一种低温提取全蛋液脂肪的方法与流程

本发明涉及食品检测技术领域，具体涉及一种低温提取全蛋液脂肪的方法。

背景技术：
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全蛋液提取脂肪目前常用的有溶剂萃取，即直接以三氯甲烷、乙醚或乙醚-石油醚进行长时间浸泡，然后挥发掉提取剂后保留脂肪(可参见GB/T 5009.47-2003蛋与蛋制品卫生标准的分析方法、NY/T 2068-2011蛋与蛋制品中ω-3多不饱和脂肪酸的测定气相色谱法等标准中的脂肪提取方法)。

全蛋液作为一种强力的胶体溶液，常规的溶剂萃取方法难以完全分离萃取液和样品(因为萃取液能与全蛋液形成均一的胶体溶液，难以分层)。因此，利用常规方法提取全蛋液脂肪十分困难。此外，通过NY/T 2068-2011酸水解的方式也能最终得到脂肪，但酸水解时，温度一般在75-80℃，这时全蛋液中蛋白会变性凝固，包裹脂肪，同时温度过高后，会加速脂肪氧化，测定过氧化值或脂肪酸中不饱和脂肪酸造成一定的检测误差。

在对此全蛋液萃取方法的研究和实践过程中，申请人发现：针对全蛋液的特点，破坏全蛋液成胶的两个关键组分(即蛋白质和磷脂)，通过联合采用盐析、透析、低温酶解、气氛保护、最后溶剂萃取的方法，达到在整个过程中低温条件下的去杂提纯的目的。

ω-3多不饱和脂肪酸是包含多个双键的多聚不饱和脂肪酸，因为第一个双键出现在碳链甲基端的第三位，所以称之为ω-3脂肪酸，也叫ω-3脂肪酸。α-亚麻酸(ALA，C18：3)、二十碳五烯酸(EPA，C20：5)和二十二碳六烯酸(DHA，C22：6)便是ω-3脂肪酸的典型代表。

技术实现要素：
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针对常规提取脂肪方法的局限性，以及蛋清液的特殊性质，本发明提供一种低温提取全蛋液脂肪的方法，能够有效较好地保留全蛋液脂肪中ω-3多不饱和脂肪酸，。

为实现上述目的，本发明采取以下设计方案：

A)称取全蛋液50g，精确至0.1mg，盛放于250mL烧杯中，加入50mL 20％氯化钠溶液，充分混匀后静置半小时，此时全蛋液中蛋白会析出，并沉降。

B)把上述溶液整体转移至100mL离心管中，4000rpm离心10分钟取上层溶液后，装入截留分子量为3500的透析袋中，用流水透析3个小时，目的是除去之前加入的氯化钠，透析后将所有物质转入另外一个带塞的三角瓶中。

C)于上述带塞三角瓶中加入25mL由0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和0.2mol/L磷酸二氢钠溶液按体积比1∶24混合配置的pH为5.1的磷酸缓冲液，加入0.5mL 8000u/mL的磷脂酶Al溶液，通入高纯氮气2min，置换三角瓶中空气，盖上三角瓶塞，于45℃水浴条件下，酶解反应3h。

D)反应完全后，整体转入250mL分液漏斗中，用乙醚萃取三次，每次50mL，合并乙醚层转移至另一个250mL分液漏斗中，用蒸馏水洗涤三次，每次50mL，保留有机相，于45℃减压挥发溶剂乙醚后得到纯净的脂肪。置于4℃下待用。

有益效果：通过气相色谱仪器分析发现，利用本方法提取的脂肪能够有效地保留全蛋液脂肪中ω-3多不饱和脂肪酸。

【附图说明】

附图1本发明方法所提的脂肪测定脂肪酸分布色谱图

附图2 NY/T 2068-2011酸水解-乙醚-石油醚法所提的脂肪测定的脂肪酸分布色谱图

附图3用GB/T5009.47-2003三氯甲烷冷浸法所提的脂肪测定的脂肪酸分布色谱图

【具体实施方法】：

以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1

全蛋液的提取和分析

1 主要仪器

1.1 电子分析天平，精确至0.1mg

1.2 高速离心机

1.3 恒温水浴锅

1.4 旋转蒸发仪

2 试剂溶液

2.1 高纯氮气

2.2 20％氯化钠溶液：称取20g氯化钠，加蒸馏水100mL，搅拌至溶解即可。

2.3 pH5.1的磷酸盐缓冲液：取0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和0.2mol/L磷酸二氢钠溶液按体积比1∶24混合。

2.4 磷脂酶Al溶液：配制成8000u/mL，具体视原液活力而定。

2.5 乙醚

3 提取过程

3.1 称取全蛋液50g(精确至0.1mg)，盛放于250mL烧杯中，加入50mL 20％氯化钠溶液，充分混匀后静置半小时，此时全蛋液中蛋白会析出，并沉降。

3.2 把上述溶液整体转移至100mL离心管中，4000转离心10分钟取上层溶液后，装入截留分子量为3500的透析袋中，用流水透析3个小时，以除去之前加入的氯化钠，透析后所有物质转入另外一个带塞的三角瓶中。

3.3 于上述带塞三角瓶中加入25mL pH5.1的磷酸缓冲液，混匀，再加入0.5mL 8000u/mL的磷脂酶Al溶液，调节氮气减压阀，使氮气气流平稳，压力适中，此时向三角瓶中通入高纯氮气，把气管伸入三角瓶，尽量接近液面，保持通气2min，置换三角瓶中空气，盖上三角瓶塞，于45℃水浴条件下，反应3h，期间每隔半小时，摇匀一次。

3.4 反应完全后，整体转入250mL分液漏斗中，用乙醚萃取三次，每次50mL，如发生乳化现象，可以沿漏斗壁加入2-3mL乙醇，静置，待乳化层消失后再做下一次萃取。合并乙醚层转移至另一个250mL分液漏斗中，用蒸馏水洗涤三次，每次50mL，保留有机相，于45℃减压挥发溶剂乙醚后得到纯净的脂肪。置于4℃下待用。

4 分别按照本发明方法，与NY/T 2068-2011《蛋与蛋制品中ω-3多不饱和脂肪酸的测定气相色谱法》酸水解-乙醚-石油醚法及GB/T 5009.47-2003《蛋与蛋制品卫生标准的分析方法》三氯甲烷冷浸法提取脂肪相比，并分别用GB/T 17377-2008《动植物油脂脂肪酸甲酯的气相色谱分析方法》分别测定脂肪酸分布，并比较。

按照上述方法检测时，在称样量相同，稀释倍数相同，进样体积相同的情况下，各种脂肪酸占脂肪的百分比比例的比较见表1。

5 三种方法提取的脂肪率(质量浓度)持平，但经过脂肪酸分布分析有较大的区别。附图1为本发明方法所提脂肪测定脂肪酸色谱图，附图2按NY/T 2068-2011酸水解-乙醚-石油醚法所提脂肪测定脂肪酸色谱图，附图3按GB/T5009.47-2003三氯甲烷冷浸法所提脂肪测定脂肪酸色谱图。

表1 本方法所提脂肪与GB/T5009.47-2003三氯甲烷冷浸法以及NY/T 2068-2011法所提取脂肪酸占脂肪的比例数据比较

6 对比分析

在进样量相同的情况下，从检测的结果来看，本发明方法提取的脂肪在检测不饱和脂肪酸分布时，如亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸，所提取脂肪中占比相对于GB/T5009.47-2003三氯甲烷冷浸法及NY/T2068-2011酸水解-乙醚-石油醚法显著增加，即ω-3多不饱和脂肪酸含量更高；此外，GB/T 5009.47-2003三氯甲烷冷浸法比NY/T2068-2011酸水解-乙醚-石油醚法又相对较高，说明相对较低的提取温度对ω-3多不饱和脂肪酸的保留是有益的，但与本发明方法比较冷浸法效果不显著的原因在于，在最终浸泡结束回收脂肪时，三氯甲烷的沸点较高，需要相对高的温度才能挥发，可能ω-3多不饱和脂肪酸在此环节有所损失。因此从试验结果来看，仅仅是比NY/T2068-2011酸水解-乙醚-石油醚法稍有提高而已。

综上所述，本发明方法相较于传统方法，ω-3多不饱和脂肪酸得到更好的保留。