1989)。产生的抗体显示结合到大多数人膀胱癌细胞系(Russell et al.,2004)。该抗体被描述为结合30Kd的细胞表面蛋白和用于检测某些种类的膀胱癌(US PAT 5,622,836)。
本发明首次描述MIL-38抗原的特性(identity)。本发明人通过下面实施例1-8中描述的一系列免疫沉淀、蛋白质印迹分析、质谱法分析、和2D凝胶发现了该抗原。根据本发明，本领域技术人员已知的任何合适的剂和/或任何合适的技术可用于测量给定样品(例如体液样品)中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的水平，并利用该测量来诊断和/或预测取得样品的患者中的前列腺癌。在一些实施方式中，剂是抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体。在发明的一些实施方式中，MIL-38抗体用于结合到60kD磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1蛋白聚糖和检测60kD磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1蛋白聚糖。在一些实施方式中，MIL-38抗体用于检测前列腺癌细胞表面上的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗原。在其它实施方式中，MIL-38抗体用于检测前列腺癌患者的体液或组织中可溶的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1。在一些实施方式中，MIL-38抗体具有磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1表位的结合特异性，该表位包括第一区段KVNPQGPGPE(SEQ ID NO：6)或KVNPQGPGP(SEQ ID NO：7)。该表位可进一步包括第二区段TQNARA(SEQ ID NO：8)或TQNARAFRD(SEQ ID NO：9)。本发明显示MIL-38结合到前列腺癌组织的能力基于磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗原的存在，并进一步证明其它抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体检测癌性的前列腺细胞的应用。因此在一些实施方式中，抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体不是MIL-38。进一步，本发明证明通过检测患者体液或组织中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1水平来检测前列腺癌的能力。因此本发明人已发现磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1是前列腺癌的标记。
根据本发明，体液或组织中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1水平可利用任何合适的技术(例如任何蛋白质组学技术)来检测。在一些实施方式中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1水平可利用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体来检测。例如，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1水平可利用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体来检测，抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体包括：重链可变区，其包括：互补决定区1(CDR1)，包括SEQ ID NO:10的位置50-54限定的氨基酸序列或由SEQ ID NO:10的位置50-54限定的氨基酸序列组成；互补决定区2(CDR2)，包括SEQ ID NO:10的位置69-85限定的氨基酸序列或由SEQ ID NO:10的位置69-85限定的氨基酸序列组成；互补决定区3(CDR3)，包括SEQ ID NO:10的位置118-126限定的氨基酸序列或由SEQ ID NO:10的位置118-126限定的氨基酸序列组成；和包括轻链可变区，其包括：互补决定区1(CDR1)，包括SEQ ID NO:11的位置44-54限定的氨基酸序列或由SEQ ID NO:11的位置44-54限定的氨基酸序列组成；互补决定区2(CDR2)，包括SEQ ID NO:11的位置70-76限定的氨基酸序列或由SEQ ID NO:11的位置70-76限定的氨基酸序列组成；互补决定区3(CDR3)，包括SEQ ID NO:11的位置109-117限定的氨基酸序列或由SEQ ID NO:11的位置109-117限定的氨基酸序列组成。用于检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1水平的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体可不包括：轻链可变区，所述轻链可变区包括：互补决定区1(CDR1)，包括SEQ ID NO:12的位置48-58限定的氨基酸序列或由SEQ ID NO:12的位置48-58限定的氨基酸序列组成；互补决定区2(CDR2)，包括SEQ ID NO:12的位置74-80限定的氨基酸序列或由SEQ ID NO:12的位置74-80限定的氨基酸序列组成；互补决定区3(CDR3)，包括SEQ ID NO:12的位置113-121限定的氨基酸序列或由SEQ ID NO:12的位置113-121限定的氨基酸序列组成。抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体可由2014年8月22日在澳大利亚细胞库(CBA)在登录号CBA20140026下保藏的杂交瘤细胞产生或另外与2014年8月22日在澳大利亚细胞库(CBA)在登录号CBA20140026下保藏的杂交瘤细胞产生的抗体相同。
在发明的一些实施方式中，一种或多种其它抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体可用于检测患者体液或组织中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1。在一些实施方式中，所述其它抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体可以是该申请(表2)中列出的任何抗体。在再一个实施方式中，用于检测患者体液或组织中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的抗体可以是能结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的任何抗体。在一些实施方式中，本发明的抗体包括抗体片段或重组抗体。在一些实施方式中，本发明的抗体包括人抗体、人化抗体和嵌合抗体。在一些实施方式中，本发明的抗体是缀合抗体。本发明的抗体片段的非限制名单包括抗原结合片段Fab、F(ab’)2、ScFv、Di-scFv sdAb化学连接的F(ab’)2、双特异性抗体、三特异性抗体Fab3、Bis-scFv、微抗体(Minibody)双价抗体、三链抗体(triabody)三价抗体、双链抗体(diabody)双特异性抗体、四链抗体(tetrabody)四价抗体。抗体片段和结构域组合的评论可在(Holliger and Hudson 2005和US 2003/0077282)中找到。
在发明的一些方面中，新的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体可从磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1蛋白或其片段或衍生物产生。仅作为非限制实例，抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体可对抗包括第一区段KVNPQGPGPE(SEQ ID NO：6)或KVNPQGPGP(SEQ ID NO：7)的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1表位而引起。该表位可进一步包括第二区段TQNARA(SEQ ID NO：8)或TQNARAFRD(SEQ ID NO：9)。本领域技术人员将认识到许多方法对于抗体的产生是可用的，例如，(Harlow et al.,1988)中描述的方法。在一些实施方式中，用于产生抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1免疫原将包括天然蛋白质的翻译后修饰(例如折叠)。在一些实施方式中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1免疫原将不包括信号肽(SEQ ID No：3)、或C端前肽(SEQ ID No：4)序列。在一些实施方式中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1免疫原获自人或其它哺乳动物细胞如转化的鼠源NS0、野生型DU-145、或其它磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1表达细胞系。在一些实施方式中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗原可以是表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的细胞。在一些实施方式中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1免疫原可以是整体细胞或磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1蛋白在细胞表面上的细胞部分。本领域技术人员还将理解，结合片段或Fab片段可通过多种众所周知的方法如(Borrebaeck et al.,1995；和美国专利7,960,517)中描述的那些而从遗传信息制备。
在本发明的另一个实施方式中，可产生靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的多克隆抗体，用于前列腺癌的检测。再次仅作为非限制实例，靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的多克隆抗体可对抗一系列磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1表位而引起，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1表位包括包含第一区段KVNPQGPGPE(SEQ ID NO：6)或KVNPQGPGP(SEQ ID NO：7)的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1表位。该表位可进一步包括第二区段TQNARA(SEQ ID NO：8)或TQNARAFRD(SEQ ID NO：9)。本领域中多种已知的方法可用于针对磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1或磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1片段的多克隆抗体的产生。在发明的一个实施方式中，可将磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1蛋白或其片段注射进宿主动物。在一些实施方式中，宿主动物可包括但不限于兔、小鼠、大鼠等。在一些实施方式中，将得到的血清纯化并通过本领域众所周知的技术如蛋白质印迹、ELISA、免疫荧光筛选、流式细胞术、荧光活化细胞分选系统(FACS)或其它，测试它与磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1反应的能力
在另一个实施方式中，可产生针对磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的单克隆抗体(mAbs)，用于前列腺癌的检测。再次仅作为非限制实例，靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖的单克隆抗体可对抗包括第一区段KVNPQGPGPE(SEQ ID NO：6)或KVNPQGPGP(SEQ ID NO：7)的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1表位而引起。该表位可进一步包括第二区段TQNARA(SEQ ID NO：8)或TQNARAFRD(SEQ ID NO：9)。在一个实施方式中，抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体通过杂交瘤技术(Kohler and Milstein 1975)、或其它技术(Cole et al.,1985；或美国专利6,116,013)产生。关于抗体产生的更多细节和实例，参见美国专利7,985,560。
在本发明的一些实施方式中，通过抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体在患者体液或组织中检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1。在一些实施方式中，获自患者的体液样品是血液、血清、血浆、或尿样品。在其它实施方式中，在患者组织样品中检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1。在一些实施方式中，组织样品包括肿瘤活组织检查或其它患者组织。在该发明的一些方面，抗体通过蛋白质印迹分析、酶联免疫吸附测定(ELISAs)、荧光细胞分选或FACS、免疫荧光、放射性标记、免疫沉淀、免疫组织化学、免疫印迹、化学发光、和/或用抗体或其它配体如能结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的蛋白检测蛋白的其它已知技术来检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1。在一些实施方式中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1通过生物膜试验、或亲和环试验来检测，如美国申请2013/016,736中所描述的。在一些实施方式中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1通过涂布到透明表面(例如聚碳酸酯载玻片)的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1结合剂来检测。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1或带有磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的细胞的结合可通过光密度的改变来检测。在一些实施方式中，将结合到所述体液或组织样品的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体与结合到一种或多种磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1校准标准品的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体比较；其中校准标准品的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体结合用于定量所述体液样品中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的量。在一个实施方式中，校准标准品包括一种或多种具有已知磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1浓度的样品。
在一些实施方式中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的测量通过使所述体液或组织样品与磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1配体接触来完成。在一些实施方式中，配体可以是能结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1蛋白聚糖的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体。
在一些实施方式中，患者的组织或体液可在通过抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1配体检测之前需要预处理。在一些实施方式中，所述预处理可包括用剂如肝素酶PNGaseF、N-糖苷酶、碱性磷酸酶、或乙酰肝素酶等的处理。在其它实施方式中，所述预处理可包括组织裂解、膜纯化、血液血浆或血清分级分离、细胞纯化或蛋白纯化等。
在一些实施方式中，将患者体液或组织中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的测量水平针对来自无癌患者的体液或组织的对照样品比较。在其它实施方式中，将患者体液或组织中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的测量水平针对预定的参考值或参考值范围比较。在其它实施方式中，患者体液或组织中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的水平指示前列腺肿瘤大小或进展。
在一些实施方式中，来自体液或组织样品的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的检测通过酶联免疫吸附测定(ELISAs)进行。ELISA包括基于比色法、化学发光和荧光测定术的那些ELISA。ELISA已成功应用于低含量药物和身体组织或液体如血液、血清、和血浆样品中其它抗原组分的测定，并且在本领域众所周知。用于本发明的ELISA可利用任何合适的捕获试剂和可检测的试剂——包括抗体和其衍生物、蛋白配体等等。在某些实施方式中，ELISA是基于细胞的。在其它实施方式中，ELISA检测无细胞的抗原。在一些实施方式中，将疑似含有磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的生物样品与捕获(或包被)抗体接触并温育以便捕获抗体捕获或结合到磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1。检测步骤包括可检测的抗体或可检测的蛋白配体的使用，所述可检测的抗体或可检测的蛋白配体可结合到所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1并基于它的标记的检测而用于检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的存在或量。
在一些实施方式中，将生物样品与固定的捕获(或包被)试剂接触并温育，所述固定的捕获(或包被)试剂可以是磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体。该抗体可来自任何物种，但是在一些实施方式中，抗体是鼠源或大鼠抗体。在其它实施方式中，抗体是鼠源抗体。在其它实施方式中，抗体源自杂交瘤。在一些实施方式中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体是重组抗体或抗体片段。固定通过在测定程序之前，如通过吸附到不溶于水的基质或表面(美国专利号3,720,760)或非共价或共价结合(例如，利用戊二醛或碳二亚胺交联，具有或没有先前的用例如美国专利号3,645,852中或Rotmans et al.,1983中所描述的硝酸和还原剂的载体活化)，或之后例如通过免疫沉淀不溶解捕获试剂而常规地完成。
在一些实施方式中，用于固定的固相可以是基本上不溶于水和用于免疫测定的任何惰性载体，包括例如表面、颗粒、多孔基质等形式的载体。通常使用的载体的实施例包括小片、Sephadex、聚氯乙烯、塑料小球、和由聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等制造的测定板或试管，包括96孔微量滴定板，以及颗粒材料如滤纸、琼脂糖、交联葡聚糖和其它多糖。可选地，反应性不溶于水的基质如溴化氰活化的碳水化合物和美国专利号3,969,287；3,691,016；4,195,128；4,247,642；4,229,537；和4,330,440中描述的反应性基底适合用于捕获试剂固定。在一个实施方式中，将固定的捕获试剂涂布在微量滴定板上，并且特别地，使用的固相是可用于一次分析几个样品的多孔微量滴定板，例如，微测试96孔ELISA板如作为Nunc Maxisorb或Immulon销售的那种。在某些实施方式中，板是MICROTESTTM或MAXISORPTM96孔ELISA板，如作为NUNC MAXISORBTM或IMMULONTM销售的那种。
在一些实施方式中，固相涂布有如上所定义的捕获试剂，如期望，其可通过非共价或共价相互作用或物理连接而被连接。连接技术包括美国专利号4,376,110和其中引用的参考文献中描述的那些。如果共价，那么将板或其它固相与交联剂连同捕获试剂在本领域已知的条件下，例如，如在室温下温育1小时。
在其它实施方式中，用于连接捕获试剂与固相基底的通常使用的交联剂包括，例如，1,1-双(重氮乙酰)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基-琥珀酰亚胺酯，例如，具有4-叠氮基-水杨酸的酯、高双官能亚氨酸酯，包括二琥珀酰亚胺基酯，如3,3'-二硫代双-(琥珀酰亚氨基丙酸酯)，以及双官能马来酰亚胺，如双-N-马来酰亚胺基-1,8-辛烷。衍生剂如甲基-3-[(对叠氮苯基)-二硫代]丙酰亚胺酯产生能在存在光的情况下形成交联的光活化性中间体。
在一些实施方式中，利用96孔板。在一些实施方式中，96孔板涂布有捕获试剂(通常通过在约4-20℃、或约4-8℃的温度下和在约8-12、或约pH 9-10、或约pH 9.6的pH下温育至少约10小时，更优选至少过夜，在缓冲液如0.05M碳酸钠中进行稀释)。如果想要更短的涂布时间，在一些实施方式中，可将板涂布更少的时间，例如在室温下两小时或更少。在一些实施方式中，在测定之前可将板堆积和涂布长时间，然后测定可同时对几个样品以手动、半自动或自动方式，如通过利用机器人进行。
在一些实施方式中，可将涂布的板用封闭剂处理，所述封闭剂非特异地结合到结合位点并使结合位点饱和以防止游离配体与板的孔上过量位点的不需要的结合。用于该目的的适当封闭剂的非限制实例包括，例如，明胶、牛血清白蛋白、卵白蛋白、酪蛋白和脱脂乳。在一些实施方式中，封闭处理可在环境温度的条件下进行约1-4小时。在其它实施方式中，封闭可在1至3小时或更少的过程中进行。在其它实施方式中，封闭可在0-4℃下过夜进行。
在一些实施方式中，将磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1标准品(例如纯化的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1蛋白)或将被分析的适当稀释的生物样品加入到固定相。在一些实施方式中，稀释比率是按体积计约1-15％。在一些实施方式中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1蛋白标准品将包括天然蛋白的翻译后修饰。在一些实施方式中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1蛋白标准品获自人或其它哺乳动物细胞，如转化的NS0、野生型DU-145、或其它磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1表达细胞系。在其它实施方式中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1蛋白可从体液或组织纯化。在一些实施方式中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1标准品将是部分磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1肽或磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1检测抗体检测的其它表位、或配体。在一些实施方式中，标准品可以是表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的细胞。在一些实施方式中，稀释是按体积计约10％。可用于为了该目的稀释的缓冲液的非限制组包括(a)含有0.5％BSA、0.05％TWEEN 20TM洗涤剂(P20)、0.05％PROCLINTM300抗生素、5mM EDTA、0.25％CHAPS表面活性剂、0.2％牛γ-球蛋白和0.35M NaCl的PBS，pH 7.4；(b)含有0.5％牛血清白蛋白、0.05％聚山梨醇酯20、5mM EDTA、0.25％CHAPS、0.2％牛γ-球蛋白和0.35M NaCl的PBS；pH 7.4(c)含有0.5％BSA、0.05％聚山梨醇酯20(P20)和0.05％PROCLINTM300的PBS，pH 7；(d)含有0.5％BSA、0.05％P20、0.05％PROCLINTM300、5mM EDTA和0.35M NaCl的PBS，pH 6.35；(e)含有0.5％BSA、0.05％P20、0.05％PROCLINTM300、5mM EDTA、0.2％牛γ-球蛋白和0.35M NaCl的PBS，pH 7.4；和(f)含有0.5％BSA、0.05％P20、0.05％PROCLINTM300、5mM EDTA、0.25％CHAPS和0.35M NaCl的PBS，pH 7.4。PROCLINTM300充当防腐剂，TWEEN 20TM充当洗涤剂以消除非特异性结合。
虽然捕获试剂的浓度将通常考虑生物样品任何必要的稀释，通过磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的感兴趣的浓度范围确定，但是捕获试剂的终浓度将通常以经验确定以在感兴趣的范围内最大化测定的灵敏度。
选择样品和固定的捕获试剂的温育条件以最大化测定的灵敏度和最小化解离。在一些实施方式中，温育在范围从约0℃至约40℃的相当恒定的温度下完成。在其它实施方式中，温育从约20至25℃进行。温育时间主要取决于温度，通常不大于约10小时以避免不灵敏的测定。在一些实施方式中，温育时间是约0.5至3小时。在其它实施方式中，温育是在室温下约1.5-3小时或更少以最大化游离磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1与捕获试剂的结合。如果加入蛋白酶抑制剂，那么温育的持续时间可以更长以防止生物学流体中蛋白酶降解磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1。
在一些实施方式中，检测方法是竞争ELISA。在一些实施方式中，温育步骤包括未结合和未标记的抗体的加入。在一些实施方式中，已知浓度的未标记的抗体结合游离的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗原和防止它变得固定在板上。在一些实施方式中，温育步骤包括已知浓度的标记的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1蛋白的添加。在一些实施方式中，体液或组织样品中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的量被检测为混合的标记的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1蛋白递减的结合。在其它实施方式中，ELISA是夹心ELISA。
在该阶段，温育混合物的pH将通常处于约4-9.5的范围。在其它实施方式中，pH范围将是约6-9。在再一个实施方式中，pH范围将是约7-8。在另一个实施方式中，测定(ELISA)稀释剂的pH是pH 7.4。选择温育缓冲液的pH以保持显著水平的捕获试剂与正被捕获的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的特异性结合。多种缓冲剂可用于达到和保持该步骤期间期望的pH，包括硼酸盐、磷酸盐、碳酸盐、Tris-HCl或Tris-磷酸盐、乙酸盐、巴比妥等等。利用的具体缓冲剂对本发明不是关键性的，但是在个体测定中，一种缓冲剂可较另一种优选。
在一些实施方式中，将生物样品从固定的捕获试剂分离(优选通过清洗)以去除未捕获的分子。用于清洗的溶液通常是缓冲液("清洗缓冲液")，其pH利用上面针对温育步骤描述的考虑和缓冲剂确定。在一个实施方式中，清洗缓冲液的pH范围是约6-9。清洗可进行一次或多次。清洗的温度通常是从冰箱到适度温度，在测定时期期间保持恒定温度，通常是约0-40℃。在其它实施方式中，清洗温度是约4-30℃。例如，在清洗之前，清洗缓冲液可在储液器中于4℃下置于冰中，洗板机可用于该步骤。如果存在捕获的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1可在随后的步骤中某种程度地解离的任何担心，那么交联剂或其它合适的剂也可在该阶段加入以允许现在结合的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1共价连接到捕获试剂。
在一些实施方式中，将固定的捕获试剂与可检测的抗体接触。在一些实施方式中，可检测的抗体是抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体。在一些实施方式中，抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体是MIL-38。在其它实施方式中，抗体是表2中描述的那些抗体。在其它实施方式中，可检测的抗体是能检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的任何抗体。将可检测的抗体与固定的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1在约20-40℃的温度下接触。在其它实施方式中，将可检测的抗体在约20-25℃下接触，二者接触的精确温度和时间主要取决于使用的检测手段。例如，当链霉亲和素-过氧化物酶和3,3',5,5'-四甲基联苯胺用作检测手段时，例如，在一个实施方式中，进行接触(例如，约1小时或更多)以将信号扩大到最大值。在一些实施方式中，在板清洗之后将相对于期望的游离的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的最大浓度的摩尔过量的抗体或配体添加到板。该抗体是直接或间接可检测的。可检测的抗体可以是多克隆或单克隆抗体，例如，在某些实施方式中，它是单克隆抗体，在一个实施方式中是鼠源的，在一个实施方式中是MIL-38。并且，可检测的抗体可以是直接可检测的，在一个实施方式中具有比色标记，在另一个实施方式中具有荧光标记。在其它实施方式中，可检测的抗体被生物素化，检测手段是抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素-过氧化物酶和3,3',5,5'-四甲基联苯胺。在一些实施方式中，可检测的抗体可用生物素-亲和素放大系统、化学发光系统、微球体、或胶体金标记。检测手段的读出可以是荧光的或比色的等。抗体的亲和性必须足够高以便少量游离的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1可被检测。
在一些实施方式中，结合到捕获试剂的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1利用可检测的抗体的检测手段来测量。如果体液或组织样品来自患者，那么测量步骤包括比较由于以上步骤发生的反应与标准曲线以测定所述体液或组织样品中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的水平。在其它实施方式中，比较由于以上步骤发生的反应与利用对照体液或组织样品如年龄匹配的无癌个体的体液或组织的相似反应。
在其它磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1检测实施方式中，患者体液中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1通过蛋白质印迹分析来检测。在一些实施方式中，该测定利用电泳分离复杂样品中的蛋白质。在其它实施方式中，电泳分离在尺寸排阻凝胶如十二烷硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(通常称作SDS-PAGE)中进行。在一个实施方式中，然后将分离的蛋白质转移到膜。本领域技术人员将认识到存在许多种可用于蛋白质印迹的材料。在一些实施方式中，膜由硝酸纤维素或聚偏氟乙烯，PVDF制成。在一些实施方式中，转移在蛋白质转移盒中发生，以便蛋白质在膜上保持与它们在凝胶中具有的相同的分离模式。在一些实施方式中，然后将膜在稀释的蛋白质溶液，例如脱脂奶粉或牛血清白蛋白(BSA)中温育以封闭非特异结合位点。然后可将封闭的膜与对磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1靶蛋白特异的第一抗体温育。在一些实施方式中，然后将膜清洗和与靶向第一抗体的第二抗体温育。在一些实施方式中，第一或第二抗体与可检测的标记缀合，以便它可被容易地检测。在一些实施方式中，标记包括荧光标记、化学发光标记、放射性标记、或本领域众所周知的另一种标记。在一些实施方式中，与第二配体缀合的所述标记选自放射性标记、荧光标记、生物素-亲和素放大系统、化学发光系统、微球体、和胶体金。
任选地，发明的一些方面教导一旦使用者已确定是否靶蛋白存在于样品中，就可将第一和(任选的)第二抗体从膜剥去，可将膜与可选的对相同或另一种蛋白特异的第一抗体温育。在一些实施方式中，第二蛋白可用作装载对照。在其它实施方式中，第二蛋白是患者健康的另一个标记。
在一个实施方式中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1通过流式细胞术来检测。在一些实施方式中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1在患者体液或组织中的细胞的细胞表面上检测。在发明的某些方面，用于流式细胞术的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的检测可如下面所描述的进行。在一些实施方式中，将来自体液或组织的细胞纯化。细胞纯化可包括中和步骤。在一些实施方式中，中和步骤包括在中和缓冲液中储存细胞。中和缓冲液可通过组合39ml 0.2M NaH2PO4与61ml 0.2M Na2HPO4并加水到200ml而制备。在一些实施方式中，将细胞离心和再悬浮在不同溶液中。在其它实施方式中，将细胞未经纯化而分选。在一些实施方式中，将细胞在CytoLyt溶液中再悬浮或清洗。在其它实施方式中，将细胞在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中再悬浮或清洗。在一些实施方式中，将细胞悬液用氯化铵处理以裂解红血细胞。在一些实施方式中，将细胞固定到载玻片上。在其它实施方式中，细胞保持游离。在一些实施方式中，将细胞与第一抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体或其它配体接触。在一些实施方式中，第一抗体是MIL-38。在一些实施方式中，第一抗体不是MIL-38。在其它实施方式中，第一抗体是任何其它抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体(表2)。在某些实施方式中，细胞进一步与缀合检测标记的第二检测抗体接触。在可选的实施方式中，如果第一抗体与检测标记缀合，那么抗原可直接由第一抗体检测。在具体的情况中，除了用磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体标记，细胞可用其它探针可区别地标记，其它探针包括，但不限于，细胞表面标记的抗体，其区别一个细胞类型与另一个。在一些方面，其它探针可用于使信号或总细胞计数标准化。在一些实施方式中，其它探针标记细胞内抗原。在其它实施方式中，其它探针标记细胞外抗原。一旦被标记，标记的细胞可通过FACS流式细胞术分离。在一些实施方式中，FACS机可单个地分离标记的细胞(即，作为单个细胞)。在其它实施方式中，可将标记的细胞分离为混合群，然后在FACS之后稀释成单个细胞。在一些实施方式中，第二标记可以是染料。在一些实施方式中，染料标记是DAPI。在一些实施方式中，DAPI标记用于定量样品中的细胞数。
在细胞用多种不同标记来标记的实施方式中，细胞可利用多种不同性质来选择。例如，细胞可首先由一个探针分选，然后是另一个。在一些实施方式中，细胞可首先通过细胞类型分选，之后通过磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1浓度分选。相似地，可将细胞以如所设计的任何序列连同探针和FACS机的检测而分选。
荧光活化细胞分选的一般原理，包括可制备单细胞悬浮液的方法；可利用例如荧光标记的探针标记细胞的方法；可将细胞彼此分离的方法；以及流式细胞术中可利用的硬件，包括流动小室、试剂，计算机控制系统在许多种出版物中已知并被评论，包括，但不限于：(Orfao等,1996；Johnson等,2007；Tung等,2007；和Dainiak等,2007)。
本发明还包括检测患者体液或组织中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的试剂盒。在一个实施方式中，检测癌症的试剂盒包括进行该申请中描述的任何检测测定必需的材料。在一些实施方式中，检测癌症的试剂盒包括第一抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体或其它配体、药学上可接受的载体、和磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1标准品；其中所述试剂盒能检测患者体液或组织中的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1。第一抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体可以是或可以不是MIL-38。第一抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体可包括：重链可变区，其包括：互补决定区1(CDR1)，包括SEQ ID NO:10的位置50-54限定的氨基酸序列或由SEQ ID NO:10的位置50-54限定的氨基酸序列组成；互补决定区2(CDR2)，包括SEQ ID NO:10的位置69-85限定的氨基酸序列或由SEQ ID NO:10的位置69-85限定的氨基酸序列组成；互补决定区3(CDR3)，包括SEQ ID NO:10的位置118-126限定的氨基酸序列或由SEQ ID NO:10的位置118-126限定的氨基酸序列组成；并且包括轻链可变区，其包括：互补决定区1(CDR1)，包括SEQ ID NO:11的位置44-54限定的氨基酸序列或由SEQ ID NO:11的位置44-54限定的氨基酸序列组成；互补决定区2(CDR2)，包括SEQ ID NO:11的位置70-76限定的氨基酸序列或由SEQ ID NO:11的位置70-76限定的氨基酸序列组成；互补决定区3(CDR3)，包括SEQ ID NO:11的位置109-117限定的氨基酸序列或由SEQ ID NO:11的位置109-117限定的氨基酸序列组成。用于检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1水平的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体可以不包括：轻链可变区，所述轻链可变区包括：互补决定区1(CDR1)，包括SEQ ID NO:12的位置48-58限定的氨基酸序列或由SEQ ID NO:12的位置48-58限定的氨基酸序列组成；互补决定区2(CDR2)，包括SEQ ID NO:12的位置74-80限定的氨基酸序列或由SEQ ID NO:12的位置74-80限定的氨基酸序列组成；互补决定区3(CDR3)，包括SEQ ID NO:12的位置113-121限定的氨基酸序列或由SEQ ID NO:12的位置113-121限定的氨基酸序列组成。第一抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体可由2014年8月22日在澳大利亚细胞库(CBA)在登录号CBA20140026下保藏的杂交瘤细胞产生或另外与2014年8月22日在澳大利亚细胞库(CBA)在登录号CBA20140026下保藏的杂交瘤细胞产生的抗体相同。
在一些实施方式中，试剂盒将需要另外使用标准的实验室工具或机械装置。在一些实施方式中，必需的工具包括如本领域技术人员所知的移液管、细胞分选机、读板器、离心机等。在一些实施方式中，试剂盒的应用可需要如本领域技术人员所众所周知的另外的标准实验室试剂，如移液管头、膜、缓冲液、或化学品。在一些实施方式中，试剂盒进一步包括第二配体。在一些实施方式中，第二配体是第二抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体。在一个实施方式中，第二抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗体与第一抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体相同。在一些实施方式中，第二配体与标记缀合，用于所述配体的快速检测。在一些实施方式中，试剂盒的抗体可以是如该申请中所描述的抗体片段或抗体组合。
在一些实施方式中，患者体液或组织中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的检测指示前列腺癌的存在。在一些实施方式中，患者体液中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、600、700、800、900、1000pg/ml磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的存在指示前列腺癌。
在一些实施方式中，患者体液或组织中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的检测指示前列腺癌的存在。在一些实施方式中，患者体液中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、600、700、800、900、1000ng/ml磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的存在指示前列腺癌。
在一些实施方式中，患者体液或组织中磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的检测指示前列腺癌的存在。在一些实施方式中，患者体液或组织中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50μg/ml磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的存在指示前列腺癌。
在一些实施方式中，患者体液或组织中升高水平的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1、或磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1检测信号指示前列腺癌。在一些情况中，癌症患者的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1水平较对照非癌性体液或组织的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1水平或磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1检测信号高1％、2％、3％、4、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、210％、220％、230％、240％、250％、260％、270％、280％、290％、300％、310％、320％、330％、340％、350％、360％、370％、380％、390％、400％、410％、420％、430％、440％、450％、460％、470％、480％、490％、500、600％、700％、800％、900％、1000％、5,000％、10,000％、>15,000％。在一些实施方式中，对照非癌性体液或组织将与患者年龄匹配。
实施例
实施例1.细胞结合的MIL-38抗原的表征。
虽然最初报道MIL-38抗原为30kD蛋白(Russell et al 2004)，但是本发明人的工作已表明MIL-38抗体主要检测一系列细胞提取物中的60kDa抗原。如果在凝胶电泳之前样品已与还原剂温育，那么MIL-38与抗原的蛋白质印迹反应性丧失。
将MIL-38抗体用于免疫沉淀实验，我们能从许多种细胞提取物特异地分离60kDa蛋白。细胞表面上60kDa抗原的存在利用活细胞免疫沉淀来研究。在这些实验中，将活细胞在冰上与含有MIL-38抗体的无血清培养基温育。然后将细胞清洗，制备裂解产物并与蛋白G珠温育以分离与细胞关联的任何抗体。60kDa带存在于这些免疫沉淀物中，表明抗原通过培养基中的MIL-38在细胞表面上被识别。
实施例2.MIL-38抗原免疫沉淀和质谱法。
将DU-145前列腺癌细胞通过膜蛋白提取试剂盒(MPEK)处理。将膜提取物与同磁珠交联的MIL-38免疫沉淀。将免疫沉淀物跑入凝胶和切除，用于质谱法分析，或直接从珠洗脱并然后进行质谱法。然后将结合到MIL-38抗体的抗原通过质谱法分析来分析，这可基于质量/电荷数据来鉴定肽。
质谱仪鉴定了磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1具有4278的肽得分和46％的序列覆盖度，包括18个不同的序列(图1)。
实施例3.MIL-38抗原免疫沉淀、尺寸排阻层析和质谱法。
将DU-145前列腺癌细胞通过膜蛋白提取试剂盒(MPEK)处理。将膜提取物与同磁珠交联的MIL-38免疫沉淀。广泛清洗之后，将免疫沉淀物在含有2％SDS的TBS(三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水)中洗脱。将洗脱液进行尺寸排阻层析(SEC)并将每个第二部分进行丙酮沉淀，在样品装置缓冲液中再悬浮和用于MIL-38蛋白质印迹。28和30部分含有大量MIL-38抗原(图2)，表明29部分也将含有高浓度的MIL-38抗原。将29部分进行质谱法分析，并鉴定磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1具有14％的序列覆盖度(图3)。这进一步证实MIL-38抗体的抗原是磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1。
实施例4.MIL-38和抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(抗GPC-1)抗体显示2D蛋白质印迹上重叠的反应性。
购买兔抗GPC-1抗体并显示与大约60kDa的分子量——与MIL-38检测的相同的分子量——磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1核心蛋白的反应性。为了证实MIL-38识别磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1，将前列腺癌DU-145MPEK提取物进行2D电泳和蛋白质印迹。
如图4所示，MIL-38抗体和抗GPC-1抗体显示检测具有60kDa分子量和范围从5至7的等电点的蛋白的重叠反应性。
实施例5.MIL-38在抗GPC-1免疫沉淀物中被检测并且反之亦然.
MIL-38或兔抗GPC-1抗体用于从DU-145或C3(MIL-38阴性)MPEK提取物免疫沉淀它们各自的抗原。将免疫沉淀物(IPs)用MIL-38或抗GPC-1抗体进行蛋白质印迹(图5)。
60kDa GPC-1反应带在用抗GPC-1印迹的MIL-38IPs中检测到，而60kDa MIL-38反应带在用MIL-38印迹的抗GPC-1IPs中检测到。没有检测到与仅第二对照的反应性。而且，用MIL-38抗体的免疫沉淀导致MIL-38和抗GPC-1抗原的几乎全部消耗，强烈表明MIL-38抗原是磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1。
实施例6.MIL-38检测重组GPC-1
测试两种来源的纯化的重组磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1与IL-38和抗GPC-1抗体的反应性。第一来源是从麦胚提取物产生的截短形式(注意这不会含有适当的哺乳动物翻译后修饰)。第二来源是鼠源NS0细胞中产生的全长磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1。没有观察到与麦胚表达的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的MIL-38反应性，然而可检测到与兔抗GPC-1抗体的MIL-38反应性(数据未显示)。相比之下，对于在NS0细胞中产生的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1，观察到与IL-38和抗GPC-1抗体非常强的反应性(图6)。
实施例7.MIL-38可检测分泌到细胞培养上清液中的抗原。
迄今为止，尚没有MIL-38抗原分泌的实验证据。为了测试这个，将DU-145细胞在无血清培养基中清洗，然后与无血清培养基温育36小时。将得到的条件培养基用MIL-38免疫沉淀，并将得到的样品与来自DU-145MPEK提取物的标准IP比较。在条件培养基IP中观察到大约40和55kDa的带，将其与分离自DU-145提取物的60kDa带比较(图7)。
将含有40和55kD带的条件培养基IP样品进行质谱法分析。鉴定磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(SEQ ID No：2)具有16％肽覆盖度(图8a)。仅40kD带(图8b)或55kD带(图8c)的单独分析均鉴定为磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1肽(SEQ ID No：2)。
这些结果提示磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的MIL-38反应形式可被释放进来自DU-145前列腺癌细胞系的细胞培养上清液。
实施例8.GPC-1可在前列腺癌血浆样品中和来自前列腺癌患者的膜提取物中由MIL-38检测到
迄今为止，尚没有来自正常的或前列腺癌患者的血浆样品中MIL-38抗原分泌的实验证据。为了测试这个，将来自一个正常患者(042)和一个前列腺癌患者(046)的血浆样品用MIL-38抗体进行免疫沉淀，并将IP样品用MIL-38和抗GPC-1抗体进行蛋白质印迹(图9a)。
两种抗体在两个血浆样品中检测到大约70kDa的特异带。与正常的患者血浆相比，前列腺癌患者血浆中针对MIL-38和抗GPC-1抗体的信号显著较高(较深的带)，提示这种磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1溶解形式可在前列腺癌患者中升高。
为了确定是否MIL-38抗原可在来自正常的前列腺和前列腺癌的膜蛋白提取物中检测到，每种的一个样品获自Novus Bio。将等量的蛋白利用MIL-38抗体进行蛋白质印迹(图9b)。前列腺癌提取物显示较正常的前列腺样品高得多的MIL-38抗原表达。
实施例9.患者尿中MIL-38抗原的检测。
MIL-38可检测前列腺癌患者尿中的细胞。为了测试该检测方法的灵敏度和特异性，获得125个年龄匹配的尿样品。将细胞从尿快速离心并通过MIL-38间接免疫荧光测定来分析。分析总共47个健康对照、37个良性前列腺肥大(BPH)和41个活组织检查证实的前列腺癌。显示阳性前列腺癌细胞、DU-145阳性对照和C3阴性细胞的实例(图10).
MIL-38免疫荧光测定(IFA)试验显示在鉴定同龄组内前列腺癌中71％的灵敏度和73％的特异性。试验显示与BPH患者相比在鉴定前列腺癌中71％灵敏度和76％特异性。(表3)。
表3.患者尿中前列腺癌检测的灵敏度和特异性计算。
实施例10.MIL-38抗原检测与PSA水平的组合增加检测前列腺癌的能力。
当MIL-38免疫荧光测定(IFA)试验与PSA试验组合时，灵敏度和特异性增加。这些增加根据应用到PSA试验的截止值而变化。当阳性诊断的截止值大于2ng/mL时，那么特异性从只是针对IFA试验的73％增加到针对组合的两种试验的83％。当阳性诊断的截止值大于4ng/mL时，那么特异性从只是针对IFA试验的73％增加到针对组合的两种试验的89％。
这进一步由logistic回归分析来说明，其显示当两种试验组合时OR和95％CI增加。
表4.当MIL-38IFA试验与PSA得分组合时灵敏度和特异性增加
通过2ng/ml分层
PSA<2ng/ml
癌症
PSA≥2ng/ml
癌症
通过4ng/ml分层
PSA<4ng/ml
癌症
PSA≥4ng/ml
癌症
Logistic回归
实施例11.MIL-38可在许多种ELISA形式中检测重组磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1。
进行三种ELISA测定形式，如图11所示。利用MIL-38作为捕获抗体和兔抗GPC-1作为检测抗体，以0、0.1、1和10ng/ml浓度来测试重组磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1。相似的实验利用兔抗GPC-1作为捕获抗体和MIL-38作为检测抗体进行。利用MIL-38抗体作为捕获抗体和生物素化的MIL-38抗体作为检测抗体，还测试单抗体ELISA。结果表明抗GPC抗体可用于许多种ELISA形式，并且NS0GPC-1可代表合适的阳性对照。
实施例12.利用AM4MIL-38抗体的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗原的检测
本发明人进行的实验确定MIL-38抗体的杂交瘤的原始保藏(ATCC登录号HB11785：鼠源杂交瘤BLCA-38)，那时称作“BLCA-38杂交瘤”，是杂交瘤细胞的混合群，其产生两种不同抗体群，在这里称作“AM3”和“AM4”。将负责产生每种不同抗体群的杂交瘤细胞分离，“AM4”杂交瘤细胞于2014年8月22日保藏在澳大利亚细胞库(CBA)登录号CBA20140026下。
将九十六孔板涂布pH 9.5碳酸盐缓冲液中的MIL-38制剂AM3或AM4(1μg/孔)过夜。将板用含有5％脱脂乳的PBS-Tween(0.1％)在37℃封闭并清洗。将抗原(GPC-1NS0)在加入150mM NaCl的缓冲液II(20mM HEPES pH 7.5、0.5mM EDTA、0.5％TritonX-100)中稀释并在37℃温育过夜。检测用生物素化的AM4抗体进行，之后是用抗生物素蛋白HRP(1μg/mL)的检测。加入TMB(Sigma目录号T0440)并用TMB终止溶液(Sigma S5814)终止。在450nm读吸光度。结果显示在图12A中。
在第二实验中，将九十六孔板在室温涂布pH 7.2PBS中的MIL-38制剂34A(AM3和AM4抗体的混合物)或AM4(2.5μg/孔)AM3 1h。将板用PBS-Tween(0.05％)中的封阻剂酪蛋白(Thermo)在37℃封闭1h。清洗之后，将抗原(GPC-1NS0)在含有50mM Tricine和150mM NaCl的pH 7.2TBS中稀释并在37℃温育1h。检测用生物素化的AM4克隆1F5进行，之后是用抗生物素蛋白HRP(1μg/mL)的检测。加入TMB(Sigma目录号T0440)并用TMB终止溶液(Sigma S5814)终止。在450nm读吸光度。结果显示在图12B中。
上面描述的第一ELISA利用MIL-38显影以捕获NS0产生的GPC-1(即MIL-38抗原)。该实验比较用于捕获的单克隆AM3MIL-38和单克隆AM4MIL-38。AM3在夹心ELISA测定中不充当捕获剂，而AM4显示充当捕获剂(图12A)。
上面描述的第二ELISA比较当比较MIL-38的混合群(AM3和AM4)时获得的ELISA信号与获自单克隆AM4 1F5克隆的信号。使用AM4 1F5作为捕获剂提供较使用混合的34A抗体群更高的ELISA信号(图12B)。
夹心ELISA结果证明只有单克隆MIL-38抗体的AM4样形式在检测磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗原中作为捕获试剂具有实用性，并且含有单克隆群的捕获剂提供较由混合群组成的捕获剂更优的ELISA信号。
实施例13AM4和AM3MIL-38抗体群的序列分析
材料和方法
-重链和轻链测序(DNA)
进行三次单独的测序操作。第一操作(编码为224945)利用来自命名为1-O的混合(AM4和AM3)制剂的双克隆杂交瘤细胞。第二操作(编码为449295-1)利用来自Alfio I——用于产生AM4的杂交瘤原种——的细胞。第三操作(编码为449295-5)利用来自AlfioII——用于产生AM3的杂交瘤原种——的细胞。
对于测序操作224945(1-O)和449295-1(Alfio I)，总RNA从冷冻的杂交瘤细胞提取，并且cDNA从RNA合成。然后进行RT-PCR以扩增抗体的可变区(重链和轻链)和恒定区，然后将它们分别克隆进标准的克隆载体并测序。
遵循Plus RNA纯化系统的技术手册将总RNA从杂交瘤细胞分离。总RNA通过琼脂糖凝胶电泳分析。遵循SuperScriptTM III第一链合成系统的技术手册，利用同种型特异的反义引物或通用引物将总RNA反转录成cDNA。VH、VL、CH和CL的抗体片段根据GenScript的RACE的标准操作规程来扩增。
利用标准的分子克隆程序将扩增的抗体片段分别克隆进标准的克隆载体。
进行菌落PCR筛选以鉴定具有正确大小的插入片段的克隆。将不少于五个具有正确大小的插入片段的单菌落针对每个抗体片段测序。
VH和VL质粒编码抗体的全长可变区和部分CH1和CL。CH质粒编码部分CH1和全长CH2和CH3。CL质粒编码部分CL。为了得到全长恒定区或重/轻链，将VH和VL质粒编码的部分恒定区和CH和CL质粒编码的部分恒定区分别通过PCR扩增，然后利用重叠延伸PCR获得全长DNAs。将五个具有正确的VH、VL、CH和CL插入片段大小的单菌落送去测序。
测序操作449295-5(Alfio II)遇到获得对应期望的IgG1重链序列的序列的困难。进行两次RNA制备。对于第一批细胞，寡脱氧胸苷酸引物和CDS III引物用于反转录(RT)。VH/CH和VK/CK利用IgG1和IgK特异引物通过PCR扩增，部分小鼠β-肌动蛋白基因作为阳性对照扩增。正常的轻链带容易获得，而只有弱的VH可在凝胶上观察到。将五个具有正确的VK和CK插入片段大小的单个菌落送去测序。发现五个不同克隆的VK和CK基因几乎相同。来自Alfio II杂交瘤的共有轻链序列在下面列出。一个非有效(unproductive)重链序列获自八个随机测序的VH阳性克隆，如下面所示。三种重链恒定区序列获自十个随机测序的CH阳性克隆(一个IgG1CH、一个IgG2aCH和八个IgG2bCH)。为了避免可能的类别转换的影响，进行利用IgM特异引物的CH扩增，但是没有获得靶PCR产物。当利用重链FR1简并引物扩增全长重链(VH-CH)时，也没有靶PCR产物。
由于几次尝试之后没有有效(productive)重链可获得，所以尝试来自第二瓶Alfio II细胞的重链序列的分离。对于第二瓶细胞，寡脱氧胸苷酸引物最初用于反转录。分别利用IgG1、IgG2b、IgM、IgA特异引物和IgG简并引物扩增VH，并利用IgK特异引物扩增VK。获得有效轻链和非有效重链，其与先前的结果相同。还尝试了利用随机的6核苷酸引物的反转录，没有成功。
总的来说，进行了分离轻链和重链序列的多种尝试。在对两批细胞的不同尝试之后，一致地获得了一个重新排列的轻链序列。然而，只观察到弱的VH靶PCR产物，并且测序没有导致任何一致的重链序列。
结果
-序列概要表
下面的表5提供研究的抗体的重链和轻链核酸和蛋白序列的概述，表明多个内部区域的位置
-测序(DNA)
将分离的样品总RNA在1.5％琼脂糖/GelRedTM凝胶上与DNA标记(Marker III-TIANGEN,Cat.No.:MD103)一起跑。
将每个样品的四微升PCR产物在1.5％琼脂糖/GelRedTM凝胶上与DNA标记(Marker III)一起跑。将PCR产物纯化和存储在–20℃直到另外使用。
五个不同克隆的VH、VL、CH和CL基因几乎相同。确定下面列出的共有序列是单克隆杂交瘤群(AM-4)产生的抗体的序列。
AM4MIL-38小鼠IgG1重链DNA共有序列(SEQ ID NO：13)
将小鼠重链编码序列的各个区域用交替的加阴影/未加阴影的文本突出显示。位置：1-57＝前导序列；58-147＝框架区(HFR1)；148-162＝互补性决定区(HCDR1)；163-204＝HFR2；205-255＝HCDR2；256-351＝HFR3；352-378＝HCDR3；379-411＝HFR4；412-1383＝恒定区(CH1-CH3)；703-741＝铰链区(加下划线)；1384-1386＝终止密码子。
AM4MIL-38小鼠κ轻链DNA共有序列(SEQ ID NO：14)
将小鼠轻链编码序列的各个区域用交替的加阴影/未加阴影的文本突出显示。位置：1-60＝前导序列；61-129＝框架区(LFR1)；130-162＝互补性决定区(LCDR1)；163-207＝LFR2；208-228＝LCDR2；229-324＝LFR3；325-351＝LCDR3；352-381LFR4；382-702＝恒定区(CK)；703-705＝终止密码子。
上面的重链和轻链AM4MIL-38共有DNA序列转换成下面的重链和轻链氨基酸序列：
AM4MIL-38小鼠IgG1重链氨基酸共有序列(SEQ ID NO：10)
小鼠IgG1重链序列的各个区域在上面的氨基酸序列中显示。位置1-19＝前导序列；20-49＝框架区(HFR1)；50-54＝互补性决定区1(HCD1)；55-68＝HFR2；69-85＝HCDR2；86-117＝HFR3；118-126＝HCDR3；127-137＝HFR4(也称作连接区或J-区)；138-461＝IgG1链恒定区(CH1–CH3)&终止密码子(*)。铰链区–在上面的序列中加下划线。
AM4共有MIL-38轻链氨基酸共有序列(SEQ ID NO：11)
轻链氨基酸序列的各个区域如所标记的显示：位置1-20＝前导序列；框架区(LFR1)；21-43＝互补性决定区1(LCDR1)；44-54＝LFR2；55-69＝LCDR2；70-76＝LFR3；77-108＝LCDR3；109-117＝LFR4；118-234＝κ恒定区(CK)&终止密码子(*)
AM3共有序列
没有一致的重链序列可获自AM3样Alfio II细胞。与其它两个测序操作的序列相比，获自测序操作449295-5(Alfio II)的轻链序列一致地获得并显示框架区和互补性决定区中清楚的差异。
AM3MIL-38κ轻链DNA共有序列(SEQ ID NO：15)
*将轻链编码序列的各个区域用交替的加阴影/未加阴影的文本突出显示。位置：1-72＝前导序列；73-141＝框架区(LFR1)；142-174＝互补性决定区(LCDR1)；175-219＝LFR2；220-240＝LCDR2；241-336＝LFR3；337-363＝LCDR3；364-393＝LFR4；394-714＝恒定区(CK)；715-717＝终止密码子
AM3MIL-38轻链氨基酸共有序列(SEQID NO：12)
轻链氨基酸序列的各个区域如所标记的显示：位置1-24＝前导序列；25-47＝框架区(LFR1)；48-58＝互补性决定区1(LCDR1)；59-73＝LFR2；74-80＝LCDR2；81-112＝LFR3；113-121＝LCDR3；122-131＝LFR4；132-238＝κ恒定区(CK)&终止密码子(*)
实施例14AM4抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体结合的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1表位的鉴定和表征
材料和方法
下面的表6提供用于该研究的AM4抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1抗体的信息。
表6：使用的AM4抗体的描述
如在澳大利亚细胞库登录号CBA20140026下所保藏的杂交瘤细胞产生的
-肽
该研究所基于的人磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(GPC-1)序列在SEQ ID NO：16中限定。使用下面的残基序列：
GPC1_残基#343-366 GNPKVNPQGPGPEEKRRRGKLAP(SEQ ID NO：17)
GPC1_残基#140-149 GELYTQNARAFRDLYSELR(SEQ ID NO：18)
-肽合成
肽合成利用实施例1中提及的方法进行。化学合成的线性和CLIPS肽根据下面显示的设计来合成：
-在支架上化学连接肽(CLIPS)技术
下面提供利用的CLIPS技术的一般原理的描述。
CLIPS技术在结构上将肽装配成限定的三维结构。这导致甚至最复杂的结合位点的功能模拟。CLIPS技术现在常规地用于使肽文库形成单、双或三环结构以及片层和螺旋样折叠。
CLIPS反应在CLIPS支架的溴基团和半胱氨酸的巯基侧链之间发生。反应在温和条件下快速并特异。利用该化学，将天然蛋白序列转化成CLIPS构建物，其具有一系列包括单T2环、T3双环、缀合的T2+T3环、稳定的β片层和稳定的α螺旋的结构(Timmerman等,J.Mol.Recognit.2007；20:283-29)。
CLIPS文库筛选由利用组合的矩阵设计将靶蛋白转化成达10,000个重叠肽构建物的文库开始。在固体载体上，合成线性肽矩阵，将其随后形成空间限定的CLIPS构建物。代表正确的构象中不连续表位的两部分的构建物高亲和性地结合抗体，这被检测和定量。呈现不完全表位的构建物低亲和性地结合抗体，而不含有表位的构建物根本不结合。亲和性信息用于反复的筛选以详细地限定表位的序列和构象。
将含有不连续的构象表位的靶蛋白转化成矩阵文库。组合肽在专有的小卡上合成并化学转化成空间限定的CLIPS构建物。将抗体的结合定量。
-肽合成
为了重建靶分子的不连续表位，合成结构肽文库。这利用在支架上化学连接肽(CLIPS)的技术完成。CLIPS技术允许单环、双环、三环、片层样折叠、螺旋样折叠和其组合的结构肽的产生。将CLIPS模板连接到半胱氨酸残基。将肽中的多个半胱氨酸的侧链连接到一个或两个CLIPS模板。例如，将0.5mM T2CLIPS模板1,3-双(溴甲基)苯溶液溶于碳酸氢铵(20mM,pH 7.9)/乙腈(1:1(v/v))中。将该溶液添加到肽阵列上。CLIPS模板结合到存在于肽-阵列(455孔板，3μl孔)的固相结合肽中的两个半胱氨酸的侧链。将肽阵列在溶液中轻轻摇动30至60分钟，同时在溶液中完全覆盖。最后，将肽阵列用过量的H2O广泛地清洗并在含有PBS(pH 7.2)中1％SDS/0.1％β-巯基乙醇的裂解缓冲液中在70℃超声处理30分钟，之后在H2O中超声处理另外45分钟。带有肽的T3CLIPS以相似的方式制备，但是用三个半胱氨酸。
线性和CLIPS肽根据下面的设计而化学合成：
组1
模仿类型 不连续表位模拟物
标记 MAT.A,MAT.B
描述 不同长度的约束肽模拟物。从两个起始序列(SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18)，已制备所有具有步长4的10至22，和10至18肽，并且这些已被配对。放置在末端和在两个肽半胱氨酸之间。这些由T3CLIPS连接。
组2
模仿类型 线性肽
标记 RN.PKVNPQGPGPEEKRR(SEQ ID NO：19)
描述 取代分析，从碱基序列PKVNPQGPGPEEKRR(SEQ ID NO：20)开始，所有的单个氨基酸都由所有的天然存在的氨基酸替换，除了半胱氨酸以外。
组3
模仿类型 约束肽。
标记 RN.PKVNPQGPGPEEKRR_LOOP(SEQ ID NO：19),
RN.ELCTQNCRAFRDLYS_heli3(SEQ ID NO：21)
RN.ELCTQNCRAFRDLYS_LOOP(SEQ ID NO：21)
描述 取代分析，从如标记名称中所示的碱基序列开始，所有的单个氨基酸都由所有的天然存在的氨基酸替换，除了半胱氨酸以外。
-ELISA筛选
抗体与合成肽中每个的结合在基于PEPSCAN的ELISA中测试。将肽阵列与第一抗体溶液(在4℃过夜)温育。清洗之后，将肽阵列与抗体过氧化物酶缀合物(SBA，目录号2010-05)的1/1000稀释液在25℃温育一小时。清洗之后，加入过氧化物酶底物2,2’-连氮-双-3-乙基苯并噻唑啉磺酸(ABTS)和2μl/ml的3％H2O2。一小时之后，测量显色。显色用电荷耦合器件(CCD)–照相机和图象处理系统定量。
-数据处理
获自CCD照相机的值的范围是0至3000mAU，与标准的96孔板ELISA-读数器相似。将结果定量并储存进Peplab数据库。偶尔一个孔含有气泡，导致假阳性值，将卡手动检查，并将气泡引起的任何值记为0分。
-合成质量控制
为了检验合成肽的质量，平行制备单独的一组阳性和阴性对照肽。这些用抗体57.9筛选(参考文献Posthumus等,J.Virology,1990,64:3304-3309)。
-筛选细节
表7概述抗体结合条件。对于Pepscan缓冲液和预先调节(SQ)，数字指示竞争蛋白(马血清和卵白蛋白的组合)的相对量。
表7：筛选条件
结果
-最初的实验结果和信噪比测定
筛选产生的原始ELISA结果的全数据集的图概述显示在图13中。这里箱线图描绘每个数据集并表明每个数据集内的平均ELISA信号、分布和异常值。取决于实验条件(抗体的量、封闭强度等)，获得不同的ELISA数据分布。
-抗体MIL 38-AM4
在本发明人进行的早期分析中，确定了MIL 38–AM4结合一段序列348VNPQGPGPEEK358(SEQ ID NO：22)上的磷脂酰肌醇蛋白聚糖，并且还结合到一段序列135TQNARA140(SEQ ID NO：8)/135TQNARAFRD143(SEQ ID NO：9)，其被当作不连续表位的表示。
含有主要一段序列的成环构建物准确地找到对结合最关键的残基。该研究的结果显示残基V348、Q351、G352和P353不容忍替换，对于K347、N349和P350要求显著，并且从G354、P355和E356开始，程度较小(图14)。
-结论
描绘抗体MIL38-AM4的构象表位。
早期分析中获得的指向MIL38–AM4不连续表位的引导用于产生矩阵阵列，其中环具有不同长度。此外，进行单个前导序列的全取代分析。所有阵列用MIL38-AM4抗体探查。
对于磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1的识别，该研究中研究的MIL38-AM4抗体结合到唯一地或主要地由残基347和358之间的柔性环组成的表位。
单克隆抗体MIL38-AM4主要结合残基347–355之间的环上的磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1，但是该抗体显然从范围135–140或135-143的残基加入到肽而获益。
表8：MIL38-AM4抗体的表位
除非另外限定，本文的所有技术和科学术语具有与该发明所属领域技术人员通常理解的相同的意思。虽然与本文描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实施或测试，本文描述优选的方法和材料。为了所有目的，引用的所有出版物、专利和专利申请以它们的全部内容通过引用被并入本文。
本文讨论的出版物被提供仅仅用于其在本申请的申请日之前的公开内容。本文没有什么被解释为承认本发明没有权利凭借在先发明而先于这样的出版物。
虽然发明已结合其具体实施方式被描述，但是要理解，它能进一步修改，并且该申请意图涵盖发明的任何变型、应用、或改变，其大体上遵循发明的原理和包括与本公开这样的背离：其在发明所属领域内已知或惯常的实施内产生，并且其可应用于在上文中阐述的和所附权利要求的范围中的必要特征。
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