(PCT/US2011/066078)、发明名称为“诊断方法”的申请的分案申请。
发明背景
由于在牙医和患者中对侵蚀及其影响的认识增加，因此有正确诊断侵蚀的来源并鉴定对侵蚀有升高的易感性的个体的方法的需要。与由于长时间暴露于细菌酸产生局部很深的亚表面病灶的龋齿不同，侵蚀是由以下原因造成：由于短且频繁暴露于低pH膳食酸，整个牙釉质表面的溶解和软化，导致软化和微米级矿物质的流失，尤其是当用研磨剂牙膏刷牙后。膳食酸例如柠檬酸是特别有害的，不仅由于其酸性pH，而且由于其钙螯合能力，其引发进一步的牙釉质溶解。
获得性牙釉质表膜(AEP)针对对牙釉质的酸攻击，天然地提供了一些保护。AEP包含钙离子、磷酸根离子以及蛋白质和酶。表膜的形成是一个复杂的多步骤过程，其中前体蛋白例如富酪蛋白和富含脯氨酸的蛋白最初结合并为其它蛋白(粘蛋白等)提供结合位点。成熟涉及表膜蛋白质的交联和去磷酸化以及2小时后在后期牙斑菌的结合。表膜的组成高度依赖于唾液含量，其随流速、刺激、每天的不同时间、膳食等而变化。唾液流速极大地影响了唾液的pH、离子成分和缓冲能力。
侵蚀可源自数种条件-频繁暴露于膳食酸、胃酸或缺乏足够的唾液(口干症)。患有胃糜烂的患者通常通过糜烂损伤的严重性和位置(上腭表面)的评价来鉴定，而患有口干症的那些则通过目测唾液和测量唾液流速来鉴定。侵蚀和酸性饮料的摄入量增加、较低的唾液流速和由较低的唾液流速造成的较低的唾液pH /缓冲能力之间存在联系。然而，一些具有正常唾液流速且无胃酸暴露迹象的患者仍患有膳食性侵蚀损伤，即使当暴露于膳食酸被最小化时，这表明对侵蚀的易感性升高，可能与其AEP有关。存在用于鉴定该高度易感患者的亚群以正确治疗的简单和可靠的方法的需要，以及用于鉴定患者以临床研究评价口腔护理活性物质减少、减轻和控制来自膳食酸的牙本质侵蚀的方法的需要。
发明简述
出乎意料的是，已发现对膳食性牙釉质侵蚀具有高易感性的患者表现出相对于具有相似唾液流速和膳食的健康对照组，1)整个口腔唾液中显著较低的粘蛋白5B、碳酸酐酶6和/或较高的富酪蛋白水平，和2) AEP中显著较低的总蛋白、富酪蛋白和/或钙浓度。利用基于总蛋白浓度、钙分析及蛋白鉴定的唾液和表膜的诊断方法，这些因素可用于鉴定对侵蚀易感的患者。由于测试样品为唾液和唾液表膜，样品收集是容易的且存在与蛋白及矿物质含量相关的丰富信息。
因此，本发明的一些实施方案提供了用于鉴定对牙釉质侵蚀具有升高的易感性的患者的方法，其包括以下步骤的一个或两个：
(i)从患者获得整个口腔唾液的样品并检测所述唾液中粘蛋白5B水平、碳酸酐酶6水平和富酪蛋白水平中的一个或多个，其中相对于对照值，较低的粘蛋白5B、较低的碳酸酐酶和/或较高的富酪蛋白水平各自表示对牙釉质侵蚀的易感性升高；和
(ii)从患者获得获得性牙釉质表膜(AEP)的样品并测量所述AEP中总蛋白浓度、富酪蛋白浓度和钙浓度中的一个或多个，其中相对于对照值，每个这些物质的较低水平各自表示对牙釉质侵蚀的易感性升高。
在一些实施方案中，所述侵蚀的病因是膳食。
本发明应用的其它领域将在以下提供的详述中变得显而易见。应理解的是，详述和具体实施例，当表示本发明的优选实施方案时，仅旨在说明的目的，而并非旨在限制本发明的范围。
发明详述
一个或多个优选实施方案的以下描述在本质上仅为示例性的，并且不以任何方式意图限制本发明的范围、其应用或用途。
因此本发明的一些实施方案提供了用于鉴定对牙釉质侵蚀具有升高的易感性的患者的方法(方法1)，包括测量以下的一种或多种，例如以下任何2、3、4或5种，例如全部6种：
(i)在来自患者的整个口腔唾液例如未刺激的整个口腔唾液(UWMS)的样品中测量粘蛋白5B的浓度，其中相对于对照值，较低的粘蛋白5B的浓度表示对牙釉质侵蚀的易感性升高；
(ii)在来自患者的整个口腔唾液例如未刺激的整个口腔唾液(UWMS)的样品中测量碳酸酐酶6的浓度，其中相对于对照值，较低的碳酸酐酶6的浓度表示对牙釉质侵蚀的易感性升高；
(iii)在来自患者的整个口腔唾液例如未刺激的整个口腔唾液(UWMS)的样品中测量富酪蛋白的浓度，其中相对于对照值，较高的富酪蛋白的浓度表示对牙釉质侵蚀的易感性升高；
(iv)在来自患者的获得性牙釉质表膜(AEP)样品中测量总蛋白的浓度，其中相对于对照值，较低的总蛋白浓度表示对牙釉质侵蚀的易感性升高；
(v)在来自患者的获得性牙釉质表膜(AEP)样品中测量富酪蛋白的浓度，其中相对于对照值，较低的富酪蛋白的浓度表示对牙釉质侵蚀的易感性升高；和
(vi)在来自患者的获得性牙釉质表膜(AEP)样品中测量钙的浓度，其中相对于对照值，较低的钙的浓度表示对牙釉质侵蚀的易感性升高。
例如，本发明提供了
1.1 方法1，其中患者在收集样品前禁食或禁饮水至少一小时，例如至少两小时。
1.2 方法1或方法1.1，其中当患者表现出以下标准中的一项或多项时，所述患者鉴定为对牙釉质的侵蚀具有升高的易感性：
1.3 方法1.2，其中鉴定为对牙釉质的侵蚀具有升高的易感性的患者满足方法1.2中鉴别标准的至少两项。
1.4 前述方法中任一种，所述方法包括测量整个口腔唾液中的粘蛋白5B、碳酸酐酶和富酪蛋白。
1.5 前述方法中任一种，其中通过将羟基磷灰石或牙釉质块置于患者口腔中，固定在腭口托盘/夹板上，佩带0.5-2小时例如约1小时来，并在从患者的口腔移除后从块上收集AEP，来采集患者的AEP样品。
1.6 前述方法中任一种，进一步包括治疗鉴定为对牙釉质的侵蚀具有升高的易感性的患者的步骤，包括给予患者或指导患者给予有效的治疗剂或产品至钥匙，以控制牙釉质或牙本质的侵蚀，所述治疗剂或产品包括以下的一种或多种：
(a)氟处理物，选自含氟漱口水和含高浓度氟的牙膏；
(b)含磷酸钙或钙研磨剂例如焦磷酸钙、二水合磷酸二钙或碳酸钙的牙膏；(c)口腔护理产品，例如包含呈游离或盐形式的L-精氨酸的漱口水或洁齿剂；
(d)牙本质粘合剂或至暴露牙本质的区域的涂剂；
(e)包含亚锡离子源的口腔护理产品；
(f)包含钙离子的口腔护理产品。
本发明的一些实施方案进一步提供了一种用于诊断对牙釉质侵蚀的易感性升高的试剂盒，其包括用于测量以下蛋白中一种或多种的浓度的工具：粘蛋白5B、碳酸酐酶6和富酪蛋白；例如包括针对所述蛋白的抗体以及使用说明书。
本发明还提供了针对粘蛋白5B、碳酸酐酶6和富酪蛋白中一种或多种的抗体在制备用于诊断对牙釉质侵蚀的易感性升高的试剂盒中的用途。
在一些实施方案中，本发明提供了用于鉴定对牙釉质侵蚀具有升高的易感性的哺乳动物的方法，其包括：a. 从哺乳动物的口腔中获得整个口腔唾液的样品；b. 测量以下生物标志物中一种或多种的浓度：i)粘蛋白5B；ii)碳酸酐酶6；和iii)富酪蛋白；并将所述粘蛋白B的浓度、碳酸酐酶6的浓度和/或富酪蛋白的浓度与所述生物标志物各自的对照值进行比较；其中所述对照值是取自未患有牙釉质侵蚀的哺乳动物的口腔的整个口腔唾液样品中所述生物标志物的浓度；并且其中相对于粘蛋白5B的对照值，较低的粘蛋白5B浓度表示对牙釉质侵蚀的易感性升高；其中相对于碳酸酐酶6的对照值，较低的碳酸酐酶6浓度表示对牙釉质侵蚀的易感性升高；和其中相对于富酪蛋白的对照值，较高的富酪蛋白浓度表示对牙釉质侵蚀的易感性升高。在一些实施方案中，所述牙釉质侵蚀的病因是膳食。
在一些实施方案中，所述整个口腔唾液是未刺激的整个口腔唾液。在一些实施方案中，所述整个口腔唾液是经刺激的。
在一些实施方案中，当哺乳动物表现出以下标准中的一项或多项时，所述哺乳动物鉴定为对牙釉质的侵蚀具有升高的易感性：
在一些实施方案中，基于表现出以下标准中的至少两项，所述哺乳动物鉴定为对牙釉质的侵蚀具有升高的易感性：
本发明的一些实施方案中提供了以下方法，其进一步包括治疗鉴定为对牙釉质的侵蚀具有升高的易感性的哺乳动物的步骤，其中所述步骤包括给予所述哺乳动物的口腔有效量的防止或减少牙本质或牙釉质侵蚀的作用剂或产品。
在一些实施方案中，所述预防或减少牙本质或牙釉质侵蚀的作用剂或产品选自：含氟漱口水；含高浓度氟的牙膏；含磷酸钙或钙研磨剂例如焦磷酸钙、二水合磷酸二钙或碳酸钙的牙膏；包含呈游离或盐形式的L-精氨酸的口腔护理组合物；牙本质粘合剂或涂剂；包含亚锡离子源的口腔护理组合物；及其两种或更多种的组合。
一些实施方案提供了一种用于诊断哺乳动物中对牙釉质侵蚀的易感性升高的试剂盒，其包括用于测量从哺乳动物的口腔中采得的整个口腔唾液样品中粘蛋白5B、碳酸酐酶6和富酪蛋白中一种或多种的浓度的工具以及使用说明书。
在一些实施方案中，所述哺乳动物选自人、猫科动物和犬科动物。在一些实施方案中，所述哺乳动物为人。
本发明的一些实施方案提供了针对粘蛋白5B、碳酸酐酶6和富酪蛋白中一种或多种的抗体在制备用于诊断哺乳动物中对牙釉质侵蚀的易感性升高的试剂盒中的用途。
本发明的其它实施方案提供了用于鉴定对牙釉质的侵蚀具有升高的易感性的哺乳动物的方法，其包括： a. 从哺乳动物的口腔中获得获得性牙釉质表膜(AEP)的样品；b. 测量以下生物标志物中的一种或多种的浓度：i)总蛋白；ii)富酪蛋白；和iii)钙；并将总蛋白的浓度、富酪蛋白的浓度和/或钙的浓度与所述生物标志物各自的对照值进行比较；其中所述对照值是取自未患有侵蚀的哺乳动物的口腔的AEP样品中所述生物标志物的浓度；并且其中相对于总蛋白的对照值，较低的总蛋白浓度表示对牙釉质侵蚀的易感性升高；其中相对于富酪蛋白的对照值，较低的富酪蛋白浓度表示对牙釉质侵蚀的易感性升高；和其中相对于钙的对照值，较低的钙浓度表示对牙釉质侵蚀的易感性升高。
在一些实施方案中，当哺乳动物表现出以下标准中的一项或两项时，所述哺乳动物鉴定为对牙釉质的侵蚀具有升高的易感性：
一些实施方案提供了用于诊断哺乳动物中对侵蚀的易感性升高的试剂盒，其包含用于测量经1小时或更久形成的AEP样品中钙、富酪蛋白和/或总蛋白的工具。
全文使用的范围是用于描述所述范围内的各个值和每个值的简写。所述范围内的任何值可选作该范围的端点。此外，本文引用的所有参考文献通过引用以其整体结合到本文中。
当本公开内容中的定义与引用的参考文献中的定义相抵触时，以本公开内容为准。
除非另外说明，否则本文及说明书的其它处表达的所有百分比和数量应理解为表示重量百分比。给出的重量是基于物质的有效重量。
实施例
实施例1
进行临床试验以鉴定针对牙釉质侵蚀的易感性的标志物。入选标准包括(i)唾液流速>0.2ml/min未刺激的，和(ii)无胃酸糜烂损伤或唾液功能异常的迹象。
检查两组患者(各n=30)，一组没有膳食侵蚀的迹象(“对照”)而另一组有膳食侵蚀的迹象(“侵蚀”)，两组具有相似的饮食和正常的唾液流速。将羟基磷灰石或牙釉质块置于患者口腔中，固定在腭口托盘/夹板上，佩带1小时，并在从患者的口腔移除后从块上收集AEP，来采集AEP样品。AEP还从患者的切牙上采集。
唾液中的粘蛋白5B、碳酸酐酶6和富酪蛋白：将未刺激的整个口腔唾液(UWMS)通过针对MUC5b、碳酸酐酶6和富酪蛋白的免疫印迹来分析。半定量分析通过比较针对纯化的MUC5b、碳酸酐酶6和富酪蛋白标准物的抗体染色强度来进行。侵蚀患者的整个唾液的MUC5b (p<0.05)和碳酸酐酶6 (p<0.05)比对照少约25%。相反地，在同样样品中有显著更多(约两倍)的富酪蛋白(p<0.001)。
经1小时形成的AEP中原位总蛋白含量：利用BCA测定法，比较通过Sialostrip纸收集的AEP内的总蛋白量。在天然上切牙上经大于2小时形成的AEP内的总蛋白在对照患者和侵蚀患者之间无差异。相反，经1小时维持在夹板内的羟基磷灰石或牙釉质块上覆盖的AEP表现出显著性差异(分别为p<0.01和p<0.05，各组中n=18)。这表明在侵蚀组中AEP形成的速度较慢。
原位暴露1小时后AEP中的富酪蛋白：AEP内特定蛋白的分析表明在粘蛋白或碳酸酐酶6水平方面差异很小(尽管对于很多受试者检测不到蛋白)但对于富酪蛋白则有明显的减少。
原位暴露1小时后AEP中的钙：1小时羟基磷灰石盘上形成的AEP的离子分析(ICP/MS)显示出明显量的钙和磷。此外，对照组钙的水平显著高于侵蚀组。利用相同的洗脱技术，从非唾液处理的羟基磷灰石盘中极少量钙或磷被洗脱，表明钙和磷与吸附的唾液蛋白相关。
综上，唾液和牙釉质表膜样品从大组的健康受试者和侵蚀受试者中收集。人牙釉质或羟基磷灰石的运用不产生任何矛盾并在所有所用的测定中产生类似的结果。ICP/MS的运用需要进一步解析，虽然在两组间已显示出差异。轮廓测量表明表膜的保护作用和组间差异。对侵蚀升高的易感性可通过表膜形成的速度减少来计算。虽然从患者自身的牙齿(切牙)上未检测到表膜蛋白量的差异，但保持在夹板中的牙釉质和羟基磷灰石块上表膜蛋白量的差异是明显的。表膜形成的速度可取决于在唾液中表膜组分的浓度，但还可能受微生物的降解或其它离子因素的影响。
从上面的实施例，使用以下参数中的任一个或所有来开发诊断方法以鉴定对牙本质侵蚀的易感性升高的个体，例如，
。