一种基于微球的杯式时间分辨荧光降钙素原分析试剂盒及其制备方法和应用与流程

文档序号:14722524发布日期:2018-06-17 21:48阅读:来源:国知局
技术特征:

1.一种基于微球的杯式时间分辨荧光降钙素原分析试剂盒,其特征在于:该试剂盒由检测反应杯、荧光标记抗体及清洗液组成;

所述检测反应杯的固相表面包被有降钙素原单克隆抗体或多克隆抗体;

所述荧光标记抗体为时间分辨荧光微球与降钙素原单克隆抗体或多克隆抗体通过共价键交联。

2.根据权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光降钙素原分析试剂盒,其特征在于:所述时间分辨荧光微球中填充了镧系元素螯合物,其粒径为100-1000nm。

3.根据权利要求2所述的基于微球的杯式时间分辨荧光降钙素原分析试剂盒,其特征在于:所述镧系元素螯合物为铕螯合物。

4.根据权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光降钙素原分析试剂盒的制备方法,其步骤包括,

(1)、检测反应杯的制备:将降钙素原单克隆抗体或多克隆抗体稀释后37℃包被,并用封闭缓冲液封闭、拍干;置于37℃的干燥箱中烘干、密封保存;

(2)、荧光标记抗体的制备:将时间分辨荧光微球活化;然后加入降钙素原单克隆抗体或多克隆抗体混匀、封闭、清洗,并用反应缓冲液稀释,获得终浓度到40-60μg/mL的荧光标记抗体;

(3)清洗液的制备:该清洗液中含有PB,NaCl,Tween20,该清洗液的pH值为7-9。

5.根据权利要求4所述的基于微球的杯式时间分辨荧光降钙素原分析试剂盒的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中,时间分辨荧光微球活化的步骤为,在羧基时间分辨荧光微球中加入MES和EDC进行初次活化处理,加入氨基己酸室温混匀15-60min,加入MES、NHS和EDC进行再次活化处理;每1mg羧基时间分辨荧光微球对应10-100μL50mmol/L氨基己酸。

6.根据权利要求5所述的基于微球的杯式时间分辨荧光降钙素原分析试剂盒的制备方法,其特征在于:所述初次活化处理包括:每1mg羧基时间分辨荧光微球,加60μL500mmol/LpH5.0-7.0的MES,0.02-0.2mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-\t乙基碳二亚胺盐酸盐,加纯化水至终体积300μL,室温混匀15-60min;

所述再次活化处理包括:加入所述氨基己酸室温混匀后,加1mL100mmol/L的MESpH6.0,离心清洗15000rpm20min,弃去上清;加400μL的100mmol/L的MESpH6.0,超声分离,加0.02-0.2mgN-羟基琥珀酰亚胺,加0.01-0.1mgEDC,室温混匀15min;加1mL100mmol/L的MESpH5.0-7.0缓冲液,离心清洗15000rpm20min,弃去上清;100mmol/LMESpH5.0-7.0缓冲液恢复到1mL。

7.根据权利要求4所述的基于微球的杯式时间分辨荧光降钙素原分析试剂盒的制备方法,其特征在于:所述步骤(3)中的清洗液中含有5mmol/L的PB,0.9%NaCl,0.05%Tween20,该清洗液的pH值为7.8。

8.权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光降钙素原的检测方法,其步骤包括,

(A)、标准曲线的绘制:采用基于微球的杯式时间分辨荧光降钙素原分析试剂盒测定不同浓度的校准品,并根据荧光读数仪上的荧光信号值,以校准品浓度为横坐标,以荧光信号值为纵坐标,绘制成标准曲线;

(B)、将待测样品加入检测反应杯内,再加入荧光标记抗体,30℃-40℃温育,用清洗液清洗去除未结合的抗原及荧光标记抗体;

(C)在340-380nm激发光激发下,测试检测反应杯中荧光信号,检测波长为600-630nm;

(D)将所述荧光信号与步骤(A)中的标准曲线比对,获得所述待测样品的降钙素原的浓度。

9.权利要求8所述的基于微球的杯式时间分辨荧光降钙素原的检测方法,其特征在于:所述步骤(A)中,浓度为0、0.02、0.1、0.5、2、10、25、50ng/mL的校准品中加入荧光标记抗体,37℃温育5-25min,然后用清洗液清洗去除未结合的抗原及荧光标记抗体,所述校准品与荧光标记抗体的体积比为1:4-6。

10.权利要求8所述的基于微球的杯式时间分辨荧光降钙素原的检测方法,其特征在于:所述步骤(B)中,待测样品与荧光标记抗的体积比为1:4-6,温育温度为37℃。

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