本申请为分案申请，原申请的申请日是2008年12月2日、申请号是200880126567.6(PCT/US2008/085282)、发明名称为“通过质谱法检测雌酮的方法”。发明领域本发明涉及雌酮的检测。在具体的方面，本发明涉及通过质谱法检测雌酮的方法。发明背景以下简单提供本发明背景的描述以有助于理解本发明，这些描述不被承认是描述或构成本发明的现有技术。雌酮[1，3，5(10)-雌三烯-3-醇-17-酮或3-羟基-1，3，5(10)-雌三烯-17-酮]或E1是分子量为270.37道尔顿的C18甾类激素。雌酮主要从源自生殖腺或肾上腺皮质的雄烯二酮产生。雌酮(或E1)是三种自然生成的雌激素之一，另两种是雌二醇和雌三醇，它们对人体是天然的。其分子式为C18H22O2。雌激素主要负责女性青春期特征的发育和月经周期的调节。可以检测绝经期女性内的雌酮以测定其雌激素水平。还可以在可能有卵巢癌、睾丸癌或肾上腺癌的男性或女性内检测雌激素。在绝经期前的女性中，雌酮水平一般与雌二醇的水平相当。在绝经期后，雌酮水平增加，可能是由于从雄烯二酮到雌酮的转化增加。使用质谱法检测具体的雌酮离子的方法已被描述。例如，NelsonR等，ClinicalChem2004，50(2)：373-84，和XuX等，NatureProtocols2007，2(6)：1350-1355公开了使用液相层析法和质谱法检测各种雌酮离子的方法。这些方法在用质谱法检测之前，衍生化雌酮。通过液相层析/质谱法检测非衍生化雌酮的方法已在Diaz-CruzS等，JMassSpectrom2003，38：917-923和NelsonR等，ClinicalChem2004，50(2)：373-84中讨论。通过气相色谱/质谱法检测雌酮的方法公开在NachtigallL等，Menopause：JofN.Amer.MenopauseSociety2000，7(4)：243-250和DorganJ等，Steroids2002，67：151-158中。发明概述本发明提供通过质谱法包括串联质谱法检测样品中雌酮的量的方法。一方面，提供测定体液样品中雌酮的量的方法。所述方法可以包括：(a)通过液相层析法纯化体液样品中的雌酮；(b)离子化体液样品中的雌酮；和(c)通过质谱法检测雌酮离子的量并将检测到的雌酮离子的量与体液样品中雌酮的量相关联。在这方面的某些优选的实施方式中，所述方法的定量限少于或等于500pg/mL。在其它优选的实施方式中，雌酮不在质谱法前衍生化。在某些优选的实施方式中，雌酮离子选自质/荷比为269.07±0.5、145.03±0.5和143.02±0.5的离子。在一些优选的实施方式中，所述方法包括产生一种或多种雌酮先驱离子，其中至少一种先驱离子具有269.07±0.5的质/荷比。在相关的优选实施方式中，所述方法可以包括产生一种或多种雌酮先驱离子的碎片离子，其中至少一种碎片离子具有145.03±0.5或143.02±0.5的质/荷比。在一些优选的实施方式中，所述方法可以包括向体液样品中加入足够使雌酮从可能在体液样品中存在的蛋白质中游离出来的量的试剂。在相关的优选实施方式中，所述方法可以包括酸化体液样品；优选在离子化前酸化；更优选在纯化前酸化；优选用甲酸酸化。在特别优选的实施方式中，所述体液样品是血清、血浆或尿液。如本文所用，除非另作说明，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数个提及的内容。因此，例如，提及“蛋白质”包括多个蛋白质分子。如本文所用，术语“纯化(purification)”或“纯化(purifying)”并不指从样品中去掉除了关注的分析物(一种或多种)之外的所有材料。相反，纯化是指，相对于样品中可能干扰关注分析物的检测的其它组分，对一种或多种关注的分析物的量进行富集的过程。本文通过各种方法纯化样品以去除一种或多种干扰物质，例如一种或多种可能干扰用质谱法对所选雌酮母离子和子离子进行检测的物质。如本文所用，术语“测试样品”指任何可能含雌酮的样品。如本文所用，术语“体液”意思是能从个体体内分离出来的任何流体。例如，“体液”可以包括血液、血浆、血清、胆汁、唾液、尿液、眼泪、汗水等。如本文所用，术语“衍生化”意思是两个分子发生反应形成一个新分子。衍生化试剂可以包括异硫氰酸酯基团、二硝基-氟苯基基团、硝基苯氧基羰基基团和/或苯二醛基团和类似物。如本文所用，术语“层析”指这样的方法，其中被液体或气体携带的化学混合物在它们流经或通过固定液相或固相时由于化学实体的差别分布而被分成组分。如本文所用，术语“液相层析”或LC意思是，当流体均一地渗过细微物质的柱子时，或通过毛细管通道时，选择性延迟流体溶液的一种或多种组分的过程。延迟是当流体相对于固定相移动时混合物的组分在一个或多个固定相和大量流体(即，流动相)之间分配的结果。“液相层析”包括，例如，反相液相层析(RPLC)、高效液相层析(HPLC)和高湍流液相层析(HTLC)。如本文所用，术语“高效液相层析”或“HPLC”指通过在压力下强制流动相通过固定相——通常是致密填充的柱子时分离度增加的液相层析。如本文所用，术语“高湍流液相层析”或“HTLC”指层析的一种形式，它利用测定物质通过柱填充物的湍流作为进行分离的基础。HTLC已被用于在用质谱分析之前制备包含两种无名药品的样品。参见，例如，Zimmer等，J.Chromatogr.A854：23-35(1999)；还参见美国专利号5,968,367、5,919,368、5,795,469和5,772,874，其进一步解释了HTLC。本领域的普通技术人员理解“湍流”。当流体流动得缓慢而平稳时，所述流被称为“层流”。例如，低流速通过HPLC柱的流体是层流。在层流中流体粒子的运动是有序的，粒子通常是直线前进。在更快的速度下，水的惯性克服流体的摩擦力而形成湍流。不与不规则边界接触的流体比因摩擦力而减慢或因不平坦的表面而偏离的流体“流得更快(outrun)”。当流体汹涌地流动时，它以漩涡和旋转(或涡旋)的方式流动，比流体是层流时更“拖后(drag)”。很多参考文献可以用来帮助确定何时流体流动是层流或湍流(例如，TurbulentFlowAnalysis：MeasurementandPrediction，P.S.Bernard&J.M.Wallace，JohnWiley&Sons，Inc.，(2000)；AnIntroductiontoTurbulentFlow，JeanMathieu&JulianScott，CambridgeUniversityPress(2001))。如本文所用，术语“气相层析”或“GC”指这样的层析：样品混合物被气化并被注射入载气流中(氮气或氦气)，该载气流移动通过含有由液体或微粒固体组成的固定相的柱子，并根据化合物对固定相的亲合力而被分离成其组分化合物。如本文所用，术语“大颗粒柱”或“提取柱(extractioncolumn)”，指包含的平均颗粒直径大于大约35μm的层析柱。如本上下文所用，术语“大约”意思是指±10％。在优选的实施方式中，柱子含直径为大约60μm的颗粒。如本文所用的，术语“分析柱”是指这样的层析柱，其具有足够的层析塔板，以实现从柱子中洗脱的样品中物质的充分分离，足以允许确定分析物的存在或数量。这样的柱子常常区别于“提取柱”，提取柱的通常目的是从非保留的物质中分离或提取保留的物质，以得到纯化样品做进一步分析。如本上下文所用，术语“大约”意思是指±10％。在优选的实施方式中，分析柱含直径为大约4μm的颗粒。如本文所用，术语“在线(on-line)”或“线上(inline)”，例如用于“在线自动化方式”或“在线提取”中，是指在不需要操作者干预的情况进行的方法。相反，本文所用的术语“离线”是指要求操作者手动干预的方法。因此，如果样品发生沉淀，并且上清液然后被手动载入自动取样器中，则沉淀和载入步骤是与随后的步骤离线的。在所述方法的各实施方式中，可以以在线自动化方式进行一个或多个步骤。如本文所用，术语“质谱法”或“MS”是指通过其质量鉴别化合物的分析技术。MS指基于离子的质/荷比或“m/z”来过滤、检测和测量离子的方法。MS技术一般包括：(1)电离化化合物以形成带电荷的化合物；和(2)检测带电荷化合物的分子量并计算质/荷比。所述化合物可以通过任何适合的方式电离和检测。“质谱仪”一般包括电离器和离子检测器。一般来说，一个或多个关注的分子被电离，随后离子被引入质谱仪，在其中，由于磁场和电场的结合，离子遵循由质量(“m”)和电荷(“z”)决定的空间路径。参见，例如，美国专利号6,204,500，名称为“MassSpectrometryFromSurfaces”；6,107,623，名称为“MethodsandApparatusforTandemMassSpectrometry”；6,268,144，名称为“DNADiagnosticsBasedOnMassSpectrometry”；6,124,137，名称为“Surface-EnhancedPhotolabileAttachmentAndReleaseForDesorptionAndDetectionOfAnalytes”；Wright等，ProstateCancerandProstaticDiseases2：264-76(1999)；以及Merchant和Weinberger，Electrophoresis21：1164-67(2000)。如本文所用，术语“以阴离子模式操作”是指那些产生和检测阴离子的质谱方法。类似地，本文所用术语“以阳离子模式操作”是指那些产生和检测阳离子的质谱方法。如本文所用，术语“电离”或“离子化”是指产生具有等于一个或多个电子单位的净电荷的分析物离子的过程。阴离子是那些具有一个或多个电子单位的净负电荷的离子，而阳离子是那些具有一个或多个电子单位的净正电荷的离子。如本文所用，术语“电子电离”或“EI”是指这样的方法，其中气态的或蒸汽相的关注分析物与电子流相互作用。电子与分析物的碰撞产生分析物离子，然后其可用于质谱技术。如本文所用，术语“化学电离”或“CI”是指这样的方法，其中试剂气体(例如氨)经受电子碰撞，通过试剂气体离子与分析物分子的相互作用形成分析物离子。如本文所用，术语“快速原子轰击”或“FAB”是指这样的方法，其中高能原子束(通常为Xe或Ar)碰撞非挥发性样品，使样品中包含的分子解吸并电离。测试样品被溶解在粘性液体基质中，诸如甘油、硫代甘油、间硝基苄醇、18-冠-6冠醚、2-硝基苯辛醚、环丁砜、二乙醇胺和三乙醇胺。化合物或样品的合适基质的选择是根据经验的方法。如本文所用，术语“基质辅助激光解吸电离”或“MALDI”是指这样的方法，其中非挥发性样品被暴露于激光照射，其通过包括光致电离、质子化作用、去质子化作用和群集衰变(clusterdecay)在内的多种电离方式解吸并电离样品中的分析物。对于MALDI，样品与能量吸收基质混合，所述能量吸收基质促进分析物分子的解吸。如本文所用，术语“表面增强激光解吸电离”或“SELDI”是指另一种方法，其中非挥发性样品被暴露于激光照射，其通过包括光致电离、质子化作用、去质子化作用和群集衰变在内的多种电离方式解吸并电离样品中的分析物。对于SELDI，样品通常结合至优先保留一种或多种关注分析物的表面。如同在MALDI中，该方法也可以使用能量吸收材料以促进离子化。如本文所用，术语“电雾化电离”或“ESI”是指这样的方法，其中溶液沿着短长度毛细管通过，达到被施加了高的正或负电势的所述毛细管末端。达到管末端的溶液被蒸发(雾化)成溶剂蒸汽中非常小溶液滴的喷射或喷雾。这种雾滴流动通过汽化室，汽化室被轻微加热以防止冷凝并使溶剂挥发。当液滴变得更小时，电学表面电荷密度增加，直至相同电荷之间的自然排斥引起离子及中性分子被释放时。如本文所用，术语“大气压化学电离”或“APCI”是指与ESI相似的质谱法；但是，APCI通过在大气压下发生在等离子体中的离子-分子反应产生离子。等离子体通过喷射毛细管与对电极之间的放电维持。然后，离子通常通过使用一组差动泵抽的撇去器(skimmer)阶段被提取至质量分析仪。干燥并预热的N2气的反流可用于提高溶剂的去除。APCI中的气相电离可以比ESI更有效地用于分析更小极性的种类。如本文所用，术语“大气压光致电离”或“APPI”是指这种形式的质谱法，其中分子M光致电离的机理是光子吸收和电子射出以形成分子的离子M+。由于光子能量通常恰在电离电压之上，所以分子的离子解离的可能性较小。在许多情况下，可能的是在不需进行层析的情况下分析样品，从而节省了许多时间和费用。在水蒸汽或质子溶剂存在的情况下，分子的离子可吸取H以形成MH+。如果M具有高质子亲合力，这往往发生。这不影响量化精确度，原因在于M+与MH+的总数是恒定的。质子溶剂中的药物化合物通常被观察为MH+，而非极性化合物诸如萘或睾酮通常形成M+。Robb，D.B.，Covey，T.R.和Bruins，A.P.(2000)：参见例如，Robb等，Atmosphericpressurephtoionization：Anionizationmethodforliquidchromatography-massspectrometry.Anal.Chem.72(15)：3653-3659。如本文所用，术语“感应耦合等离子体”或“ICP”是指这样的方法，其中样品与部分电离的气体在足够高的温度下相互作用以使大部分元素原子化和离子化。如本文所用，术语“场解吸”是指这样的方法，其中非挥发性测试样品被置于电离表面上，并且强电场被用于产生分析物离子。如本文所用，术语“解吸”是指将分析物从表面去除和/或分析物进入气相。如本文所用，术语“定量限(limitofquantification)”、“量化限(limitofquantitation)”或“LOQ”是指测量变得在数量上有意义的点。在该LOQ的分析物响应是可以确认的、离散的以及可重复的，精密度为20％以及精确度为80％至120％。如本文所用，术语“检测限(limitofdetection)”或“LOD”是测量值大于与之相关的不确定性的点。LOD被任意地定义为零浓度的2倍标准差(SD)。如本文所用，体液样品中雌酮的“量”一般指反映大量体液中可检测的雌酮的质量的绝对值。但是，也考虑与另一雌酮量相比的相对量。例如，体液中雌酮的量可以是大于一般存在的雌酮的对比量或常规水平的量。在第二个方面，提供了通过串联质谱法测定体液样品中雌酮的量的方法，其包括：(a)用液相层析法纯化体液样品中的雌酮；(b)产生具有269.07±0.5质/荷比的雌酮的先驱离子；(c)产生所述先驱离子的一个或多个碎片离子，其中至少一个碎片离子具有143.02±0.5的质/荷比；和(d)检测在步骤(b)或步骤(c)或二者中产生的一个或多个所述离子的量，并将检测到的离子与所述体液样品中雌酮的量相关联。在一些优选的实施方式中，所述方法的定量限少于或等于500pg/mL。在其它优选的实施方式中，雌酮不在质谱法前衍生化。在某些优选的实施方式中，所述方法可以进一步包括产生雌酮先驱离子的一个或多个碎片离子，其中至少一个碎片离子具有145.03±0.5的质/荷比。在一些优选的实施方式中，所述方法可以包括向体液样品中加入足够使雌酮从可能在体液样品中存在的蛋白质中游离出来的量的试剂。在相关的优选实施方式中，所述方法可以包括酸化体液样品；优选在离子化前酸化；更优选在纯化前酸化；优选用甲酸酸化。在特别优选的实施方式中，所述体液样品是血清、血浆或尿液。在第三方面，提供了测定体液样品中雌酮量的方法，其包括：(a)用足以使雌酮从可能在体液样品中存在的蛋白质中游离出来的量的试剂酸化体液样品；(b)用液相层析法纯化体液样品中的雌酮；(c)电离体液样品中的雌酮以产生可用串联质谱法检测的一种或多种离子；和(d)通过阴离子模式下的串联质谱法检测雌酮离子的量，并将检测到的雌酮离子的量与所述体液样品中雌酮的量相关联。在一些优选的实施方式中，所述方法的定量限少于或等于500pg/mL。在其它优选的实施方式中，雌酮不在质谱法前衍生化。在某些优选的实施方式中，雌酮离子选自具有269.07±0.5、145.03±0.5和143.02±0.5的质/荷比的离子。在一些优选的实施方式中，所述方法包括产生雌酮的一个或多个先驱离子，其中至少一个先驱离子具有269.07±0.5的质/荷比。在相关的优选实施方式中，所述方法可以包括产生雌酮先驱离子的一个或多个碎片离子，其中至少一个碎片离子具有145.03±0.5或143.02±0.5的质/荷比。在一些优选的实施方式中，所述方法可以包括在离子化前酸化体液样品；更优选在纯化前酸化；优选用甲酸酸化。在特别优选的实施方式中，所述体液样品是血清、血浆或尿液。在一些优选的实施方式中，可以在质谱法前衍生化雌酮，但是，在某些优选实施方式中，样品制备排除使用衍生化。在上述方面的某些优选的实施方式中，使用HTLC和HPLC进行液相层析法，优选结合HPLC使用HTLC，但是也可使用其它方法，包括例如，蛋白质沉淀以及纯化与HPLC结合。优选实施方式利用高效液相层析(HPLC)，单独使用或与一种或多种纯化方法结合使用，例如HTLC或蛋白质沉淀，以纯化样品中的雌酮。在本文公开的方法的某些优选实施方式中，在负离子模式下操作质谱。在某些优选实施方式中，使用APCI或ESI在负离子模式下检测雌酮。在上述方面的优选实施方式中，在体液样品中存在的葡糖苷酸化的和非葡糖苷酸化的雌酮都被检测和测量。在优选实施方式中，可在质谱仪中检测的雌酮离子选自具有质/荷比(m/z)为269.07±0.5、145.03±0.5和143.02±0.5的离子；后两者是前驱离子的碎片离子。在特别优选的实施方式中，先驱离子具有269.07±0.5的质/荷比，碎片离子具有143.02±0.5的质/荷比。在优选实施方式中，可分离检测的雌酮内标被提供在样品中，它在样品中的量也被测定。在这些实施方式中，在样品中存在的内源雌酮和内标的全部或部分被离子化，以在质谱仪中产生多个可检测离子，并且通过质谱法检测一个或多个由各自产生的离子。优选的雌酮内标是2，4，16，16-d4雌酮。在优选的实施方式中，在质谱仪中可检测的雌酮内标离子选自具有273.06±0.5、147.07±0.5和145.04±0.5的质/荷比的离子。在特别优选的实施方式中，雌酮内标的先驱离子具有273.06±0.5的质/荷比；一个或多个碎片离子选自具有147.07±0.5和145.04±0.5的质/荷比的离子。在优选的实施方式中，通过与参照物如2，4，16，16-d4雌酮的比较，使雌酮离子的存在或量与测试样品中雌酮的存在或量相关联。在一个实施方式中，所述方法包括液相层析法与质谱法的组合。在优选的实施方式中，液相层析法是HPLC。优选的实施方式单独利用HPLC或与一种或多种纯化方法例如HTLC或蛋白质沉淀结合，以纯化样品中的雌酮。在另一个优选的实施方式中，质谱法是串联质谱法(MS/MS)。在本文公开方面的某些优选的实施方式中，测试样品中雌酮的量化限(LOQ)小于或等于500pg/mL；优选地小于或等于400pg/mL；优选地小于或等于300pg/mL；优选地小于或等于200pg/mL；优选地小于或等于175pg/mL；优选地小于或等于150pg/mL；优选地小于或等于125pg/mL；优选地小于或等于100pg/mL；优选地小于或等于75pg/mL；优选地小于或等于50pg/mL；优选地小于或等于25pg/mL；优选地小于或等于20pg/mL；优选地小于或等于15pg/mL；优选地小于或等于14pg/mL；优选地小于或等于13pg/mL；优选地小于或等于12pg/mL；优选地小于或等于11pg/mL；优选地10pg/mL。如本文所用，术语“约”在提及不包括离子质量测量的定量测量时，是指所指值加上或减去10％。质谱仪在测定给定分析物的质量方面可以稍微变化。术语“约”在离子质量或离子质/荷比的上下文中是指+/-0.5原子质量单位。上述的发明概述是非限制性的，并且本发明的其他特征和优势将从以下具体的本发明描述和权利要求书中显而易见。附图简述图1显示了线性-典型的校准曲线，其显示了使用LC-MS/MS分析，在连续稀释的储存样品中雌酮定量的线性。在实施例6中进行详细描述。发明详述检测和量化测试样品中雌酮的方法被描述。所述方法采用液相层析法(LC)——最优选为HTLC与HPLC结合——来进行所选分析物的最初纯化，并且将该纯化与质谱法(MS)的独特方法组合，由此提供高通过量测试系统，用于检测并量化测试样品中的雌酮。优选的实施方式特别适于大的临床实验室应用。雌酮方法被提供，其具有提高的特异性并且以比其它雌酮测试所需的更少的时间和更少的样品制备完成。在优选的实施方式中，测试样品中雌酮的检测限(LOD)小于或等于75pg/mL；优选地小于或等于50pg/mL；优选地小于或等于25pg/mL；优选地小于或等于10pg/mL；优选地小于或等于5pg/mL；优选地小于或等于4.5pg/mL；优选地小于或等于4pg/mL；优选地小于或等于3.5pg/mL；优选地小于或等于3pg/mL；优选地小于或等于2.5pg/mL；优选地2pg/mL。合适的测试样品包括可包含关注分析物的任何测试样品。例如，在制备合成雌酮期间获得的样品可以被分析以测定组成和该制备方法的产率。在一些优选的实施方式中，样品是生物学样品；即，从任何生物来源诸如动物、细胞培养物、器官培养物等获得的样品。在某些优选的实施方式中，样品从哺乳动物诸如狗、猫、马等获得。特别优选的哺乳动物是灵长类，最优选男性人类或女性人类。特别优选的样品包括血液、血浆、血清、头发、肌肉、尿液、唾液、泪液、脑脊髓液或其它组织样品。这样的样品可从例如患者——即有生命的人，男性或女性，其将自己置于临床环境中以诊断、预防或治疗疾病或病症——中得到。测试样品优选地从患者中得到，例如血清。质谱法的样品制备可用于以相对于样品中的其它组分(例如蛋白质)富集雌酮的方法包括例如过滤、离心、薄层层析(TLC)、包括毛细管电泳在内的电泳、包括免疫亲合分离在内的亲合分离、包括乙酸乙酯提取和甲醇提取在内的提取法以及离液剂的应用或上述方法的任何组合或类似方法。多种方法可用于在层析和/或MS样品分析前破坏雌酮与蛋白质之间的相互作用，以使分析可涉及样品中雌酮的总量(例如游离的雌酮和结合蛋白质的雌酮)。蛋白质沉淀是制备测试样品，特别是生物学测试样品诸如血清或血浆的一种优选的方法。这样的蛋白质纯化方法在本领域中是熟知的，例如，Polson等，JournalofChromatographyB785：263-275(2003)描述了适合用于所述方法的蛋白质沉淀技术。蛋白质沉淀可被用于从样品中去除大部分蛋白质，留下雌酮在上清液中。样品可被离心以将液态上清液与沉淀的蛋白质分开。所得上清液然后可应用于液相层析和后来的质谱法分析。在某些实施方式中，蛋白质沉淀诸如例如乙腈蛋白质沉淀的应用消除了在HPLC和质谱法之前对高湍流液相层析(HTLC)或其他在线提取的需要。因此，在这样的实施方式中，所述方法包括：(1)进行所关注样品的蛋白质沉淀；和(2)在没有使用在线提取或高湍流液相层析(HTLC)的情况下将上清液直接加样到HPLC-质谱仪上。在其他优选的实施方式中，雌酮可从该蛋白质中释放而不必沉淀蛋白质。例如，可以添加适合破坏蛋白质和雌酮之间相互作用的量的酸、盐或醇。示例性的这样的试剂包括甲酸、NaCl或乙醇。在一些优选的实施方式中，HTLC，单独地或与一种或多种纯化方法组合，可被用于在质谱法之前纯化雌酮。在这样的实施方式中，样品可采用捕获分析物的HTLC萃取柱柱体进行提取，然后在离子化之前在第二HTLC柱或分析用HPLC柱上洗脱并层析。因为包含在这些层析方法中的步骤可以自动方式连接，所以对分析物纯化期间操作者参与的需求可最小化。该特征可节约时间和费用并排除操作者失误的可能性。应当认为，湍流——诸如HTLC柱和方法提供的——可增强传质速率，改进分离特征。HTLC柱以高层析流速的方式通过含有硬颗粒的填充柱分离组分。通过应用高流速(例如3-5mL/min)，在柱中发生湍流，其引起固定相和所关注分析物(一种或多种)之间几乎完全的相互作用。使用HTLC柱的优势是，由于高分子量的种类在湍流条件下不被保留，避免了与生物流体基质相关的大分子聚集。将多个分离组合在一个步骤的HTLC方法减小了对过多样品制备的需要并且以明显更高的速度运行。这些方法还获得优于层流(HPLC)层析的分离性能。HTLC允许生物样品(血浆、尿液等)的直接注射。直接注射在传统层析形式中很难获得，原因在于变性的蛋白质和其他生物碎片迅速堵塞分离柱。HTLC也允许小于1mL的极低的样品体积，优选地小于0.5mL，优选地小于0.2mL，优选地0.1mL。在质谱法分析前应用于样品制备的HTLC的实例已在别处描述。参见例如Zimmer等，J.Chromatogr.A854：23-35(1999)；也可参见美国专利号5,968,367、5,919,368、5,795,469和5,772,874。在所述方法的某些实施方式中，样品在加样至HTLC柱前经历如上所述的蛋白质沉淀；在可选的优选实施方式中，样品可直接加样至HTLC而不经历蛋白质沉淀。优选地，HTLC与HPLC结合使用以提取并纯化雌酮而使样品不经历蛋白质沉淀。在相关优选的实施方式中，纯化步骤包括：(i)将样品应用至HTLC提取柱，(ii)在雌酮被柱保留的条件下洗涤HTLC提取柱，(iii)从HTLC提取柱上洗脱保留的雌酮，(iv)将保留的物质应用至分析柱，以及(v)从分析柱上洗脱纯化的雌酮。HTLC提取柱优选地是大颗粒柱。在多种实施方式中，所述方法的一个或多个步骤可以在线自动方式进行。例如，在一个实施方式中，步骤(i)-(v)以在线自动方式进行。在另一个实施方式中，电离和检测步骤在步骤(i)-(v)后在线进行。包括高效液相层析(HPLC)在内的液相层析(LC)依赖于相对慢的层流技术。传统的HPLC分析依赖于柱填充，其中样品穿过柱的层流是将所关注分析物从样品中分离的基础。本领域普通技术人员会理解这种柱中的分离是扩散过程。HPLC已经成功地用于生物学样品中化合物的分离；但是，在分离和随后的用质谱仪(MS)分析之前需要大量的样品制备，使得该技术是密集型劳动。此外，大部分HPLC系统没有尽其最大可能地利用质谱仪，使得仅仅一个HPLC系统连接到单一的MS仪器，导致进行大量测定需要过长的时间。已经描述了各种方法，其使用HPLC用于质谱法分析之前的样品清理(clean-up)。参见例如Taylor等，TherapeuticDrugMonitoring22：608-12(2000)；和Salm等，Clin.Therapeutics22Supl.B：B71-B85(2000)。本领域普通技术人员可以选择适合雌酮使用的HPLC仪器和柱。层析柱通常包括便于分离化学物部分(即分馏)的介质(即填充物质)。介质可包括微小颗粒。颗粒包括结合表面，其与各种化学物部分(chemicalmoieties)相互作用以促进化学物部分的分离。一个合适的结合表面是疏水性结合表面诸如烷基结合表面。烷基结合表面可包括C-4、C-8、C-12或C-18结合烷基基团，优选地是C-18结合基团。层析柱包括接收样品的入口和排出包括分馏的样品的流出物的出口。在一个实施方式中，样品(或预先纯化的样品)在入口处被施加到柱，用溶剂或溶剂混合物进行洗脱，并且在出口处排出。可选择不同的溶剂模式用于洗脱所关注的分析物(一种或多种)。例如，液相层析可采用梯度模式、等度模式或多型(即混合)模式进行。在层析期间，物质的分离受到变量诸如洗脱液(也称为“流动相”)、洗脱模式、梯度条件、温度等选择的影响。在某些实施方式中，分析物可在所关注分析物被柱填充物质可逆地保留而一种或多种其它物质没有被保留的条件下通过将样品施加到柱中进行纯化。在这些实施方式中，可应用第一流动相条件，其中所关注分析物被柱保留，并且一旦未保留的物质被洗涤穿过，随后可应用第二流动相条件以从柱中去除保留的物质。可选地，分析物可在相比一种或多种其它物质所关注分析物以不同的速度洗脱的流动相条件下，通过将样品施加到柱中进行纯化。这种方法可相对于样品的一种或多种其它组分富集一种或多种所关注分析物的量。在一个优选的实施方式中，HTLC后可在疏水柱层析系统上进行HPLC。在某些优选的实施方式中，使用的是来自CohesiveTechnologies的TurboFlow聚合物基柱(60μm粒子，50×1.0mm柱，孔)。在相关优选的实施方式中，使用的是具有疏水封端、来自PhenomenexInc的Synergi醚连接的苯基分析柱(4μm粒子，150×2.0mm柱，孔)。在某些优选的实施方式中，使用HPLC级超纯水和100％甲醇作为流动相进行HTLC和HPLC。通过仔细选择阀门和连接器管道，两个或多个层析柱可按需要连接，以使物质从一个穿过至下一个而不需任何手动步骤。在优选的实施方式中，阀门和管道的选择通过预编程序的计算机进行控制以进行必要步骤。最优选地，层析系统也以这种在线方式连接至检测器系统，例如，MS系统。因此，操作者可将一盘样品置于自动取样器中，并在计算机控制下进行剩余的操作，实现全部所选样品的纯化和分析。在某些优选的实施方式中，测试样品中存在的雌酮可在电离前被纯化。在特别优选的实施方式中，层析不是气相层析。优选地，所述方法可在质谱分析前不将雌酮进行气相层析而进行。通过质谱进行检测和量化在多种实施方式中，测试样品中存在的雌酮可通过本领域普通技术人员已知的任何方法进行电离。质谱法采用质谱仪进行，所述质谱仪包括离子源，用于电离分馏的样品并产生带电分子用于进一步分析。例如样品的电离可通过电子电离、化学电离、电雾化电离(ESI)、光子电离、大气压化学电离(APCI)、光电离、大气压光电离(APPI)、快速原子轰击(FAB)、液体二次电离(LSI)、基质辅助激光解吸电离(MALDI)、场电离、场解吸、热喷雾/等离子喷雾电离、表面增强激光解吸电离(SELDI)、感应耦合等离子体(ICP)和粒子束电离进行。本领域普通技术人员应理解电离方法的选择可根据要测量的分析物、样品类型、检测器类型、正-负模式的选择等进行确定。在优选的实施方式中，雌酮通过电雾化电离(ESI)以负模式进行电离。在相关优选的实施方式中，雌酮离子是气态并且惰性碰撞气体是氩或氮。在可选的优选实施方式中，雌酮通过大气压化学电离(APCI)以负模式进行电离。在其它优选的实施方式中，雌酮通过电雾化电离(ESI)或大气压化学电离(APCI)以正模式进行电离。271.17(先驱离子)以及159.2和133.2(碎片离子)的质量转变(masstransition)可以被用于以正模式进行检测和量化。样品已经电离后，由此产生的带正电或带负电的离子可进行分析以测定质/荷比。用于测定质/荷比的合适分析器包括四极分析器、离子阱分析器和飞行时间分析器。离子可采用几种检测模式进行检测。例如，所选离子可以进行检测，即采用选择离子监测模式(SIM)，或者可选地，离子可采用扫描模式例如多反应监测(MRM)或选择反应监测(SRM)进行检测。优选地，质/荷比采用四极分析器进行测定。例如，在“四极”或“四极离子阱”仪器中，振荡射频场中的离子经历与电极之间施加的DC电压、RF信号的振幅和质/荷比成比例的力。可以选择电压和振幅，以致于只有特定质/荷比的离子经过四极的长度，而所有其它离子是偏离的。因此，四极仪器可对注入到仪器的离子起到“质量过滤器”和“质量检测器”的作用。技术人员可通过利用“串联质谱法”或“MS/MS”提高MS技术的分辨率。在该技术中，从所关注分子中产生的先驱离子(也称为母离子)可在MS仪器中进行过滤，并且先驱离子随后成碎片以产生一种或多种碎片离子(也称为子离子或产物离子)，其然后在第二MS程序中进行分析。通过仔细选择先驱离子，仅仅由某些分析物产生的离子通过至碎裂室，其中与惰性气体原子的碰撞产生碎片离子。因为先驱离子和碎片离子都是在一组给定的电离/破裂条件下以可重复方式产生的，所以MS/MS技术可提供极其强大的分析工具。例如，过滤/破裂组合可被用于消除干扰物质，并且可特别用于复杂样品诸如生物学样品。质谱仪一般给用户提供离子扫描；即，在给定范围(例如100至1000amu)内具有特定质/荷比(m/z)的各个离子的相对丰度。分析物测试的结果，即质谱，可通过本领域已知的许多方法关联到原始样品中分析物的量。例如，假定对取样和分析参数进行仔细控制，可将给定离子的相对丰度与将该相对丰度转化成原始分子的绝对量的表进行比较。可选地，分子标准可与样品一起运行，并且基于从那些标准中产生的离子构建标准曲线。利用这种标准曲线，给定离子的相对丰度可被转化成原始分子的绝对量。在某些优选的实施方式中，内标被用于产生计算雌酮的数量的标准曲线。产生和利用这种标准曲线的方法在本领域中是熟知的，并且本领域普通技术人员能选择合适的内标。例如，雌酮的同位素可被用作内标；在某些优选的实施方式中，所述标准是d4-雌酮。将离子的量与原始分子的量关联的许多其它方法对本领域普通技术人员应是熟知的。所述方法的一个或多个步骤可采用自动仪器进行。在某些实施方式中，一个或多个纯化步骤在线进行，并且更优选地所有纯化和质谱法步骤可以在线的方式进行。在某些实施方式中，诸如MS/MS，其中先驱离子被分离以进一步破裂，碰撞活化分裂(CAD)通常被用于产生碎片离子以进一步检测。在CAD中，先驱离子通过与惰性气体碰撞获得能量，并且随后通过被称为“单分子分解”的过程产生碎片。足够的能量必须储蓄在先驱离子中以致于离子内的某些键可由于增加的振动能而断开。在特别优选的实施方式中，雌酮如下采用MS/MS进行检测和/或量化。样品经历液相层析，优选地是HTLC接着是HPLC，来自层析柱的液体溶剂流进入MS/MS分析仪的加热喷雾器界面，并且溶剂/分析物混合物在界面的加热管中被转化为蒸汽。包含在雾状溶剂中的分析物(例如雌酮)被界面的电晕放电针电离，其将大的电压施加到雾状溶剂/分析物混合物。离子例如先驱离子穿过仪器的孔并且进入第一个四极。四极1和3(Q1和Q3)是质量过滤器，允许根据它们的质/荷比(m/z)选择离子(即“先驱”离子和“碎片”离子)。四极2(Q2)为碰撞单元，其中离子被破裂。质谱仪的第一个四极(Q1)选择具有特定质/荷比的雌酮先驱离子。具有正确质/荷比的雌酮先驱离子被允许穿到碰撞室(Q2)中，而具有任何其它质/荷比的多余离子与四极的侧面碰撞并且被除去。进入Q2的先驱离子与中性氩气分子碰撞并成为碎片。该过程被称为碰撞活化分裂(CAD)。所产生的碎片离子穿过到四极3(Q3)，其中雌酮的碎片离子被选择而其它离子被除去。所述方法可包括在正离子模式或负离子模式下进行的MS/MS。采用本领域熟知的标准方法，本领域普通技术人员能鉴定可用于在四极3(Q3)中选择的雌酮的特定先驱离子的一种或多种碎片离子。如果雌酮的先驱离子包括醇或胺基团，通常形成分别代表先驱离子的脱水或去氨基的碎片离子。在包括醇基团的先驱离子的情况下，通过脱水形成的这些碎片离子通过从先驱离子中失去一个或多个水分子而形成(即，其中先驱离子与碎片离子之间的质/荷比差对于失去一个水分子来说是大约18，或者对于失去两个水分子来说大约36等)。在包括胺基团的先驱离子的情况下，通过去氨基形成的这些碎片离子通过失去一个或多个氨分子而形成(即，其中先驱离子与碎片离子之间的质/荷比差对于失去一个氨分子来说是大约17，或者对于失去两个氨分子来说大约34等)。同样，包括一个或多个醇和氨基团的先驱离子常常形成代表失去一个或多个水分子和/或一个或多个氨分子的碎片离子(即其中先驱离子与碎片离子之间的质/荷比差对于失去一个水分子和失去一个氨分子来说是大约35)。一般地，代表先驱离子的脱水或去氨基的碎片离子不是对特定分析物的特定碎片离子。因此，在本发明优选的实施方式中，进行MS/MS以检测到雌酮的至少一种碎片离子，其不只表现为从先驱离子中失去一个或多个水分子和/或失去一个或多个氨分子。随着离子与检测器碰撞，它们产生转化成数字信号的电子脉冲。所获得的数据被传递到计算机，其将所收集的离子数对时间作图。所得到的质量层析图类似于在传统HPLC方法中产生的层析图。测量对应于特定离子的峰下面的面积或这些峰的振幅，并且该面积或振幅被关联到所关注分析物(雌酮)的量。在某些实施方式中，对碎片离子(一种或多种)和/或先驱离子的曲线下面积或峰的振幅进行测量以测定雌酮的量。如上所述，给定离子的相对丰度可采用基于内标分子诸如d4-雌酮的一种或多种离子的峰的校准标准曲线转化成原始分析物例如雌酮的绝对量。下列实施例用于阐明本发明。这些实施例绝非意欲限制所述方法的范围。实施例实施例1：样品和试剂制备血液收集在不含添加剂的Vacutainer中并使其在室温18℃至25℃凝结30分钟。显示明显溶血、脂血和/或黄疸的样品被排除。制备甲醇中的1mg/mL雌酮储存标准并进一步在甲醇中稀释以制备1,000,000pg/mL的雌酮中间储存标准，其用于制备两种10,000pg/mL的雌酮工作标准，对于标准A稀释在甲醇中或对于标准B稀释在去除的血清中(strippedserum)。氘化的甲醇(甲基-d1醇；Fisher目录号AC29913-1000或等同物)用于制备1mg/mLd4-雌酮储存标准(2，4，16，16-d4雌酮)，其用于制备氘化的甲醇中的1,000,000pg/mL中间储存标准。d4-雌酮中间储存标准用于制备DI水中的5000pg/mL工作d4-雌酮内标：1mL的d4-雌酮中间储存标准在200mL容量瓶中用DI水稀释至体积。20％甲酸溶液通过将50mL的甲酸(～98％纯Aldrich目录号06440或等同物)添加至250mL容量瓶制备，其用超纯HPLC级水稀释至体积。用于各次运行的所有校准/标准从10,000pg/mL雌酮标准的冷冻等分试样在去除的血清中连续稀释每周新鲜制备。制备的标准从最高浓度至最低浓度，各个标准最终总体积为10mL。实施例2：使用液相层析从血清中提取雌酮通过吸取200μL的标准、对照或患者样品至96孔板，制备液相层析(LC)样品。此外，300μL的20％甲酸被递送至各个孔至～11％(V/V)的终浓度。最后，50μL的5000pg/mLd4-雌酮标准被添加至各个孔。在LC前样品在室温被温育30分钟。液相层析用CohesiveTechnologiesAriaTX-4HTLC系统，使用AriaOSV1.5或更新的软件进行。自动取样器洗涤溶液使用60％乙腈、30％异丙醇和10％丙酮(v/v)制备。HTLC系统自动注射如上制备的75μL样品至用大颗粒填充的TurboFlow柱(来自CohesiveTechnologies的50×1.0mm，60μmCycloneP提取柱)。样品以高流速加样(5mL/min，加样试剂100％DI水)以在提取柱内部产生湍流。该湍流确保雌酮与柱中大颗粒的最优化结合，以及残留蛋白质和碎片通过以废弃。加样后，流动方向被倒转，样品用回路(loop)中200μL的90％甲醇洗脱至分析柱(Phenomenex分析柱，Synergi150×2.0mm，4μm柱)。二元HPLC梯度被应用至分析柱以将雌酮从样品中含有的其他分析物分离。流动相A是超纯水(HPLC级)以及移动相B是100％甲醇。HPLC梯度起始于10％有机梯度，其在大约3.35分钟内斜线上升至75％然后以5％至10％的增量增加直至99％。总梯度时间为6.58分钟。然后，分离的样品进行MS/MS以量化雌酮。为了测定其他分子的干扰，空白血清被注入1000pg/mL下列类固醇：17-β雌二醇、雌三醇、睾酮、17-α羟基孕酮、孕酮、雄烯二酮、醛固酮、11-脱氧皮质醇、皮质酮和二羟基睾酮。样品进行LC。从这些类固醇没有观察到干扰；没有一种类固醇与雌酮共洗脱。实施例3：MS/MS对雌酮的检测和量化MS/MS使用FinniganTSQQuantumUltraMS/MS系统(ThermoElectronCorporation)进行。下列均来自ThermoElectron的软件程序用于本文所述的实施例中：TuneMasterV1.2或更新的软件、ExcaliburV2.0SR1或更新的软件、TSQQuantum1.4或更新的软件、LCQuanV2.5SUR1或更新的软件以及XReport1.0或更新的软件。流出分析HPLC柱的液体溶剂/分析物流至ThermoFinniganMS/MS分析仪的加热的雾化器界面。溶剂/分析物混合物在界面的加热管中被转化为蒸汽。雾化溶剂中的分析物通过界面的电晕放电针电离，该电晕放电针将电压施加到雾化溶剂/分析物混合物。离子穿过至第一个四极(Q1)，其选择具有质/荷比为269.07±0.5m/z的离子。进入四极2(Q2)的离子与氩气碰撞以产生离子碎片，其穿过至四极3(Q3)用于进一步选择。同时，使用同位素稀释质谱法的相同方法用内标——4-氘化雌酮分子——进行。下列质量转变用于在负极性确认过程中检测并量化。表1雌酮质量转变(负极性)分析物先驱离子(m/z)产物离子(m/z)雌酮269.07143.02&145.032，4，16，16-d4雌酮273.06145.04&147.07下列质量转变用于在正极性确认过程中检测并量化。表2雌酮质量转变(正极性)分析物先驱离子(m/z)产物离子(m/z)雌酮271.17159.20&133.202，4，16，16-d4雌酮275.12159.10实施例4：测试内和测试间的精密度和精确度三个质量控制(QC)混合样(pool)由炭去除的血清制备，所述血清被注入雌酮至25、200和800pg/mL的浓度。来自三个QC混合样每一个的十个等分试样在单个测试中分析以测定在一个测试内样品的重复性(CV)。测得下列值：表3测试内变化和精确度来自三个QC混合样每一个的十个等分试样测试五天以测定测试之间的重复性(RSD％)。测得下列值：表4测试间变化和精确度实施例5：分析灵敏度：检测限(LOD)和量化限(LOQ)雌酮零标准以10个重复运行以测定测试的检测限，其是测量值大于与之相关的不确定值的点。LOD被任意地定义为零浓度的2倍标准差(SD)。对产生的零标准的峰面积比进行统计学分析，其平均值为0.014和SD为0.004。雌酮测试的LOD为2.0pg/mL。为了测定具有精密度为20％和精确度为80％至120％的量化限，测试浓度接近于所期望LOQ的五个不同样品并且对各个测定重复性。雌酮测试的LOQ被确定为10.0pg/mL。实施例6：测试报告的范围和线性为了建立测试中雌酮检测的线性，制备被设定为零标准的一个空白以及10个掺料的血清标准并在不同的5天分析。五个连续运行的二次回归产生0.995或更大的相关系数，具有±20％的精确度，其显示10至2000pg/mL的可定量的线性范围。实施例7：基质特异性基质特异性使用水、去除的血清和Biocell常规人类血清评估，以测定患者样品是否能够以线性方式被稀释。中间对照(MC)和高对照(HC)被稀释2倍和4倍。在校准运行后，样品重复运行。精确度如下：表5基质特异性精确度本文提到或引用的文章、专利和专利申请以及所有其它文件和电子可得到的信息的内容以其全部内容通过引用并入本文至这样的程度，如同每一单独的出版物被具体且单独地表明通过引用并入。申请人保留将任何和所有的来自任何这些文章、专利、专利申请或其它物理和电子文件的物质和信息物理上并入本申请的权利。本文例证性描述的方法可在本文没有具体公开的任何元素或多个元素、限制或多个限制不存在的情况下合适地实施。因此，例如术语“包括(comprising)”、“包括(including)”、“包含(containing)”等应当广义且非限制性地理解。此外，本文所用的术语和表达已经作为描述性术语而不是限制性术语使用，并且没有意图使用这种将所示和所述特征的等价形式或其部分排除的术语和表达。应当认识到在所请求保护的发明范围内各种改变是可能的。因此，应当理解，尽管本发明通过优选的实施方式和任选特征具体地公开，但是本领域普通技术人员可采取本文公开的其中具体实施的本发明的改变和变化，并且这种改变和变化被认为在本发明的范围内。本发明在本文中已经作了广泛且一般性的描述。落入上位公开内容中的每一个较窄类别和亚组也构成所述方法的部分。这包括本方法的一般描述，条件是或者否定性的限制是从种类中去除了任何主题内容，无论排除的物质是否在本文中具体描述。其它实施方式在所附权利要求之内。此外，在所述方法的特征或方面按照马库什组进行描述的情况下，本领域普通技术人员应认识到本发明也因此按照马库什组的任何单个成员或成员的亚组进行描述。